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문제 정의
- 순계배추에서 염 저항성 관련 유전자를 과발현시켜 염 저항성이 우수한 배추 품종을 육성한다는 최종 목표를 달성하기 위해, 본 연구는 염 스트레스를 처리한 순계배추(B. rapa ssp. pekinensis ‘Chiifu’)를 대상으로 microarray 분석을 통하여 염 저항성 유전자로 추정되는 유전자를 선발 및 동정하였다.
제안 방법
- BrEMD에 공개된 731bp의 cDNA 염기서열에서 285bp의 오픈리딩 프레임과 94개의 아미노산을 확인할 수 있었으며(Fig. 2A), 이 정보를 바탕으로 RT-PCR 방법을 이용하여 순계배추(‘CT001’, 시원씨드, 경기도 평택)의 잎에서 BrSSR을 동정하였다.
- BrSSR의 기능을 유추하기 위해 먼저 BrEMD 데이터를 기반으로 BrSSR과 염 저항성 관련 유전자로 알려진 salt overly sensitive 1(SOS1), 2(SOS2), 3(SOS3) 유전자들(Flowers, 2004; Wang et al., 2003; Yang et al., 2009)의 발현 변화를 비교하였다. 염처리 48시간까지의 시간대별 발현 변화를 분석한 결과, BrSSR은 스트레스 발생 초기에 염 저항성 유전자인 SOS 유전자군보다 더 민감하게 반응함으로써 염 스트레스와 밀접한 관련이 있는 유전자일 것으로 추정하였다(Fig.
- DNA blot 분석으로 명확히 확인되지 않았으나 PCR 분석 결과를 기반으로 pSL94-5번 개체까지 포함하여 총 7개의 형질전환체들을 염 스트레스 환경 시 표현형상의 기능검정을 위해 250mM NaCl에서 5일 동안 처리하였다. BrSSR 유전자가 과발현된 7개의 pSL94 형질전환체들은 대조군 대비염 스트레스 환경에서 표현형상의 저항성을 보였다(Fig.
- DNA blot 분석을 통해 T1 형질전환체들에 도입된 T-DNA 개수를 확인하였다.
- Genomi1c DNA 30μg에 제한효소 BamHI을 첨가하여 37℃에서 15시간 동안 절단시킨 후 0.5× TAE buffer를 이용한 1% agarose gel 상에서 50V, 6시간 동안 전기영동하였다.
- Hygromycin 저항성 유전자 내 960bp의 단편을 probe로 사용하여 nylon membrane을 혼성화 mixture(NaH2PO4 1M, Na2HPO4 1M, 10% BSA, 20% SDS, EDTA 0.5M, 32P-dCTP)에 침지 후 65℃에서 18시간 동안 혼성화 반응시키고, 2× SSC, 0.1% SDS와 0.1× SSC, 0.1% SDS를 사용하여 각각 65℃에서 10분간 세척하였다.
- PCR 반응은 genomic DNA 1μL(100ng), 10pmol의 HPT-F와 HPT-R primer 각각 1μ L, 2.5mM dNTPs 2μL, 5U의 Taq polylmerase 0.5μL, 10× buffer 2μL, 그리고 나머지는 멸균수를 첨가하여 최종 반응액이 20μL가 되도록 하였다.
- T1 형질전환 담배를 대상으로 염 스트레스 발생 시 저항성 여부를 확인하기 위해 염 스트레스(250mM NaCl)를 처리하였다. 염 스트레스는 본엽이 6-8매가 된 비형질전환 대조군과 형질전환체들을 병해나 충해가 발생하지 않는 광도 250µmol･m-2･s-1, 광주기 16시간 명처리/8시간 암처리, 습도 30-50%로 생육조건이 일정한 생장상에서 동시에 처리를 시작하여 표현형적으로 명확한 차이(엽색 변화 및 식물체 도복 현상)를 보인 5일 동안 진행하였다.
- pekinensis cDNA clone들의 염기서열(AC189399, AC189261)을 바탕으로 동정용 primer set(BrSSR-F: 5'-ATG GCT TCG TAT TAC TCT GCG T-3', BrSSR-R: 5'-CTA CGC GAC CAC GAG TGT T-3')을 제작하였다.
- 1% SDS를 사용하여 각각 65℃에서 10분간 세척하였다. 그 후, -80℃에서 48시간 동안 nylon membrane을 X-ray 필름에 노출시키고 현상액과 고정액을 이용하여 X-ray 필름을 현상하였다.
- 그런 뒤 HPT-F: 5’-TTT CCA CT GCG AGT AC-3’와 HPT-R: 5’-TGT CGA GAA GTT TCT GAT CGA-3’ primer set을 이용하여 T-DNA 상의 hygromycin 저항성 유전자를 대상으로 형질전환 유무를 확인하였다.
- , 2004) 기내 배양된 담배(Nicotiana tabacum ‘SR1’)로의 유전자 전이를 수행하였다. 그리하여 생산된 T0 담배 형질전환체들은 형질전환 유무를 PCR 방법으로 확인하고 T1 세대로 세대진전 하였으며, 본 연구에서는 T1 세대 담배 형질전환체를 이용하여 분석을 수행하였다.
- 4B). 도입된 BrSSR의 발현 수준 분석은 DNA blot 분석으로 형질전환 유무가 명확하지 않은 pSL94-5번 개체를 제외하고 총 6개 담배 형질전환체들을 대상으로, 250mM NaCl을 3일간 처리한 후 RNA를 추출하여 quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 방법으로 수행하였다. 실험의 신뢰성을 부여하기 위해 내부 대조 유전자로서 actin 유전자의 발현 분석을 함께 수행하였다.
- 발아 후 3주간 생장한 순계배추(B. rapa ssp. pekinensis ‘Chiifu’)에 염 스트레스(250mM NaCl)를 48시간 동안 처리한 후, 생육단계별로 각각의 total RNA를 추출하고 KBGP-24K oligo chip을 제작하여 각 유전자들의 발현 변화를 분석하였다.
- pekinensis ‘Chiifu’)를 대상으로 microarray 분석을 통하여 염 저항성 유전자로 추정되는 유전자를 선발 및 동정하였다. 분리된 유전자를 과발현(over-expression)시킨 형질전환 담배를 생산 및 분석하여 염 스트레스 처리 시 해당 유전자의 염 저항성을 확인하였으며, 이 유전자를 BrSSR (B. rapa salt stress resistance)로 명명하였다.
- 실제로 형질전환이 확인된 개체들에서 도입유전자가 과발현 되는지를 확인하기 위해 quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 분석을 수행하였다. Quantitative real-time RT PCR은 Yu et al.
- 도입된 BrSSR의 발현 수준 분석은 DNA blot 분석으로 형질전환 유무가 명확하지 않은 pSL94-5번 개체를 제외하고 총 6개 담배 형질전환체들을 대상으로, 250mM NaCl을 3일간 처리한 후 RNA를 추출하여 quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 방법으로 수행하였다. 실험의 신뢰성을 부여하기 위해 내부 대조 유전자로서 actin 유전자의 발현 분석을 함께 수행하였다. Quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 분석에서 개체별로 유사한 발현 패턴을 보였으며 6개의 형질전환체들 모두 대조군 대비 발현량이 약 1.
- 염 스트레스는 본엽이 6-8매가 된 비형질전환 대조군과 형질전환체들을 병해나 충해가 발생하지 않는 광도 250µmol･m-2･s-1, 광주기 16시간 명처리/8시간 암처리, 습도 30-50%로 생육조건이 일정한 생장상에서 동시에 처리를 시작하여 표현형적으로 명확한 차이(엽색 변화 및 식물체 도복 현상)를 보인 5일 동안 진행하였다.
- 이들 중 기능이 명확히 알려지지 않았으며 완전장을 갖추고 있는 유전자들에서 하나의 유전자를 최종 선발하여 “BrSSR”로 명명하였다.
- 제작된 primer set을 이용하여 reverse transcriptase(RT)-PCR 방법으로 285bp의 product를 증폭하였으며, 이 PCR product는 pGemT-easy vector(Promega, USA)에 클로닝 후 대장균 DH10ß에 형질전환하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 1× TBE buffer를 사용하여 1% agarose gel 상에서 100V, 30분간 전기영동하여 ethidium bromide(EtBr)로 염색한 후, UV illuminator를 이용하여 반응산물을 확인하였다.
- 현재까지 기능이 보고되지 않은 BrSSR 유전자의 염저항성 여부를 알아보기 위해 N. tabacum ‘SR1’을 이용하여 BrSSR 과발현 운반체인 pSL94 vector로 형질전환하였다.
대상 데이터
- tabacum ‘SR1’을 이용하여 BrSSR 과발현 운반체인 pSL94 vector로 형질전환하였다. Agrobacterium을 이용한 형질전환 방법으로 담배에 도입한결과, 총 8개의 추정 담배 형질전환체를 생산하였으나 이 중 1개체는 hygromycin 저항성 유전자(hpt)를 대상으로 한 PCR분석에서 hpt 유전자의 존재가 확인되지 않아 이 개체를 제외하고 최종 7개체의 담배 형질전환체를 선발하였다(Fig. 4A). 또한 7개체의 PCR product의 염기서열을 분석하여 hpt 유전자임을 확인하였다(순서대로 pSL94-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7로 명명함).
- BrEMD(Brassica rapa EST and microarray database, www.brassica-rapa.org/BrEMD) 내염 스트레스가 처리된 순계배추(‘Chiifu’)를 대상으로 한 microarray 데이터를 분석하여 대조군 대비 5배 이상 발현이 증가한 202개의 unigene들을 1차 선발하였다.
- , 2008). 본 연구의 대상 유전자는 BrEMD 정보를 활용하여, 염 스트레스 처리 시 발현이 강하게 증가하였으나 그 기능이 알려지지 않은 유전자들 중에서 선발하였다. 선발된 염 저항성 관련 유전자를 동정하기 위해 먼저 KBGP-24K oligo chip에서의 염기서열(BRAS0001S00000772), 애기장대(A.
- 순계배추에서 동정한 염 저항성 관련 유전자가 과발현된 담배 형질전환체를 생산하기 위해, 우선 전체 285bp의 유전자를 pH2GW7(VIB-Ghent University, Belgium)에 클로닝하여 형질전환용 과발현 운반체인 pSL94를 제작하였다(Fig. 1). 그런 뒤, Agrobacterium을 이용한 형질전환 방법을 이용하여(Lee et al.
- 최종 선발된 BrSSR의 KBGP-24K chip seqID는 “BRAS0001S00000772”이고, 5’ end EST clone 이름은 “KBFL-131B09”이며, TAIR ID는 “AT2G44670”이다.
이론/모형
- 그런 뒤, Agrobacterium을 이용한 형질전환 방법을 이용하여(Lee et al., 2004) 기내 배양된 담배(Nicotiana tabacum ‘SR1’)로의 유전자 전이를 수행하였다.
성능/효과
- DNA blot 분석으로 명확히 확인되지 않았으나 PCR 분석 결과를 기반으로 pSL94-5번 개체까지 포함하여 총 7개의 형질전환체들을 염 스트레스 환경 시 표현형상의 기능검정을 위해 250mM NaCl에서 5일 동안 처리하였다. BrSSR 유전자가 과발현된 7개의 pSL94 형질전환체들은 대조군 대비염 스트레스 환경에서 표현형상의 저항성을 보였다(Fig. 4E). 대조군인 비형질전환 담배는 잎과 줄기의 탄력을 잃고 쓰러지고 엽색이 점차 연해지더니 노란색으로 변하기 시작하였으며 더 이상 생장하지 못하는 모습을 보인 반면, 형질전환된 7개체는 모두 염 처리 전과 동일한 모습을 유지하여 표현형상의 뚜렷한 차이를 보여 주었다.
- BrSSR이 가지고 있는 DUF581(PF04570) 도메인을 Pfam database (pfam.sanger.ac.uk)에서 분석한 결과 그 기능을 명확히 확인할 수는 없었지만, 양이온 수송 ATPase(ATPase-cat_bd)(PF12156), 구리이온 수송 ATPase(YHS)(PF04945), zinc finger-FCS(-HIT, -Mss51, -MYND)(PF06467, PF04438, PF13824, PF01753) 도메인들과 관련이 있는 것으로 나타났다.
- 실험의 신뢰성을 부여하기 위해 내부 대조 유전자로서 actin 유전자의 발현 분석을 함께 수행하였다. Quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 분석에서 개체별로 유사한 발현 패턴을 보였으며 6개의 형질전환체들 모두 대조군 대비 발현량이 약 1.9-3.8배 가량 증가한 것으로 나타났다(Figs. 4C and 4D). 한편, BrEMD에 제시된 ‘Chiifu’ 배추를 이용한 KBGP-24K microarray 분석에서도 염처리 12시간째부터 발현이 크게 증가하여 최대 3.
- 결론적으로 순계배추(‘Chiifu’)의 염 자극 시 3배 이상의 발현량 증가 및 염 스트레스 관련 유전자들인 SOS 유전자군과의 발현 비교 분석(BrEMD의 KBGP-24K microarray 분석), DUF581 domain 분석, 애기장대에서의 호르몬 및 기관발달 관련 연구보고, 그리고 최종적으로 실제 담배 형질전환체의 염 스트레스 시 표현형 분석을 종합하여 볼 때, BrSSR 유전자는 염 스트레스 발생 시 발현량의 증가를 통해 식물의 염 저항성 향상과 매우 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다.
- 또한 7개체의 PCR product의 염기서열을 분석하여 hpt 유전자임을 확인하였다(순서대로 pSL94-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7로 명명함). 그리고 DNA blot 분석으로 7개체의 T-DNA 도입수를 확인한 결과, pSL94-3 개체는 1개의 T-DNA가, 나머지 개체들은 1개 이상의 T-DNA가 삽입되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 도입된 BrSSR의 발현 수준 분석은 DNA blot 분석으로 형질전환 유무가 명확하지 않은 pSL94-5번 개체를 제외하고 총 6개 담배 형질전환체들을 대상으로, 250mM NaCl을 3일간 처리한 후 RNA를 추출하여 quantitative real-time RT PCR과 RNA blot 방법으로 수행하였다.
- 4E). 대조군인 비형질전환 담배는 잎과 줄기의 탄력을 잃고 쓰러지고 엽색이 점차 연해지더니 노란색으로 변하기 시작하였으며 더 이상 생장하지 못하는 모습을 보인 반면, 형질전환된 7개체는 모두 염 처리 전과 동일한 모습을 유지하여 표현형상의 뚜렷한 차이를 보여 주었다.
- 4A). 또한 7개체의 PCR product의 염기서열을 분석하여 hpt 유전자임을 확인하였다(순서대로 pSL94-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7로 명명함). 그리고 DNA blot 분석으로 7개체의 T-DNA 도입수를 확인한 결과, pSL94-3 개체는 1개의 T-DNA가, 나머지 개체들은 1개 이상의 T-DNA가 삽입되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- , 2001). 또한 애기장대 유전자들의 발현 네트워크 분석 데이터(GENEMANIA, www.genemania.org)를 기반으로 BrSSR과 밀접히 관련된 유전자들을 분석한 결과, 총 20개의 유전자들이 유의적인 관계를 가지고 있는 것이 분석되었으며, 이들 중 기능이 밝혀져 있는 유전자는 체내 RNase 단백질의 활성을 억제하는regulator of ribonuclease-like protein 3(AT5G56260)와 세포증식 및 생장 관련 시그널을 조절하는 tyrosine-sulfated glycopeptide receptor 1(AT1G72300)으로 확인되었다. 그러나 이들과 염 저항성과의 관련 연구는 아직 보고되지 않았다.
- , 2009)의 발현 변화를 비교하였다. 염처리 48시간까지의 시간대별 발현 변화를 분석한 결과, BrSSR은 스트레스 발생 초기에 염 저항성 유전자인 SOS 유전자군보다 더 민감하게 반응함으로써 염 스트레스와 밀접한 관련이 있는 유전자일 것으로 추정하였다(Fig. 3A). 하지만 BrSSR 내에 존재하는 보존 도메인 분석에서 BrSSR은 SOS 유전자군의 도메인과는 다른 종류의 도메인을 가지고 있었다.
- 2A), 이 정보를 바탕으로 RT-PCR 방법을 이용하여 순계배추(‘CT001’, 시원씨드, 경기도 평택)의 잎에서 BrSSR을 동정하였다. 이 BrSSR의 염기서열을 이용한 BlastX 분석 결과, 애기장대(A. thaliana)를 비롯하여 양구슬냉이(Camelina sativa), 산딸기(Fragaria vesca ), 오이(Cucumis sativus), 콩(Glycine max) 등과 75% 이상의 높은 아미노산 상동성을 가지는 것으로 확인되었으나, 각각의 작물에서 해당 유전자의 기능에 대해서는 아직 보고되어 있지 않았다(Fig. 2B). 한편, 약 530Mbp의 배추 게놈에서 공개된 2,026개 BAC clone을 이용하여 BrSSR의 위치를 확인한 결과, VCS3M_DH와 JWF3P genetic map에서는 아직 정확한 위치가 공개되어 있지는 않았지만 3번 염색체의 KBrB056I08 BAC clone(Genebank No.
- 이 결과들은 BrSSR의 과발현이 담배 형질전환체 및 ‘Chiifu’ 배추의 염 저항성을 향상시키는데 크게 관여하고 있음을 보여 주는 것이다.
- 한편, BrEMD에 제시된 ‘Chiifu’ 배추를 이용한 KBGP-24K microarray 분석에서도 염처리 12시간째부터 발현이 크게 증가하여 최대 3.5배까지 발현량이 증가하는 특징을 보였다(Fig. 3A).
- 2B). 한편, 약 530Mbp의 배추 게놈에서 공개된 2,026개 BAC clone을 이용하여 BrSSR의 위치를 확인한 결과, VCS3M_DH와 JWF3P genetic map에서는 아직 정확한 위치가 공개되어 있지는 않았지만 3번 염색체의 KBrB056I08 BAC clone(Genebank No. AC189399)에 속해져 있음을 확인하였다(National Agricultural Biotechnology Information Center, nabic.rda.go.kr).
후속연구
- 결론적으로 순계배추(‘Chiifu’)의 염 자극 시 3배 이상의 발현량 증가 및 염 스트레스 관련 유전자들인 SOS 유전자군과의 발현 비교 분석(BrEMD의 KBGP-24K microarray 분석), DUF581 domain 분석, 애기장대에서의 호르몬 및 기관발달 관련 연구보고, 그리고 최종적으로 실제 담배 형질전환체의 염 스트레스 시 표현형 분석을 종합하여 볼 때, BrSSR 유전자는 염 스트레스 발생 시 발현량의 증가를 통해 식물의 염 저항성 향상과 매우 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다. 아울러 본 연구 결과는 염 저항성 유전자인 BrSSR을 과발현시켜 실제 염 저항성이 우수한 배추 품종 육성의 가능성을 제시할 수 있으며, 더 나아가 배추 재배의 용이성 향상에도 기여할 수 있을 것이다.
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