항균활성을 나타내는 야생형 유산균을 분리 동정하기 위하여 김치에서 480종의 유산균을 분리하였으며, S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis에 대한 항균활성을 agar diffusion 법을 사용하여 검사하였다. 이들 중 항균활성을 나타내는 균주 340종에 대하여 multiplex PCR과 API 50CHL Kit을 이용한 생화학적 특성검사 및 16S rDNA sequencing을 통해 Lb. plantarum 169균주, Lb. fermentum 20균주, Lb. paracasei spp. paracasei 2균주, Lactobacillus 속 2균주와 Pediococcus 속 15균주를 동정하였다. 이들 균주 중 Lb. fermentum의 경우는 프로바이오틱스로서의 활성이 보고되고 있는 균으로 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
항균활성을 나타내는 야생형 유산균을 분리 동정하기 위하여 김치에서 480종의 유산균을 분리하였으며, S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis에 대한 항균활성을 agar diffusion 법을 사용하여 검사하였다. 이들 중 항균활성을 나타내는 균주 340종에 대하여 multiplex PCR과 API 50CHL Kit을 이용한 생화학적 특성검사 및 16S rDNA sequencing을 통해 Lb. plantarum 169균주, Lb. fermentum 20균주, Lb. paracasei spp. paracasei 2균주, Lactobacillus 속 2균주와 Pediococcus 속 15균주를 동정하였다. 이들 균주 중 Lb. fermentum의 경우는 프로바이오틱스로서의 활성이 보고되고 있는 균으로 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
Total 480 lactic acid-producing bacteria were isolated from five kinds of kimchi, and their antibacterial activity was tested against Salmonella enterica serovar Typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa using an agar diffusion assay. Among them, 340 isolates showed a halo on MRS ag...
Total 480 lactic acid-producing bacteria were isolated from five kinds of kimchi, and their antibacterial activity was tested against Salmonella enterica serovar Typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa using an agar diffusion assay. Among them, 340 isolates showed a halo on MRS agar against one or more indicator strains, which were identified using multiplex PCR, an API 50CHL kit, and a 16S rDNA sequence analysis. As a result, 169 Lactobacillus plantarum, 20 Lactobacillus fermentum, two Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, two Lactobacillus sp., and 15 Pediococcus sp. were identified. This may be the first report on the isolation of antibacterial Lactobacillus fermentum from kimchi.
Total 480 lactic acid-producing bacteria were isolated from five kinds of kimchi, and their antibacterial activity was tested against Salmonella enterica serovar Typhimurium, Bacillus subtilis, and Pseudomonas aeruginosa using an agar diffusion assay. Among them, 340 isolates showed a halo on MRS agar against one or more indicator strains, which were identified using multiplex PCR, an API 50CHL kit, and a 16S rDNA sequence analysis. As a result, 169 Lactobacillus plantarum, 20 Lactobacillus fermentum, two Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, two Lactobacillus sp., and 15 Pediococcus sp. were identified. This may be the first report on the isolation of antibacterial Lactobacillus fermentum from kimchi.
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문제 정의
또한 Wells 등(19)은 소의 위에서 Streptococcus bovis에 대한 항균활성을 가지는 Lb. fermentum을 분리하여 보고하였다. Fazeli 등(20)은 이란의 전통빵의 제조에 사용되는 sourdough에서 곰팡이의 성장을 억제하여 유통기한을 연장할 수 있는 Lb.
본 연구에서는 항균활성이 우수한 유산균주를 탐색하고 이를 식품용 유전자 발현시스템용 마커로서 개발하기 위한 기초연구로서, 김치로부터 항균활성을 나타내는 유산균을 분리·선발하고 이들 균주를 생화학적·유전학적 방법으로 동정하였다.
제안 방법
24 well 배양 접시에 멸균된 MRS 액체배지를 2 mL씩 분주하여 분리균주를 접균하고 혐기 조건에서 48-72시간 배양하였으며, 배양액 1.5 mL를 취하여 멸균된 eppendorf tube에 옮긴 후 원심분리(12,000 rpm, 4℃, 5분) 한 후 상층액 1 mL를 조심스럽게 취하여 박테리오신 조추출액으로 하여 −20°C에 보관하고, 1회 해동하여 냉장보관 하며 agar diffusion assay를 수행 하였다.
Catalase test는 배양 평판에 3% hydrogen peroxide(H2O2)를 첨가한 후 O2 발생 유무를 관찰하였고, oxidase test는 콜로니를 비금속성 막대를 사용하여 filter paper에 묻힌 후 Oxidase reagent(BioMérieux)를 한 방울 떨어뜨려 변색 여부를 관찰 하였다.
Lactobacillus속 미생물의 분리를 위하여 Lactobacillus selection media(LBS-media, Difco, St. Louis, MO, USA)와 MRS media (Difco)에 acetic acid(Shinyo Pure Chemical Co., Ltd. Osaka, Japan)를 첨가하여 사용하였고 계대배양에는 MRS media(Difco)를 사용하였다. 혐기배양을 위하여 AnaeroGen™ gas pack(Oxoid Inc.
Multiplex PCR-G와 multiplex PCR-IV에 의한 증폭 산물을 형성하지 않은 균주 중 간균 9종을 선별하여 API 50CHL kit을 사용하여 당 분해능, arginine과 esculin 분해능을 배지의 색 변화로 관찰하여 apiweb program(http://apiweb.biomerieux.com, Biomerieux)을 이용하여 동정하였다.
Multiplex PCR-G와 multiplex PCR-IV에 의한 증폭 산물을 형성하지 않은 균주 중 구균 18종을 선별하여 16S rDNA 서열을 분석하여 동정하였다. 염기서열 결정용으로 27F, 350F, 920R, 1492R primer를 사용하였으며, 각각의 결과를 보정하여 BLASTN progarm(http://blast.
Multiplex PCR-IV는 primer로 Lsal-1, Lreu1, Lpla-3, Lfer-3, Lsal-2, Lreu-4, Lpla-2, Lfer-4를 10 pmol로 희석하여 각 1 µL씩을 사용 하였으며, 나머지 성분은 multiplex PCRG와 동일하게 조성한 후 95℃에서 5분간 반응한 후에 95℃에서20초, 58℃에서 2분의 반응을 총 35회 수행한 후 72℃에서 5분간 최종 신장한 후 2% 아가로즈 겔 전기영동으로 확인 하였다.
Multiplex PCR에서 증폭 산물을 형성하지 않은 구균 혹은 구간균 17종을 선택하여 16S rDNA를 27F, 1492R primer를 사용하여 PCR로 증폭한 후 27F, 350F, 920R, 1492R primer를 사용하여 염기서열 중 일부를 결정하였다. 이들 primer 중 특히 1492R primer가 가장 좋은 결과를 보였으며 920R primer를 사용한 경우 대부분의 균주가 반응을 나타내지 않았는데, 이는 920R primer의 부착부위인 16S rDNA의 보존 서열에 primer 부착이 저해 될 정도의 변이가 있을 가능성을 나타낸다.
건조된 indicator plate에 blank disc를 떨어뜨린 후 20 µL의 박테리오신 조 추출액을 점적하고 37°C에서 12시간 배양 후 투명 환의 형성 여부를 판단하여 항균활성을 갖는 균주를 선발하였다.
분리균주는 MRS 액체배지에서 37℃로 24시간 배양한 후 그람염색(12)을 통하여 그람양성 균주를 판별하고, 분리균주의 크기와 형태를 광학현미경으로 관찰하였다.
분리균주의 그룹을 나누기위한 multiplex PCR-G에서는 10X reaction buffer(with MgCl2) 2.5 µL, 1 µL의 dNTPs(2.5mM each), 10 pmol/µL로 희석한 primer Ldel-7, LU-5, LU-3', LU-1', Lac-2를 1 µL씩을 넣고, 최종 25 µL의 반응 용액에 0.25U의 HanTaq XL polymerase(Genenmed Inc., Seoul, Korea)를 포함하게 조성하였으며, PTC-100 Peltier Thermal Cycler(MJ Research Inc. Waltham, MA, USA)를 사용하여 PCR 반응을 수행 하였다.
Multiplex PCR-G와 multiplex PCR-IV에 의한 증폭 산물을 형성하지 않은 균주 중 구균 18종을 선별하여 16S rDNA 서열을 분석하여 동정하였다. 염기서열 결정용으로 27F, 350F, 920R, 1492R primer를 사용하였으며, 각각의 결과를 보정하여 BLASTN progarm(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용하여 해당균주를 동정하였다. Multiplex PCR에 사용된 primer는 Table 2에 표시하였다.
전통적인 방법으로 일반 가정집에서 만든 5종류의 김치를 수집하여 mixer로 균질화 한 후 180 mL의 LBS 및 MRS배지에 10%(w/v)로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하여 증균하였다. 증 균액을 0.
증 균액을 0.85% 멸균 생리식염수를 이용하여 106-107까지 희석한 액 100 µL를 0.1%(w/v) CaCO3를 함유하는 MRS 고체배지에 도 말한 후 AnaeroGen™ gas pack(Oxoid Inc.) 을 사용하여 혐기적인 조건에서 37℃로 3일간 배양한 후 산 생성에 의해 투명환을 형성한 콜로니 중 48개씩을 MRS 고체 배지에 도말하여 순수 분리하였다.
대상 데이터
5종류의 김치로부터 산 생성, 그람 양성, catalase 음성, oxidase 음성을 기준으로 480종의 균주를 분리한 후 재료 및 방법에 의하여 이들 중 426균주에 대한 박테리오신 조 추출액을 제조하여 항균활성 실험에 사용하였다. S.
분리한 균주의 생화학적 특성 검사를 위해서는 Gram stain sets(Difco), hydrogen peroxide(Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), oxidase reagent(BioMérieux Inc., Marcy l'Etoile, France), API 50CHL kit(BioMérieux)를 사용하였다.
혐기배양을 위하여 AnaeroGen™ gas pack(Oxoid Inc., Cambridge, UK)를 사용하였다.
데이터처리
PCR은 95℃에서 5분간 반응 후에 95℃에서 20초, 55°C에서 2분의 반응을 총 35회 수행한 후 72℃에서 5분간 최종 신장하였다. Multiplex PCR-G의 결과에 따라 multiplex PCR 를 수행하였다. Multiplex PCR-IV는 primer로 Lsal-1, Lreu1, Lpla-3, Lfer-3, Lsal-2, Lreu-4, Lpla-2, Lfer-4를 10 pmol로 희석하여 각 1 µL씩을 사용 하였으며, 나머지 성분은 multiplex PCRG와 동일하게 조성한 후 95℃에서 5분간 반응한 후에 95℃에서20초, 58℃에서 2분의 반응을 총 35회 수행한 후 72℃에서 5분간 최종 신장한 후 2% 아가로즈 겔 전기영동으로 확인 하였다.
이론/모형
분리한 균주의 생화학적 특성은 Cowan과 Steel(13) 그리고 MacFaddin(14)의 방법에 따라 균주의 특성을 조사한 후 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(2)에 준하여 분류 및 동정하였다.
최초 분리한 480균주의 신속한 동정을 위하여 Multiplex PCR(15)을 수행하였다. 주형으로 사용할 genomic DNA는 Puregene™ DNA Isolation kit(Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA)을 사용하여 준비 하였다.
항균활성 검색을 위하여 blank disc를 이용한 agar diffusion assay를 수행 하였다. 24 well 배양 접시에 멸균된 MRS 액체배지를 2 mL씩 분주하여 분리균주를 접균하고 혐기 조건에서 48-72시간 배양하였으며, 배양액 1.
항균활성을 나타내는 야생형 유산균을 분리·동정하기 위하여 김치에서 480종의 유산균을 분리하였으며, S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis에 대한 항균활성을 agar diffusion 법을 사용하여 검사하였다.
성능/효과
plantarum으로 동정하였다. M307균주는 %ID의 합 86.1%, T index 평균 0.25를 보여 Lactobacillus 속으로 동정하였다. M311균주는 Lb.
5종류의 김치로부터 산 생성, 그람 양성, catalase 음성, oxidase 음성을 기준으로 480종의 균주를 분리한 후 재료 및 방법에 의하여 이들 중 426균주에 대한 박테리오신 조 추출액을 제조하여 항균활성 실험에 사용하였다. S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis을 항균활성에 대한 지표 균주로 사용하여 시험한 결과 340균주가 한 가지 이상의 균주에 대하여 항균활성을 나타내었다. 이중 S.
paracasei spp. paracasei 2균주, Lactobacillus 속 2균주와 Pediococcus 속 15균주를 동정하였다. 이들 균주 중 Lb.
Multiplex PCR에서 증폭 산물을 형성하지 않은 구균 혹은 구간균 17종을 선택하여 16S rDNA를 27F, 1492R primer를 사용하여 PCR로 증폭한 후 27F, 350F, 920R, 1492R primer를 사용하여 염기서열 중 일부를 결정하였다. 이들 primer 중 특히 1492R primer가 가장 좋은 결과를 보였으며 920R primer를 사용한 경우 대부분의 균주가 반응을 나타내지 않았는데, 이는 920R primer의 부착부위인 16S rDNA의 보존 서열에 primer 부착이 저해 될 정도의 변이가 있을 가능성을 나타낸다. 이렇게 얻어진 부분적인 16S rDNA 염기서열을 BLASTN program으로 데이터베이스와 비교한 결과 L210, L238, L245, M109, M120, M337, M437의 7균주가 P.
이들 primer 중 특히 1492R primer가 가장 좋은 결과를 보였으며 920R primer를 사용한 경우 대부분의 균주가 반응을 나타내지 않았는데, 이는 920R primer의 부착부위인 16S rDNA의 보존 서열에 primer 부착이 저해 될 정도의 변이가 있을 가능성을 나타낸다. 이렇게 얻어진 부분적인 16S rDNA 염기서열을 BLASTN program으로 데이터베이스와 비교한 결과 L210, L238, L245, M109, M120, M337, M437의 7균주가 P. pentosaceus와 99% 이상의 상동성을 나타냈으며, L101, L115, L145, L146, L147, M111, M223은 P. acidilactici와 99% 이상의 상동성을 나타냈고, L246, L502와 L528은 Lb. plantarum 과 99% 이상의 상동성을 보였다.
subtilis을 항균활성에 대한 지표 균주로 사용하여 시험한 결과 340균주가 한 가지 이상의 균주에 대하여 항균활성을 나타내었다. 이중 S. enterica serovar Typhimurium 균주에 대해서만 항균활성을 갖는 것은 L420이었으며, P. aeruginosa에 대해서만 항균활성을 갖는 것이 35균주, B. subtilis에 대해서만 항균활성을 나타내는 균주가 71균주 이었으며, S. enterica serovar Typhimurium과 P. aeruginosa에 대하여 항균활성을 나타낸 것은 3균주, P. aeruginosa와 B. subtilis 두 균주에 대한 항균활성을 나타내는 것은 165균주, S. enterica serovar Typhimurium과 B. subtilis에 대해서 항균활성을 나타낸 것은 6균주이고, 59균주가 S. enterica serovar Typhimurium, P. aeruginosa, B. subtilis 세 균주 모두에 대하여 항균활성을 나타내었다(Table 3).
후속연구
fermentum의 경우, Lb. acidophilus와 함께 인체 장내에서 probiotics로서의 활성이 보고되고 있어(23) 본 연구를 통해 분리한 균주들의 효율적인 활용을 위해서는 보다 광범위한 균주에 대한 활성 검사와 이들이 생산하는 박테리오신의 특성규명에 대한 추가적인 연구가 진행되어야 할 것이다.
이들 균주 중 Lb. fermentum의 경우는 프로바이오틱스로서의 활성이 보고되고 있는 균으로 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Klaenhammer는 유산균이 생산하는 박테리오신을 분자 및 생리학적 특성에 따라 어떻게 분류하였는가?
Klaenhammer(9)는 유산균이 생산하는 박테리오신을 분자 및 생리학적 특성에 따라 다음과 같이 분류하였다. Class I bacteriocin(lantibiotics)은 post-translational modification 결과 lanthionine 같은 특이한 아미노산을 포함한다. Class II는 lanthionine을 함유하지 않는 박테리오신으로 분자량이 작고 (<13 kDa), 작은 분자량으로 인하여 3차 구조를 형성하지 않으므로 비교적 열에 안정하며, 일반적으로 20개 정도의 소수성 아미노산으로 이루어진 transmembrane helix를 가지는 것을 특징으로 한다. Class III는 분자량이 크고(>30 kDa) 열에 불안정한 항균활성 단백질이다. Lactococcus lactis가 생산하는 nisin의 경우 Class I에 속하며 비교적 넓은 antimicrobial spectrum을 가지고 대부분의 그람 양성균의 증식을 억제한다.
식품에서 유산균이 기여하는 것은 무엇인가?
식품에서 유산균은 발효식품의 맛과 발효산물의 특징을 결정하고, 유기산 및 박테리오신 등의 항균활성물질을 생성하여 식품의 저장성에 기여한다. 박테리오신은 다양한 그람 양성균에서 생산 되는 항균활성 단백질 또는 펩타이드이며, 유산균에서 유래한 박테리오신의 경우 식품산업에서 천연 보존제(natural preservative)로 이용할 수 있는 응용성과 항생제를 대체할 수 있는 물질로서 관심을 끌고 있다.
유산균의 효과는 무엇인가?
유산균은 G+C 50 mol% 이하의 그람 양성, non-spore-forming의 구균, 간균, 혹은 구간균이다. 많은 유산균은 프로바이오틱스(probiotics)로서 소화 흡수를 돕고 장내부패를 억제하고, 설사 변비의 치료 효과, 장내 유해균의 억제, 비타민의 생성, 혈중 콜레스테롤 저하능, 항암 효과, 인체의 면역 능력 증강 등 다양한 기능성이 보고되고 있다(3). 한 예로 Lactobacillus strain의 경우 immunoglobulin의 생산 자극(4), 대식세포에 interferon 유도(5), 신체 부분적 산성화(6), hypocholesteroleaemic 효과(7), mutagenic 물질과의 반응(8), 항균물질인 박테리오신의 생성(9), 그리고 Salmonella enterica serovar Typhimurium과 Neisseria gonorrhaea와 같은 병원성 세균의 흡착 저해 등의 기능이 밝혀진 바 있으며, 이와 같이 유산균의 숙주에 대하여 이로운 작용을 하는 probiotics 로서의 기능이 밝혀져 한때 영양적 측면에서 가치 없는 식품으로 오인 받았던 발효 식품들은 오늘날에 이르러서는 가장 과학적인 식품으로 인정받고 있다.
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