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문제 정의
- 본 연구에서는 사상의학에서 浮腫과 虛勞에 사용할 수 있는 대표적인 소양인의 약물인 荊防地黃湯의 CRF에 대한 효과를 5/6 NTX로 유발된 CRF Rat를 이용하여 평가하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 실험결과는 대표적인 항산화 제로 5/6 NTX로 유발된 CRF에 유효한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 α-tocoperol12투여군과 비교하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 원인은 脾局의 陽熱之氣의 過亢으로 인하여 降陰이 안될 경우와 脾腎局의 陰氣 부족으로 降陰이 안될 경우로 나눌 수 있다4-6. 이번 연구에서는 CRF를 한의학적으로 浮腫, 虛勞의 範疇로 보고 소양인에서 浮腫, 虛勞를 치료하는 대표적인 처방인 荊防地黃湯의 CRF에 대한 효과를 알아보고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 사상의학에서 浮腫, 虛勞 등의 CRF와 유사한 병증에 사용된 荊防地黃湯의 CRF에 대한 효과를 5/6 NTX로 유발된 CRF 랫트를 이용하여 평가하고자 하였다. 실험결과는 대표적인 항산화 제로 5/6 NTX로 유발된 CRF에 유효한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 α-tocoperol12투여군과 비교하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 4. 항산화 효과: 신장 내 GSH, SOD 및 CAT 함량 또는 활성을 측정하였고, 지질과산화에 미치는 영향을 관찰하기 위해, MDA 함량을 각각 측정하여 평가하여 荊防地黃湯이 우수한 항산화 효과를 나타내었다.
- SOD 1 unit는 1분 동안 NBT의 환원을 50% 억제하는 농도로 정의하여, U/㎎ protein 단위로 측정하였고, CAT의 존재 하에서 과산화수소(H2O2)의 분해를 240 nm에서 흡광도를 측정하여, CAT의 활성을 측정하였다. CAT 활성을 pH 7.8, 온도 25℃하에서 1 nM의 과산화수소를 분당 분해하는데 필요한 효소의 양으로 정의하고, U/㎎ protein 단위로 평가하였다.
- CRF를 유발하기 위하여, 우상복부를 척추와 평행하게 절개하여 우측 신장을 노출시킨 후, 신장의 피막을 제거하고, 신동맥, 신정맥, 우측 요관을 봉합사로 묶은 다음 우측 신장을 절제하였다(Fist NTX). 우측 신장 절제 1주일 후, 전신마취 하에서 Rat의 좌상복부를 동일한 방법으로 절개하여 좌측 신장을 노출시킨 다음, 신장의 피막을 제거하고, 좌측 신동맥, 신정맥, 요관 및 신우를 보전하면서 신장의 양극에서 3-0 silk 봉합사를 이용하여 결찰한 후, 좌측 신장의 2/3를 선택적으로 절제하였다(Second 2/3 partial NTX).
- HB은 각각 멸균 증류수에 용해시켜 동물 체중 ㎏ 당 5 ㎖의 용량으로 NTX 수술 완료 4주후부터 매일 1회씩 35일간 강제 경구투여 하였으며, 액상인 α-tocoperol은 멸균 증류수에 희석하여 동일한 용량으로 경구투여 하였다.
- 8)에 신장 조직을 homogenize 하여 반응시키고, 4°C 조건하에서 10분간 3,600 rpm으로 원심 분리한 15분 후 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. SOD 1 unit는 1분 동안 NBT의 환원을 50% 억제하는 농도로 정의하여, U/㎎ protein 단위로 측정하였고, CAT의 존재 하에서 과산화수소(H2O2)의 분해를 240 nm에서 흡광도를 측정하여, CAT의 활성을 측정하였다. CAT 활성을 pH 7.
- SOD 활성은 100 nM EDTA(Sigma, MO, USA) 및 13 ㎜ l-methionine(Sigma, MO, USA), 750 μM nitroblue tetrazolium chloride(NBT Sigma, MO, USA) 및 2 μM riboflavin (Sigma, MO, USA)이 포함된 50 ㎜ potassium phosphate buffer(pH 7.8)에 신장 조직을 homogenize 하여 반응시키고, 4°C 조건하에서 10분간 3,600 rpm으로 원심 분리한 15분 후 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
- 본 실험에 사용된 약재는 약업사(제천한방약초, 제천, Korea)에서 매입한 것을 현미경하에서 관능검사를 통하여 선정하여 사용 하였으며, 본 실험에 사용된 荊防地黃湯는 동의수세보원에 근거하여 각 1첩 분량의 조성은 Table 1과 같다. 각각 선정된 2첩 분량의 약제를 취하여 정제수 2L로, 80℃에서 9시간 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 감압농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결 건조시켜, 각각 수율 23.40%의 HB 추출물을 얻어 실험에 사용하였다. 추출한 동결 건조물은 -20℃의 냉장고에 보관 후 실험에 사용하였으며, 본 실험에서 사용한 용매인 증류수에 40 ㎎/㎖의 농도까지 갈색 또는 연갈색의 용액으로 비교적 잘 용해되었다.
- 이후 자동혈액분석장치(Toshiba 200 FR, Japan)를 이용하여 혈중 BUN 및 creatinine 함량을 각각 ㎎/㎗ 단위로 측정하였으며, 최종 희생일에 복대정맥에서 5 ㎖의 혈액을 채취하여, 혈청을 분리한 다음 자동혈액분석 장치를 이용하여 혈중 BUN, creatinine, TG(triglyceride), TC(total cholesterol), LDL(low density lipoprotein) 및 HDL(high density lipoprotein) 함량을 각각 ㎎/㎗ 단위로 측정하였다. 또한 HDL의 변화량을 좀 더 명확히 하기 위하여 HDL/LDL의 비율을 각각 산출하였다.
- 또한 sham 및 CRF 대조군에서는 HB 또는 α-tocoperol 대신 각각 동일한 용량의 멸균증류수만 동일한 기간 동안 경구투여 하였다.
- 또한 항산화 정도를 판단하기 위해 microplate reader에 적응시킨 enzymatic recycling procedure를 이용하여 GSH (μM)/g protein 단위로 측정하였다.
- 본 연구에서는 HB을 각각 NTX 4주 후부터 매일 200㎎/㎏의 농도로 35일간 경구투여하고, 신장보호 효과는 신장 중량의 변화, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 변화, 사구체내 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 변화를 기초로 평가하였으며, 관련 면역억제에 미치는 영향은 비장 및 악하 임파절 중량의 변화, 비장내 TNF-α, IL-1β및 IL-10의 변화, 가슴샘, 비장 및 악하임파절의 조직학적 변화를 기준으로 평가하였고, 체중, 부고환 주위 지방 중량의 변화, 혈중 TG, TC, LDL 및 HDL 함량의 변화를 관찰하여 CRF 관련 악액질에 대한 효과를 평가하였다. 또한 항산화 효과를 관찰하기 위하여, 신장 내 GSH의 함량 및 SOD, CAT 활성을, 지질과산화에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, MDA 함량을 각각 측정하였다. 실험 결과는 5/6 NTX 로 유발된 CRF에 유효한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 항산화제인 α-tocoperol12 투여군과 비교하였다.
- 3 ㎎/㎗) 함량이 일정한 대략 반수의 실험동물만 선정하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 NTX 수술일, 투여시작일 및 최종 부검일에 각각 18시간 절식을 실시하였다(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다).
- 모든 실험동물의 체중을 first 및 second NTX 수술일, 약물 투여 시작일, 약물 투여 7, 14, 21 28 및 35일후에 각각 측정하였으며, 사료섭취에 따른 체중 변화를 최소화하기 위해 streptozotocin 투여일, 투여시작일 및 최종 희생일에 모든 실험동물은 18시간 정도 절식시켰고, 실험 시작시의 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 CRF 유발기간인 4주간의 체중변화와 약물 투여 후 5주간의 체중 변화량인 증체량(body weight gains)을 각각 측정하였다.
- 발색 이후 Mayer's Hematoxylin으로 대조염색을 실시하고, 광학현미경하에서 관찰하였다.
- 본 실험에서 10% 이상의 발색반응을 나타내는 세포를 양성 면역반응세포로 간주하고, 단위면적(㎟)당 사구체내 caspase-3 및 PARP 양성 면역반응 세포의 수를 각각 자동영상분석장치를 이용하여 산출하였다
- 본 연구에서는 HB을 각각 NTX 4주 후부터 매일 200㎎/㎏의 농도로 35일간 경구투여하고, 신장보호 효과는 신장 중량의 변화, 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 변화, 사구체내 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 변화를 기초로 평가하였으며, 관련 면역억제에 미치는 영향은 비장 및 악하 임파절 중량의 변화, 비장내 TNF-α, IL-1β및 IL-10의 변화, 가슴샘, 비장 및 악하임파절의 조직학적 변화를 기준으로 평가하였고, 체중, 부고환 주위 지방 중량의 변화, 혈중 TG, TC, LDL 및 HDL 함량의 변화를 관찰하여 CRF 관련 악액질에 대한 효과를 평가하였다.
- 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 비장내 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 및 IL-10 함량을 각각 Rat TNF-α ELISA kit(BD Biosciences/Pharmingen, CA, USA), Rat IL-1β ELISA kit(Genzyme, MA, USA) 및 Rat IL-10 ELISA kit(Genzyme, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 분석은 lysis buffer에 희석한 100 ㎖의 standard 또는 10, 50, 또는 100 ㎖의 조직 homogenate에서 실시하였으며, 각 sample을 두 번 반복적으로 측정하였고, 각 sample의 일정부분은 단백질 함량 측정에 이용하였다. 모든 수치는 단백질 ㎎당 pg(pg/㎎ of protein)으로 측정하였다.
- 약물 투여 35일 및 second NTX 수술 10주 후, 최종 희생일에 비장 조직의 일부(대략 10-15 ㎎/head)를 1㎖의 lysis 완충액(2 ㎜의 PMSF와 1 ㎎/㎖의 aprotinin), leupeptin(Sigma, MO, USA) 및 pepstatin A(Sigma, MO, USA)가 포함된 인산완충액, PBS을 이용하여 homogenize하였다. 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 비장내 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 및 IL-10 함량을 각각 Rat TNF-α ELISA kit(BD Biosciences/Pharmingen, CA, USA), Rat IL-1β ELISA kit(Genzyme, MA, USA) 및 Rat IL-10 ELISA kit(Genzyme, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- CRF를 유발하기 위하여, 우상복부를 척추와 평행하게 절개하여 우측 신장을 노출시킨 후, 신장의 피막을 제거하고, 신동맥, 신정맥, 우측 요관을 봉합사로 묶은 다음 우측 신장을 절제하였다(Fist NTX). 우측 신장 절제 1주일 후, 전신마취 하에서 Rat의 좌상복부를 동일한 방법으로 절개하여 좌측 신장을 노출시킨 다음, 신장의 피막을 제거하고, 좌측 신동맥, 신정맥, 요관 및 신우를 보전하면서 신장의 양극에서 3-0 silk 봉합사를 이용하여 결찰한 후, 좌측 신장의 2/3를 선택적으로 절제하였다(Second 2/3 partial NTX). 위수술 대조군의 경우, 2회의 개복수술시 마취하에서 복부를 절개하여 신장을 노출시킨 후, capsule만 제거하고, 절제나 손상 없이 다시 봉합하였다.
- 최종 희생일에 모든 실험동물을 18시간 이상 절식 후 개복하여, 좌측 신장의 일부(대략 10~15 ㎎/head)를 적출한 다음, 멸균 생리 식염수로 세척하고 주변 지방 조직을 제거하였다. 이후 in 9 vols ice-cold 0.15 M/L KCl 및 1.9 ㎜/L ethylenediaminetetraacetic acid(Sigma, MO, USA)가 함유된 용액에서 homogenize하고, 상층액을 분리하여 MDA(malondialdehyde) 및 GSH(glutathione) 함량을 각각 측정하였으며, SOD(superoxide dismutase) 및 CAT(catalase) 활성 역시 각각 측정하였다. 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 지질 과산화 정도(lipid peroxidation)는 2-thiobarbituric acid를 이용하여 MDA(nM)/g protein 단위로 측정하였다.
- 3 ㎖의 혈액을 채취한 다음 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 이후 자동혈액분석장치(Toshiba 200 FR, Japan)를 이용하여 혈중 BUN 및 creatinine 함량을 각각 ㎎/㎗ 단위로 측정하였으며, 최종 희생일에 복대정맥에서 5 ㎖의 혈액을 채취하여, 혈청을 분리한 다음 자동혈액분석 장치를 이용하여 혈중 BUN, creatinine, TG(triglyceride), TC(total cholesterol), LDL(low density lipoprotein) 및 HDL(high density lipoprotein) 함량을 각각 ㎎/㎗ 단위로 측정하였다. 또한 HDL의 변화량을 좀 더 명확히 하기 위하여 HDL/LDL의 비율을 각각 산출하였다.
- 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 비장내 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 및 IL-10 함량을 각각 Rat TNF-α ELISA kit(BD Biosciences/Pharmingen, CA, USA), Rat IL-1β ELISA kit(Genzyme, MA, USA) 및 Rat IL-10 ELISA kit(Genzyme, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 9 ㎜/L ethylenediaminetetraacetic acid(Sigma, MO, USA)가 함유된 용액에서 homogenize하고, 상층액을 분리하여 MDA(malondialdehyde) 및 GSH(glutathione) 함량을 각각 측정하였으며, SOD(superoxide dismutase) 및 CAT(catalase) 활성 역시 각각 측정하였다. 조직내 단백질 함량은 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 지질 과산화 정도(lipid peroxidation)는 2-thiobarbituric acid를 이용하여 MDA(nM)/g protein 단위로 측정하였다. 또한 항산화 정도를 판단하기 위해 microplate reader에 적응시킨 enzymatic recycling procedure를 이용하여 GSH (μM)/g protein 단위로 측정하였다.
- 준비한 파라핀 포매 신장 조직 절편을 이용하여, Avidine-Biotin-Peroxidase Complex(ABC)방법으로, caspase-3 및 PARP(polymerase) 면역반응 세포의 변화를 각각 관찰하였다.
- 즉, NTX 수술 대신 sham 수술을 실시한 위수술 대조군(sham control), NTX 수술 4주후부터 멸균증류수를 투여한 대조군(CRF control), NTX 수술 후 α-tocoperol(Sigma, MO, USA) 200 IU/㎏ 투여군(α-tocoperol), NTX 수술 후 각각 HB 200 ㎎/㎏ 투여군(HB)의 4군으로 구분하여 실험하였다.
- 즉, citrate buffer antigen(epitope) retrieval pretreatment를 실시한 다음, 0.1% 과산화수소가 포함된 methanol에 30분간 반응시켜 비특이적 peroxidase 반응을 차단하고, normal goat serum에 1시간 동안 반응시켜 내인성 peroxidase를 제거하였다.
- 최종 희생일에 모든 실험동물을 18시간 이상 절식 후 개복하여, 좌측 신장의 일부(대략 10~15 ㎎/head)를 적출한 다음, 멸균 생리 식염수로 세척하고 주변 지방 조직을 제거하였다. 이후 in 9 vols ice-cold 0.
- 최종 희생일에 모든 실험동물의 좌측 신장, 비장, 가슴샘, 좌측 악하 임파절 및 좌측 부고환 주위 지방을 적출하여, 주변 결합조직과 분리한 다음 각각의 중량을 측정하여, 절대 중량으로 하였으며, 체중의 변화에 수반된 이차적 변화를 최소화하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.
대상 데이터
- 96마리의 수컷 Sprague-Dawely Rat(6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 60일간의 순화과정을 거쳐, 18시간 절식 후의 체중이 360 g이상 될 때 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간동안 온도(20-25℃)와 습도(45-50%)가 조절된 사육실에서 4마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 이중 80마리는 5/6 NTX를 실시하여 CRF를 유발하였으며, 나머지 16마리는 위수술(Sham-operated) 정상 대조군으로 사용하였다.
- 이중 80마리는 5/6 NTX를 실시하여 CRF를 유발하였으며, 나머지 16마리는 위수술(Sham-operated) 정상 대조군으로 사용하였다. NTX 또는 sham 수술 4주 후 체중(sham 대조군: 438-475 g, CRF 유발군: 341-386 g과 혈중 BUN(sham 대조군: 15-21 g, CRF 유발군:38-53 ㎎/㎗) 및 creatinine(sham 대조군: 0.5~0.8 g, CRF 유발군: 0.8~1.3 ㎎/㎗) 함량이 일정한 대략 반수의 실험동물만 선정하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 NTX 수술일, 투여시작일 및 최종 부검일에 각각 18시간 절식을 실시하였다(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다).
- 본 실험에 사용된 약재는 약업사(제천한방약초, 제천, Korea)에서 매입한 것을 현미경하에서 관능검사를 통하여 선정하여 사용 하였으며, 본 실험에 사용된 荊防地黃湯는 동의수세보원에 근거하여 각 1첩 분량의 조성은 Table 1과 같다. 각각 선정된 2첩 분량의 약제를 취하여 정제수 2L로, 80℃에서 9시간 가열 추출한 후, 흡인 여과한 여과액을 감압농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 동결 건조시켜, 각각 수율 23.
- 본 실험에 사용한 α-tocoperol 투여용량은 이전에 5/6 NTX로 유발된 CRF에 확실한 효과를 나타낸 200 IU/㎏12을 선정하였으며, HB의 투여용량인 200 ㎎/㎏은 이전의 동물실험의 자료10를 각각 기초로 하여 선정하였다 (Figure 1).
- 실험동물은 군당 8마리씩 4그룹으로 구분하였다. 즉, NTX 수술 대신 sham 수술을 실시한 위수술 대조군(sham control), NTX 수술 4주후부터 멸균증류수를 투여한 대조군(CRF control), NTX 수술 후 α-tocoperol(Sigma, MO, USA) 200 IU/㎏ 투여군(α-tocoperol), NTX 수술 후 각각 HB 200 ㎎/㎏ 투여군(HB)의 4군으로 구분하여 실험하였다.
- 96마리의 수컷 Sprague-Dawely Rat(6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 60일간의 순화과정을 거쳐, 18시간 절식 후의 체중이 360 g이상 될 때 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간동안 온도(20-25℃)와 습도(45-50%)가 조절된 사육실에서 4마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 이중 80마리는 5/6 NTX를 실시하여 CRF를 유발하였으며, 나머지 16마리는 위수술(Sham-operated) 정상 대조군으로 사용하였다. NTX 또는 sham 수술 4주 후 체중(sham 대조군: 438-475 g, CRF 유발군: 341-386 g과 혈중 BUN(sham 대조군: 15-21 g, CRF 유발군:38-53 ㎎/㎗) 및 creatinine(sham 대조군: 0.
데이터처리
- 모든 수치는 평균±표준편차로 표시하였으며, 다중 비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U(MW) test 를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다.
- 모든 수치는 평균±표준편차로 표시하였으며, 다중 비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증 하였다.
- 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences(LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U(MW) test 를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다. 모든 통계처리는 SPSS for Windows(Release 14.
- 실험 결과는 5/6 NTX 로 유발된 CRF에 유효한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 항산화제인 α-tocoperol12 투여군과 비교하였다.
성능/효과
- 1. 신장보호 효과: 혈중 BUN 및 creatinine 함량, 사구체내 capsae-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 변화를 평가하여 荊防地黃湯이 우수한 신장보호 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 2. 면역활성 효과: 가슴샘, 비장 및 악하임파절 중량의 변화, 비장내 TNF-α, IL-1β 및 IL-10의 변화를 평가하여 荊防地黃湯이 우수한 면역활성 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 3. 악액질에 대한 효과: 체중, 부고환 주위 지방 중량의 변화, 혈중 TG, TC, LDL 및 HDL 함량의 변화를 평가하여 荊防地黃湯이 우수한 악액질 제어 효과를 나타내었다.
- CRF 대조군에서는 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01, p<0.01) 신장 사구체내에서 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 증가가 관찰되었으며, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01, p<0.01) caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 감소가 관찰되었다 (Figure 3).
- Second NTX 4주 후 sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 creatinine 함량의 증가가 second NTX 수술 4주 후, 즉 투여 시작일 및 투여 35일 후의 최종 부검일에 각각 관찰되었다.
- Second NTX 4주 후 혈중 BUN 함량이 유사한 실험 동물을 선정하여 사용하였으므로, sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 BUN 함량의 증가가 second NTX 4주 후, 즉 투여 시작일 및 투여 35일 후의 최종 부검일에 각각 인정되었다.
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HDL/LDL 비율의 감소가 인정되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈중 HDL/LDL비율의 감소가 관찰되었다 (Table 4).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 잔존 신장의 절대 및 상대 중량의 증가가 각각 인정되었으나, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 신장 상대 중량의 감소가 인정되었다.
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 현저한 체중의 감소가 second NTX 4주 후, 즉 투여 시작 1일전부터 나타났고, 결과적으로 CRF 유발기간 및 약물투여 기간 동안의 증체량 역시 각각 sham 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 현저한 감소를 나타내었다.
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 HDL 함량의 증가가 인정되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 HDL 함량의 감소가 관찰되었다 (Table 4).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 LDL 함량의 증가가 인정되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 LDL 함량의 감소가 관찰되었다 (Table 4).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 TC 함량의 증가가 인정되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 TC 함량의 감소가 관찰되었다 (Table 4).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01) 혈중 TG 함량의 증가가 인정되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 TG 함량의 감소가 관찰되었다 (Table 4).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.01) 비장 조직내 TNF-α, IL-1β, IL-10 함량의 감소가 관찰되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.01) 비장내 TNF-α, IL-1β, IL-10함량의 증가가 관찰되었다 (Table 5).
- Sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.01, p<0.01) 신장 조직내 MDA 함량의 증가와 GSH 함량, SOD 활성, CAT활성의 감소가 관찰되었고, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.01, p<0.01 또는 p<0.05) 신장내 MDA 함량의 감소와 GSH 함량, SOD 활성, CAT활성의 증가가 관찰되었다 (Table 6).
- 또한 sham 대조군에 비해 CRF 대조군에서는 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.01, p<0.01) 현저한 비장, 가슴샘, 악하 임파절, 부고환 주위 지방의 절대 및 상대 중량의 감소가 각각 인정되었으나, α-tocoperol, HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01, p<0.01, p<0.05, p<0.01) 비장 상대 중량, 가슴샘, 악하 임파절, 부고환 주위 지방의 절대 및 상대 중량의 증가가 관찰되었다 (Table 3).
- 반면 임파장기 중량 및 비장내 TNFα, L-1β 및 IL-10의 함량의 변화가 HB, α-tocoperol 투여군에서는 억제되는 것으로 관찰되었다.
- 본 연구 결과, 5/6 NTX 4주 후 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가를 기준으로 CRF 유발 정도를 확인하였으며, CRF 수술 10주후 최종 부검시 sham 대조군에 비해 현저한 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가가 CRF 대조군에서 관찰되었으나, HB, α-tocoperol 투여군에서는 혈중 BUN 및 creatinine 함량의 증가가 억제되었다.
- 그리고 다양한 천연물의 항산화 방어기전을 통한 CRF에 대한 유효한 효과가 이미 잘 보고되어 있다16,17. 본 연구 결과에서도 5/6 NTX 로 유발된 CRF 대조군에서 지질 과산화에 의해 신장의 MDA33함량의 증가와 GSH34 함량의 감소가 내인성 항산화 효소인 SOD35 및 CAT 활성36의 감소와 함께 초래되었다. 한편 이러한 조직 내 MDA 함량의 증가와 GSH 함량의 감소, SOD 및 CAT 활성의 감소가 HB, α-tocoperol 투여군에서는 억제되었다.
- 일반적으로 고지혈증 시 LDL, TG 및 TC 함량 증가와 함께 HDL 감소가 문제시 되고 있다32. 본 연구 결과에서도 CRF 대조군에서 현저한 체중감소, 부고환 지방 중량의 감소가 초래되었으며, 혈중 TG, TC, LDL함량의 증가와 함께 HDL/LDL 비율의 감소가 초래되었다. 이는 전형적인 소모성 악액질 현상이 이전의 연구들24,28-30과 동일한 것으로 나타났다.
- 본 연구 결과에서도, CRF 대조군에서 현저한 잔존 신장 중량의 증가가 관찰되었으나, HB, α-tocoperol 투여군에서는 감소되었다.
- 본 연구에서도 CRF 대조군에서 현저한 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 수적 증가가 사구체내에서 관찰되었으나, HB, α-tocoperol 투여군에서는 사구체내 caspase-3 및 PARP 면역반응세포의 감소가 관찰되었다.
- 본 연구에서도 CRF에 의한 면역억제의 일환으로, CRF 대조군에서는 가슴샘, 비장 및 악하 임파절의 중량이 감소되었으며, 비장내 TNF-α, L-1β 및 IL-10 함량이 현저히 감소된 것으로 생각된다.
- 이는 荊防地黃湯이 임파장기 중량, 비장내 TNFα, L-1β 및 IL-10 함량의 감소 억제를 통하여 면역활성 효과가 있으며, 체중과 축적 지방 중량의 감소, 혈중 TG, TC, LDL 함량의 증가 억제를 통하여 만성 소모성 악액질 제어 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 한편 α-tocoperol 및 HB 투여군에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 체중의 증가가 투여 21일후부터 관찰되었으며, 약물투여 기간 동안의 증체량 역시 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 증가를 각각 나타내었다 (Table 2).
- 한편 α-tocoperol, HB 투여군에서 second NTX 4주 후 CRF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈중 BUN 함량의 변화는 인정되지 않았으나, 최종 희생일에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 BUN 함량의 감소가 관찰되었다 (Figure 2).
- 한편 본 연구 결과, HB은 대조약물로 사용한 α-tocoperol 투여군보다 현저히 우수한 신장 보호, 면역활성, 악액질 제어, 항산화 효과를 나타내었다.
- 한편 이러한 조직 내 MDA 함량의 증가와 GSH 함량의 감소, SOD 및 CAT 활성의 감소가 HB, α-tocoperol 투여군에서는 억제되었다.
- 한편α-tocoperol, HB 투여군에서 second NTX 4주 후 CRF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈중 creatinine 함량의 변화는 관찰되지 않았으나, 최종 희생일에서는 각각 CRF 대조군에 비해 유의성 있는(p<0.01) 혈중 creatinine 함량의 감소가 관찰되었다 (Figure 2).
후속연구
- 이는 이 등7의 연구에서 荊防地黃湯이 68주령 백서의 신장, 방광, 비장세포의 SOD activity와 GSH 농도를 유의하게 증가시켰고, MDA 농도를 유의하게 감소시킨 결과와 유사한 것을 확인하였다. 따라서 荊防地黃湯의 5/6 NTX로 유발된 CRF 및 관련 면역억제 및 악액질에 대한 효과가 주로 항산화 효과에 의해 초래되는 것으로 판단되나, 정확한 기전 연구가 좀더 수행되어야 할 것으로 생각된다.
- 앞으로 荊防地黃湯은 각각 수많은 생리활성 물질을 함유하고 있어, 개별 구성 약재 각각에 대한 효능 및 생리활성을 나타내는 화학성분의 검색과 더불어 다양한 방면으로 기전적인 연구를 수행해야 할 것으로 판단되며, 荊防地黃湯에 대한 용량 변화에 따른 결과 비교 연구 역시 세밀히 검토하여야 할 것으로 판단된다.
- 이는 荊防地黃湯이 임파장기 중량, 비장내 TNFα, L-1β 및 IL-10 함량의 감소 억제를 통하여 면역활성 효과가 있으며, 체중과 축적 지방 중량의 감소, 혈중 TG, TC, LDL 함량의 증가 억제를 통하여 만성 소모성 악액질 제어 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이것으로 형방지황탕은 만성 신부전뿐만 아니라 각종 면역질환과 대사질환에도 다양하게 활용될 수 있으리라 사료된다.
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