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문제 정의
- 본 연구는 양파(Allium cepa var. cepa) 추출물에서 GST의 활성을 저해하는 물질을 확인한 후에 분리를 함으로써 향후 이들 GST 저해제의 구조를 규명하고, 이를 치료 전략에 활용할 수 있는 유용한 자료를 제공하려고 한다.
제안 방법
- 0) 용액을 100 ㎖ 정도 흘려준 뒤, OD280을 측정하여 더 이상의 불순물을 포함하지 않음을 확인하였다. 10 mM GSH를 포함하고 있는 50 mM Tris-Cl(pH 8.0)을 이용해 크로마토그래피에 붙어있던 효소를 1 ㎖/min의 속도로 용출하였고, 얻어진 분획은 GST의 기질인 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB)와 글루타티온(GSH)으로 GST 활성 및 OD280을 측정하여 높은 흡광도와 활성을 보이는 분획만 모아 20 mM potassium phosphate(pH 7.0)로 8시간씩 3번 투석하였다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 모든 실험은 효소의 변성을 고려해 4℃에서 진행하였다.
- 400 g의 건조된 양파를 상온에서 70% 에탄올로 침적시켜 추출하였고, 감압하에 농축하여 얻은 젤리상의 추출물 15.0 g을 100 ㎖ 메탄올에 용해시켜 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 chromatogram 분리를 확인하였다. 또한, 젤리상의 추출물 15.
- 단위로 분취하였고, 각각의 분취들은 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 전개한 후 365 nm에서 chromatogram 분리를 확인하였다. Chromatogram 분리가 같은 분획들은 모아서 rotary evaporator에서 감압 농축한 후 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 A). 분리되는 chromatogram의 변화가 나타나면 용매를 메탄올로 바꾸어서 용출을 하였고, 위와 같은 방법으로 분리되는 chromatogram을 TLC(전개 용매: ethyl acetate:methanol = 8:2)에서확인하였으며, 농축한 다음에 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 B).
- 적정된 용액은 rotary evaporator에서 감압 하에 농축하였고, 최소량의 메탄올에 용해시켜 GST 활성저해 실험 및 silica-gel column chromatography에 사용하였다. Ethyl acetate, 메탄올 및 50% 메탄올이 silica-gel column chromatography의 용출액으로 사용하였고, 각각의 분획분은 감압-농축한 다음에 GST 효소 활성 저해 실험을 하였다. Silica-gel column chromatography에서 용출 용액을 달리하면서 GST 활성저해제를 분리한 과정은 다음과 같다.
- 1 N NaOH로 적정한 다음 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서의 분리는 적정 전보다 chromatogram의 이동 및 분리가 뛰어난 것으로 나타났고, GST 활성 저해에도 유의성이 있는 것으로 나타났다. Silica-gel column chromatography에서 0.1 N NaOH 적정용액의 분리는 ethyl acetate(분획 A), methanol(분획 B), 50% methanol (분획 C)로 용출하였고, 용출된 각 분획은 감압하에 농축하여 GST 활성 저해 실험을 하였다. 세 부분 모두 GST 활성 저해에 유의성이 있는 것으로 나타났다.
- 9가 되도록한 후에 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 chromatogram 분리를 확인하여 적정 전과 후를 비교하였다. TLC상에서 적정 후의 시료가 spot 이동과 chromatogram 분리가 적정 전보다 더 좋게 나타나서, 이를 rotary evaporator에서 감압하에 농축한 다음 100 ㎖ 메탄올에 다시 용해시켜 silica-gel column chromatography에서 분리를 시도하였다. 적정한 시료의 glutathione S- transferase에 대한 활성 저해 실험을 한 결과는 Fig.
- 먼저 pET-OsGSTF3/BL21(DE3)를 대량 발현하기 위해 30 ㎍/㎖의 kanamycin이 포함된 1ℓ LB 배지에 2~3시간 동안 37℃에서 배양하였다. UV로 OD600(optical density) 값을 측정하여 0.3~0.4에 이르면, 발현유도제인 IPTG를 최종 농도가 0.4 mM 되도록 첨가한 뒤, 각 효소의 최대 효율을 나타내는 시간까지 배양하여 대량 발현을 유도하였다. 대량 발현된 배양액은 냉동원심분리기를 이용하여 4℃, 10,000 g, 10분간 집균한 뒤 －20℃에서 냉동 보관하였다.
- 균체를 분쇄하기 위한 초음파 파쇄기(sonicator)는 Sonics & Materials사의 VCX 400(Danbury, USA)를 사용하였고, Vortex Mixer는 Thermolyne(Iowa, USA)사의 Type 37600 Mixer를 이용하였다. pH meter기는 Istek(Seoul, Korea)의 p25를 사용하였고, 기질과의 특성조사를 위해서 Hitachi사(Tokyo, Japan) U-2000 UV/VIS Spectrophotometer를 사용하였다.
- 분획은 50 ㎖/frac. 단위로 분취하였고, 각각의 분취들은 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 전개한 후 365 nm에서 chromatogram 분리를 확인하였다. Chromatogram 분리가 같은 분획들은 모아서 rotary evaporator에서 감압 농축한 후 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 A).
- 0 g을 100 ㎖ 메탄올에 용해시켜 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 chromatogram 분리를 확인하였다. 또한, 젤리상의 추출물 15.0 g을 100 ㎖ 증류수에 용해시킨 용액의 pH는 5.34로 나타났고, 이를 0.1 N NaOH로 적정하여 pH가 7.9가 되도록한 후에 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서 chromatogram 분리를 확인하여 적정 전과 후를 비교하였다. TLC상에서 적정 후의 시료가 spot 이동과 chromatogram 분리가 적정 전보다 더 좋게 나타나서, 이를 rotary evaporator에서 감압하에 농축한 다음 100 ㎖ 메탄올에 다시 용해시켜 silica-gel column chromatography에서 분리를 시도하였다.
- 분리되는 chromatogram의 변화가 나타나면 용매를 메탄올로 바꾸어서 용출을 하였고, 위와 같은 방법으로 분리되는 chromatogram을 TLC(전개 용매: ethyl acetate:methanol = 8:2)에서확인하였으며, 농축한 다음에 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 B). 마지막으로 50% 메탄올로 용출하였고, chromatogram 분리는 TLC(전개용매: ethyl acetate:methano = 1:9)에서확인하였으며, 농축한 후에 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 C).
- Chromatogram 분리가 같은 분획들은 모아서 rotary evaporator에서 감압 농축한 후 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 A). 분리되는 chromatogram의 변화가 나타나면 용매를 메탄올로 바꾸어서 용출을 하였고, 위와 같은 방법으로 분리되는 chromatogram을 TLC(전개 용매: ethyl acetate:methanol = 8:2)에서확인하였으며, 농축한 다음에 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 B). 마지막으로 50% 메탄올로 용출하였고, chromatogram 분리는 TLC(전개용매: ethyl acetate:methano = 1:9)에서확인하였으며, 농축한 후에 GST 활성저해 실험을 하였다(분획 C).
- 9가 되도록 하였다. 적정된 용액은 rotary evaporator에서 감압 하에 농축하였고, 최소량의 메탄올에 용해시켜 GST 활성저해 실험 및 silica-gel column chromatography에 사용하였다. Ethyl acetate, 메탄올 및 50% 메탄올이 silica-gel column chromatography의 용출액으로 사용하였고, 각각의 분획분은 감압-농축한 다음에 GST 효소 활성 저해 실험을 하였다.
- 0)로 8시간씩 3번 투석하였다. 정제된 효소의 순수도는 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 모든 실험은 효소의 변성을 고려해 4℃에서 진행하였다.
- 추출 시료와 silica-gel column chromatography 분획의 동결건조는 냉동 건조기(Martin Christ Alpha type, Germany)를 사용하였고, 조직 파쇄기(Utra-Turrax T25, Germany), 초음파 파쇄기(Sonics and Materials VC-375, USA), 전기 영동기(Mighty Small SE250, Hoefer, USA)와 ELISA reader(Spectra Max 340, USA), incubator(Boekel incubator shaker II, Model 136400) 및 UV/Visible Spectrometer(Varian Cary 3E, Australia)를 이용하였다. PCR은 Thermo(Waltham, USA)사의 PCR Sprint를 이용하였고, DNA용 전기영동 장치는 Cosmo Bio co.
- 포합 반응에 대한 초기 속도 측정에는 1,2-dichloro-4-nitrobenzene(DCNB)를 사용하였다. 측정 방법은 적정 용매와 기질, 글루타티온(GSH) 효소를 혼합한 뒤, 340 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용해서 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성 단위는 1분당 1 μmol의 생성물 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다.
대상 데이터
- (Tokyo, Japan) 제품을, sodium chloride는 Duksan Pure Chemical Co.(Gyeonggi, Korea) 제품을, potassium chloride는 Daejung(Incheon, Korea) 제품을 사용하였다. 그 외 buffer 를 만들기 위해 사용된 시약들은 일급 및 특급 시약을 사용하였다.
- 균을 다루기 위한 무균 작업대는 비전 Bio tech.(Inchon, Korea)사의 Clean bench를 이용하였다. 균 배양을 위해 Vision Scientific(Gyeonggi, Korea)사의 Shaking incubator를 이용하였고, 균체를 집균하기 위한 원심분리기는 한일사의 HMVC-250 Ⅳ와 Micro-17R(Seoul, Korea)을 이용하였다.
- , Ltd.(Tokyo, Japan)의 Mupid-21을 사용하였다. 균을 다루기 위한 무균 작업대는 비전 Bio tech.
- Zeta 타입을 제외한 모든 타입의 GST에 공통적인 기질인 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(CDNB)를 포함하여 모두 6가지의 기질을 사용하였다. 포합 반응에 대한 초기 속도 측정에는 1,2-dichloro-4-nitrobenzene(DCNB)를 사용하였다.
- (Inchon, Korea)사의 Clean bench를 이용하였다. 균 배양을 위해 Vision Scientific(Gyeonggi, Korea)사의 Shaking incubator를 이용하였고, 균체를 집균하기 위한 원심분리기는 한일사의 HMVC-250 Ⅳ와 Micro-17R(Seoul, Korea)을 이용하였다. 균체를 분쇄하기 위한 초음파 파쇄기(sonicator)는 Sonics & Materials사의 VCX 400(Danbury, USA)를 사용하였고, Vortex Mixer는 Thermolyne(Iowa, USA)사의 Type 37600 Mixer를 이용하였다.
- 본 연구에 사용한 양파는 국내 양산에서 생산된 것을 재래시장에서 구입하여 껍질부분을 제거한 후에 건조하기 쉽게 잘라서 음지에서 건조하여 추출하는데 사용하였다.
이론/모형
- Human glutathione S-transferase의 발현 및 정제는 Bae IW(2005)에 의한 pET-OsGSTF3/BL21(DE3) 대량 발현 방법을 사용하였다. 먼저 pET-OsGSTF3/BL21(DE3)를 대량 발현하기 위해 30 ㎍/㎖의 kanamycin이 포함된 1ℓ LB 배지에 2~3시간 동안 37℃에서 배양하였다.
- Rice glutathione S-transferase의 단백질 정량은 Bradford 방법에 따라 측정하였으며, 595 nm에서 bovine serum albumin을 표준단백질로 사용하여 표준 곡선을 작성한 뒤, 단백질 농도를 측정하는데 이용하였다. Bio-Rad사의 단백질 정량 시약과 정제된 OsGSTF3를 상온에서 10 분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하였다.
- 그리고 효소의 최적 pH와 최적 온도는 각각 9.0과 55℃인 것으로 나타났고(Cho & Kong 2005), GST 효소 활성 저해와 관련한 실험 조건은 Cho HY(2007)가 밝힌 기질 농도의 영향, pH 영향, 온도의 영향 등을 참조하였다.
성능/효과
- 05)을 확인하였다. 그리고 0.1 N NaOH로 적정한 시료를 감압하에 농축한 후에 이를 다시 용해시키는 용매로 사용한 메탄올의 Glutathione S-transferase에 대한 활성 저해 실험은 Fig. 1에서 나타내었고, GST의 활성 저해에 유의성이 없음을 확인하였다.
- 34인 약산성으로 나타났다. 그리고 이 용액을 0.1 N NaOH로 적정한 다음 TLC(전개용매: ethyl acetate)에서의 분리는 적정 전보다 chromatogram의 이동 및 분리가 뛰어난 것으로 나타났고, GST 활성 저해에도 유의성이 있는 것으로 나타났다. Silica-gel column chromatography에서 0.
- 또한 Fahl 등(1993)은 배양시킨 mammalian cell에서 GST 분자종들을 발현시켰더니 항암제인 chlorambutil, melphalan, cisplatin에 의한 내성이 크게 강화되었다고 보고하였다. 이러한 결과들은 mammalian cell에서 특정 GST 분자종들의 과다한 발현은 암 화학요법에서 사용되고 있는 alkyating agents에 의한 생물학적 내성을 유발시킬 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 특정 GST 저해는 항암제, 특히 알킬화제의 효율을 높이는 방안으로 기대할 수 있다.
- 이 때 크로마토그래피에 수율을 높이기 위해 흡착시킨 후의 여액을 수집하여 2~3번 흘려주었다. 컬럼 내의 불필요한 단백질을 제거하기 위해 50 mM potassium chloride를 포함하고 있는 20 mM potassium phosphate(pH 7.0) 용액을 100 ㎖ 정도 흘려준 뒤, OD280을 측정하여 더 이상의 불순물을 포함하지 않음을 확인하였다. 10 mM GSH를 포함하고 있는 50 mM Tris-Cl(pH 8.
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