[논문]EST로부터 개발된 SSR 마커를 이용한 상추 유전자원 및 유통품종의 식별

홍지화; 권용삼; 최근진; 김두환

doi:10.7235/hort.2013.13055

EST로부터 개발된 SSR 마커를 이용한 상추 유전자원 및 유통품종의 식별
Identification of Lettuce Germplasms and Commercial Cultivars Using SSR Markers Developed from EST 원문보기

원예과학기술지 = Korean journal of horticultural science & technology, v.31 no.6, 2013년, pp.772 - 781

홍지화 (농림축산식품부 국립종자원 재배시험과) , 권용삼 (농림축산식품부 국립종자원 재배시험과) , 최근진 (농림축산식품부 국립종자원 재배시험과) , (건국대학교 분자생명공학과) , 김두환 (건국대학교 분자생명공학과)

초록
AI-Helper

본 연구의 목적은 상추(Lactuca sativa)의 expressed sequence tag(EST)로부터 simple sequence repeat(SSR) 마커를 개발하고, 개발된 EST-SSR 마커를 이용하여 상추의 3가지 야생종의 유전자원 9점과 61개의 유통품종을 식별하는 것이다. NCBI 데이터베이스로부터 총 81,330개의 상추 EST를 대상으로 SSR을 탐색하였고, 총 4,229개의 SSR을 발견하였다. SSR의 반복 motif 중 trinucleotide(59.12%, 2,500개)가 가장 많았고, 그 다음으로 dinucleotide(29.70%, 1,256개), hexanucleotide(6.62%, 280개) 순의 분포를 나타내었다. EST로부터 총 474개의 EST-SSR primers를 개발하였고, 이 중 267개의 primer를 9점의 유전자원과 61품종에 대한 유전적 다양성 평가에 활용하였다. 267개의 마커 중 47개의 EST-SSR 마커가 7개 품종 내에서 다형성을 보였으며, 이 중 다형성 정도와 반복 재현성 및 밴드의 선명성을 고려하여 26개의 EST-SSR 마커를 선발하였다. 최종 선발된 26개의 SSR 마커를 이용하여 70개 공시재료를 분석한 결과 대립유전자 수는 총 127개였으며, 최소 2개에서 9개의 분포를 나타내었으며 마커당 평균 대립유전자 수는 4.88개를 나타내었다. PIC평균값은 0.542로 나타났으며, 0.269-0.768의 범위를 나타내었다. 70개 공시재료의 유전적 거리는 0.05-0.94로 나타났으며, 유사도 지수 0.34를 기준으로 할 때 7개의 주요 그룹으로 나누어졌다. 26개의 EST-SSR 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과 9점의 유전자원과 61개의 유통품종이 마커의 유전자형에 의해 모두 식별이 되었다. 본 연구를 통해 신규 개발된 EST-SSR 마커는 상추의 품종식별과 구별성, 균일성, 안정성 검정에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study was to develop simple sequence repeat (SSR) markers from expressed sequence tags (EST) of lettuce (Lactuca sativa) and identify 9 germplasms from 3 wild species of lettuce and 61 commercial cultivars using the developed EST-SSR markers. A total of 81,330 lettuce ESTs from NCBI databases were used to search for SSR and 4,229 SSR loci were identified. The highest proportion (59.12%, 2500) was represented by trinucleotide, followed by dinucleotide (29.70%, 1256) and hexanucleotide (6.62%, 280) among SSR repeat motifs. Totally 474 EST-SSR primers were developed from EST and a random set of 267 primers was used to assess the genetic diversity among 9 germplasms and 61 cultivars. Out of 267 primers, 47 EST-SSR markers showed polymorphism between 7 cultivars. Twenty-six EST-SSR markers among 47 EST-SSR markers showed high polymorphism, reproducibility, and band clearance. The relationship between 26 markers genotypes and 70 accessions was analyzed. Totally 127 polymorphic amplified fragments were obtained by 26 EST-SSR markers and two to nine SSR alleles were detected for each locus with an average of 4.88 alleles per locus. Average polymorphism information content was 0.542, ranging from 0.269 to 0.768. Genetic distance of clusters ranged from 0.05 to 0.94 between 70 accessions and dendrogram at a similarity of 0.34 gave 7 main clusters. Analysis of genetic diversity revealed by these 26 EST-SSR markers showed that the 9 germplasms and 61 commercial cultivars were discriminated by marker genotypes. These newly developed EST-SSR markers will be useful for cultivar identification and distinctness, uniformity and stability test of lettuce.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 상추의 품종보호 출원품종에 대한 효과적인 대조품종 선정과 품종보호 심사에 활용 가능성을 알아보기 위하여 상추 EST 데이터베이스로부터 SSR 마커를 개발하고, 이를 이용하여 상추 유전자원과 유통품종에 대한 식별력 및 유전적 다양성을 분석한 결과를 보고하는 바이다.
본 연구의 목적은 상추(Lactuca sativa)의 expressed sequence tag(EST)로부터 simple sequence repeat(SSR) 마커를 개발하고, 개발된 EST-SSR 마커를 이용하여 상추의 3가지 야생종의 유전자원 9점과 61개의 유통품종을 식별하는 것이다. NCBI 데이터베이스로부터 총 81,330개의 상추 EST를 대상으로 SSR을 탐색하였고, 총 4,229개의 SSR을 발견하였다.

제안 방법

상추 유전자원과 유통품종의 식별에 적합한 분자표지를 선발하고자 본 연구에서 개발된 EST-SSR 마커 중 267개의 마커를 대상으로 PCR을 수행 후 polyacrylamide gels에 전기영동한 다음 다형성 여부를 조사한 결과, 267개 마커 중 47개 마커가 ‘강풍적치마’ 등 7품종 내에서 다형성을 나타내었다. 1차로 선발된 다형성을 보이는 47개 마커 중 밴드 패턴이 선명하고, 반복 실험간 뚜렷한 재현성을 보이는 26개의 마커를 최종 선발하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET 중 한가지로 형광 표지한 다음 상추 유전자원 9점과 61품종에 대한 다형성 정도를 조사하였다(Table 4). 총 26개의 EST-SSR 마커에 의해 분석된 대립유전자의 수는 127개였으며, 대립유전자의 수는 마커별로 2-9개로 나타나, 마커당 평균 대립유전자의 수는 4.
2011년 7월 1일 기준으로 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 공개된 상추(L. sativa)의 81,330개 ESTs를 다운로드 받은 후 Contig Assembly Program version 3(CAP3) 프로그램(Huang and Madan, 1999)을 이용하여 염기서열을 배열한 후 microsatellite identification(MISA) 프로그램(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)을 활용하여 SSR을 포함하는 EST를 탐색하였다. 탐색 조건으로 염기 motif별로 최소 반복되는 수를 dinucleotide 6번, trinucleotide 5번, tetranucleotide 5번, pentanucleotide 4번, hexanucleotide 4번으로 설정하였다.
26개의 EST-SSR 마커를 이용하여 유전자원 9점과 상추 61품종에 대한 유전적 유사도를 분석하였다(Fig. 1). 공시재료의 유사도 지수는 0.
4μL의 PCR 증폭산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인한 후 증류수 220μL에 PCR 산물을 증폭량에 따라 1-3μL씩 첨가하였다.
sativa의 81,330개 EST sequences를 이용하였다. 81,330개의 EST에 대하여 CAP3 프로그램(Huang and Madan, 1999)을 이용하여 염기서열의 배열을 통해 41,609개의 singletons과 8,452개의 contigs를 조합하였다. 41,609개의 singletons EST 중 SSR motif를 포함하고 있는 EST를 찾기 위하여 MISA 프로그램(http://pgrc.
Table 4. Characterization of 26 polymorphic EST-SSR markers developed in this study.
PCR 반응은 게놈 DNA 20ng, 0.5μM의 SSR primer, 2μL dNTP mixture(2.5mM), Taq polymerase 1.0U, 2.5μL의 10×PCR buffer(50mM KCl, 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 2.0mM MgCl2)(Genet Bio, Korea)에 증류수를 첨가하여 총 반응액을 25μL로 조정하였다.
0mM MgCl₂)(Genet Bio, Korea)에 증류수를 첨가하여 총 반응액을 25μL로 조정하였다. PCR(C1000, BioRad, USA) 증폭은 40회 실시하며, pre-denaturation은 94℃에서 5분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 50-60℃에서 30초, extension은 72℃에서 45초, final-extension은 72℃에서 10분간 수행하였다. PCR을 통한 유전자 증폭 산물은 6% polyacrylamide gels을 이용하여 전기영동한 다음 silver sequence^TM staining reagents(Promega, USA)으로 염색하였고 각 품종별 밴드의 차이를 분석하여 다형성을 보이는 마커를 선발하였다.
PCR(C1000, BioRad, USA) 증폭은 40회 실시하며, pre-denaturation은 94℃에서 5분, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 50-60℃에서 30초, extension은 72℃에서 45초, final-extension은 72℃에서 10분간 수행하였다. PCR을 통한 유전자 증폭 산물은 6% polyacrylamide gels을 이용하여 전기영동한 다음 silver sequence^TM staining reagents(Promega, USA)으로 염색하였고 각 품종별 밴드의 차이를 분석하여 다형성을 보이는 마커를 선발하였다. 다형성을 보이는 마커 중 반복간 재현성이 높고 밴드가 선명한 마커를 선정한 후 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET 중 한가지로 형광 표지하여 마커 선발 시와 동일한 PCR 반응 및 조건을 이용하여 상추 유전자원 9점과 61품종을 PCR 하였다.
PCR을 통한 유전자 증폭 산물은 6% polyacrylamide gels을 이용하여 전기영동한 다음 silver sequence^TM staining reagents(Promega, USA)으로 염색하였고 각 품종별 밴드의 차이를 분석하여 다형성을 보이는 마커를 선발하였다. 다형성을 보이는 마커 중 반복간 재현성이 높고 밴드가 선명한 마커를 선정한 후 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET 중 한가지로 형광 표지하여 마커 선발 시와 동일한 PCR 반응 및 조건을 이용하여 상추 유전자원 9점과 61품종을 PCR 하였다. 4μL의 PCR 증폭산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인한 후 증류수 220μL에 PCR 산물을 증폭량에 따라 1-3μL씩 첨가하였다.
분리된 DNA는 분광광도계(NanoDrop2000, Thermo Scientific, USA)를 활용하여 DNA 농도를 확인한 후 μL당 20ng의 농도로 맞추어 PCR 분석에 사용하였다.
상추 유전자원과 유통품종의 식별에 효과적인 마커를 선발하기 위하여 본 연구에서 개발된 SSR primer를 이용하여 ‘강풍적치마’, ‘아이스레드’, ‘에보니블랙’, ‘탑그린’, ‘선풍 포찹적축면’, ‘치리벨’, ‘에이스’ 총 7품종을 대상으로 다형성을 분석하였다.
7) 프로그램(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 대립유전자 크기를 분석하였다. 자동염기서열 분석장치를 통해 분석된 대립유전자(피크)의 유무에 따라 유 = 1, 무 = 0로 기록하여 Microsoft Excel(Microsoft, USA) 파일에 공시재료에 대한 분자표지별 DNA 단편의 데이터베이스를 구축하였다.
최종 선발된 분자표지의 다형성 정도를 조사하기 위하여 아래의 공식을 이용하여 polymorphism information content(PIC) 값을 산출하였다. 아래 공식에서 P_ij는 마커 _i의 밴드들 중에서 _j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al.
de/misa/)을 활용하여 SSR을 포함하는 EST를 탐색하였다. 탐색 조건으로 염기 motif별로 최소 반복되는 수를 dinucleotide 6번, trinucleotide 5번, tetranucleotide 5번, pentanucleotide 4번, hexanucleotide 4번으로 설정하였다. 최종 탐색된 EST 유래 SSR에 대하여 Primer3 프로그램(Rozen and Skaletsky, 2000)을 이용하여 프라이머를 제작하였다.
4μL의 PCR 증폭산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 증폭 여부를 확인한 후 증류수 220μL에 PCR 산물을 증폭량에 따라 1-3μL씩 첨가하였다. 희석된 PCR 증폭 산물은 Hi-Di formamide와 size marker(LIZ500 size standard)를 첨가하여 94℃에서 2분간 denaturation시킨 후 자동염기서열 분석장치(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystem, USA)를 활용하여 전기영동하고, GeneMapper(version 3.7) 프로그램(Applied Biosystem, USA)을 이용하여 대립유전자 크기를 분석하였다. 자동염기서열 분석장치를 통해 분석된 대립유전자(피크)의 유무에 따라 유 = 1, 무 = 0로 기록하여 Microsoft Excel(Microsoft, USA) 파일에 공시재료에 대한 분자표지별 DNA 단편의 데이터베이스를 구축하였다.

대상 데이터

EST로부터 총 474개의 EST-SSR primers를 개발하였고, 이 중 267개의 primer를 9점의 유전자원과 61품종에 대한 유전적 다양성 평가에 활용하였다. 267개의 마커 중 47개의 EST-SSR마커가 7개 품종 내에서 다형성을 보였으며, 이 중 다형성 정도와 반복 재현성 및 밴드의 선명성을 고려하여 26개의 EST-SSR 마커를 선발하였다. 최종 선발된 26개의 SSR 마커를 이용하여 70개 공시재료를 분석한 결과 대립유전자 수는 총 127개였으며, 최소 2개에서 9개의 분포를 나타내었으며 마커당 평균 대립유전자 수는 4.
81,330개의 EST에 대하여 CAP3 프로그램(Huang and Madan, 1999)을 이용하여 염기서열의 배열을 통해 41,609개의 singletons과 8,452개의 contigs를 조합하였다. 41,609개의 singletons EST 중 SSR motif를 포함하고 있는 EST를 찾기 위하여 MISA 프로그램(http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)을 이용하여 분석한 결과 총 4,229개의 SSR을 탐색하였다(Table 2). 4,229개의 SSR의 반복 motif별 개수는 dinucleotide 1,256개, trinucleotide 2,500개, tetranucleotide 87개, pentanucleotide 106개, hexanucleotide 280개를 나타내어 trinucleotide가 59.
62%, 280개) 순의 분포를 나타내었다. EST로부터 총 474개의 EST-SSR primers를 개발하였고, 이 중 267개의 primer를 9점의 유전자원과 61품종에 대한 유전적 다양성 평가에 활용하였다. 267개의 마커 중 47개의 EST-SSR마커가 7개 품종 내에서 다형성을 보였으며, 이 중 다형성 정도와 반복 재현성 및 밴드의 선명성을 고려하여 26개의 EST-SSR 마커를 선발하였다.
본 연구의 목적은 상추(Lactuca sativa)의 expressed sequence tag(EST)로부터 simple sequence repeat(SSR) 마커를 개발하고, 개발된 EST-SSR 마커를 이용하여 상추의 3가지 야생종의 유전자원 9점과 61개의 유통품종을 식별하는 것이다. NCBI 데이터베이스로부터 총 81,330개의 상추 EST를 대상으로 SSR을 탐색하였고, 총 4,229개의 SSR을 발견하였다. SSR의 반복 motif 중 trinucleotide(59.
공시재료 중 유전자원은 국립원예특작과학원으로부터 상추 야생종인 L. serriola, L. saligna 및 L. virosa의 유전자원 9점을 분양 받아 활용하였으며, 유통품종은 국립종자원 재배 시험과 및 동부지원에 보관된 61품종을 분석을 위한 재료로 활용하였다(Table 1).
공시품종의 DNA는 NucleoSpin®PlantII (Macherey-Nagel Cat. 740 770.250) 키트를 이용하여 분리하였다.
상추의 EST 유래 SSR 마커를 개발하기 위하여 NCBI의 EST 데이터베이스로부터 L. sativa의 81,330개 EST sequences를 이용하였다. 81,330개의 EST에 대하여 CAP3 프로그램(Huang and Madan, 1999)을 이용하여 염기서열의 배열을 통해 41,609개의 singletons과 8,452개의 contigs를 조합하였다.

데이터처리

탐색 조건으로 염기 motif별로 최소 반복되는 수를 dinucleotide 6번, trinucleotide 5번, tetranucleotide 5번, pentanucleotide 4번, hexanucleotide 4번으로 설정하였다. 최종 탐색된 EST 유래 SSR에 대하여 Primer3 프로그램(Rozen and Skaletsky, 2000)을 이용하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머 제작 조건으로 PCR 산물의 크기는 100-300bp, annealing 온도는 50-60℃(적정 55℃), GC%는 50-60%(적정 55%), 프라이머 길이는 18-27bp이였다.

이론/모형

공시품종의 유전적 다양성을 분석하기 위하여 NTSYSpc(version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램의 Jaccard 방법에 따라 유전적 유사도 값을 계산한 후 UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetical average)(Sneath and Sokal, 1973) 방법을 통해 덴드로그램을 작성하였다.

성능/효과

34를 기준으로 할 때 7개의 주요 그룹으로 나누어졌다. 26개의 EST-SSR 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과 9점의 유전자원과 61개의 유통품종이 마커의 유전자형에 의해 모두 식별이 되었다. 본 연구를 통해 신규 개발된 EST-SSR 마커는 상추의 품종식별과 구별성, 균일성, 안정성 검정에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
de/misa/)을 이용하여 분석한 결과 총 4,229개의 SSR을 탐색하였다(Table 2). 4,229개의 SSR의 반복 motif별 개수는 dinucleotide 1,256개, trinucleotide 2,500개, tetranucleotide 87개, pentanucleotide 106개, hexanucleotide 280개를 나타내어 trinucleotide가 59.12%로 가장 많은 분포를 나타내었고 그 다음으로 dinucleotide 29.70%, hexanucleotide 6.62%, pentanucleotide 2.51%, tetranucleotide 2.06%의 분포를 나타내었다. SSR motif별 빈도의 경우 dinucleotide를 가지는 주요 motif는 TC 6.
EST의 SSR flanking 부분을 증폭하기 위하여 3,906개의 SSR에 대하여 프라이머를 제작한 결과 총 474개의 프라이머의 제작이 가능한 것으로 분석되었다. 제작된 474개의 프라이머 중 dinucleotide 176개, trinucleotide 69개, tetranucleotide 1개, pentanucleotide 2개, compound formation 226개로 나타났다.
15% 순으로 조사되었다. Trinucleotide의 주요 motif는 GAT 4.30%, GGT 4.11%, GAA 3.38%, TGA 2.72% 순으로 나타났으며, tetranucleotide의 주요 motif는 ATCA 0.19%, TGAA/TTTA 0.14% 순으로 나타났다(Table 3). 이러한 연구결과는 EST 유래 SSR 마커를 개발하였을 때 trinucleotide와 dinucleotide가 높은 빈도로 출현함을 보고한 Simko(2009)의 연구결과를 확인할 수 있었다.
공시품종 중 육성내역이 알려진 상추 품종에 대한 유전적 유사도를 살펴보면, ‘조아라’는 적색이 우수한 계통인 ‘KN97301’과 ‘열풍적치마’의 교배로 육성되었으며, ‘조아라’와 ‘열풍적치마’의 유사도는 0.68로 조사되었다.
virosa(PI271739, PI273597, PI274901)는 제 VI그룹과 VII그룹에 포함되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 분자표지를 활용하여 상추 유전자원 9점과 61개 유통품종을 분석하여 군집 분석하였을 때 유전적 유사도에 따라 유전자원인 PI계통과 국내 유통품종으로 크게 대별되었으며 상추 유통품종의 경우 결구형태, 잎색깔, 잎몸의 엽절 여부에 따라 그룹화되는 것으로 나타났으며 분자표지에 의해 공시재료가 모두 식별이 되었다. 잎상추는 색깔에 상관없이 두 개의 그룹을 형성한 것으로 보고된 바 있어(Simko, 2009) 본 연구 결과와 상이한 경향을 나타내었다.
본 연구에 이용된 품종 중에서 ‘열풍적치마’/‘열강적치마’, ‘핫레드’/‘루벨라2호’, ‘루벨라’/‘레드선적축면’, ‘선풍2호’/‘뚝섬적축면’, ‘홍풍치마’/‘단풍적치마’,‘무적여름흑치마’/‘선조흑치마’, ‘부띠끄’/‘유레이크’ 품종의 유사도는 0.90 이상으로 이들 품종들은 적색 치마상추, 적색축면상추, 흑색 치마상추, 결구 상추끼리 유사도가 높게 분석되어 일반적으로 인식되는 상추의 형태적 특성과 유사한 양상을 나타내었다.
virosa 순으로 유사도가 높다고 Rauscher and Simko(2013)에 의해 알려진 바 있다. 본 연구에 활용된 L. saligna, L. serriola 유전자원의 경우 하나의 그룹으로 그룹핑되어 두 가지 종과 L. sativa의 유사도를 비교할 수는 없지만, L. virosa와는 유사도가 낮게 분석된 점은 기존의 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다.
본 연구에서는 상추 EST로부터 SSR 마커를 개발하고 이를 활용하여 상추 유전자원과 국내 유통품종을 대상으로 자동염기서열분석기를 이용하여 정밀도 높은 유전자 분석을 하였을 때 공시된 유전자원과 유통품종이 분자표지에 의해 구분됨을 확인할 수 있었다. 향후 이 결과를 활용하여 형태적 특성 결과와 분자표지와 특성과의 상관관계가 구체적으로 밝혀 진다면 상추 품종보호 출원품종의 대조품종 선정과 품종보호 침해 또는 종자분쟁 발생시에 이를 해결할 수 있는 근거자료로 매우 유용하게 활용될 것이며, 본 연구를 통해 개발된 마커는 상추의 유전자 지도 작성 및 분자육종 등의 다양한 분야에도 효과적으로 활용될 것으로 기대된다.
상추 유전자원과 유통품종의 식별에 적합한 분자표지를 선발하고자 본 연구에서 개발된 EST-SSR 마커 중 267개의 마커를 대상으로 PCR을 수행 후 polyacrylamide gels에 전기영동한 다음 다형성 여부를 조사한 결과, 267개 마커 중 47개 마커가 ‘강풍적치마’ 등 7품종 내에서 다형성을 나타내었다.
37에서 청색상추군(III-1)과 흑색상추군(III-2)으로 재구분하였다. 제IV그룹에는 결구상추 8품종, 로메인 상추 2품종 및 청색 잎상추 2품종이 그룹화되었으며, 제V그룹에는 상추 야생종인 L. saligna(PI251798, PI253229, PI258813)와 L. serriola(PI251245, PI251246, PI251247)가 속하였으며, L. virosa(PI271739, PI273597, PI274901)는 제 VI그룹과 VII그룹에 포함되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 분자표지를 활용하여 상추 유전자원 9점과 61개 유통품종을 분석하여 군집 분석하였을 때 유전적 유사도에 따라 유전자원인 PI계통과 국내 유통품종으로 크게 대별되었으며 상추 유통품종의 경우 결구형태, 잎색깔, 잎몸의 엽절 여부에 따라 그룹화되는 것으로 나타났으며 분자표지에 의해 공시재료가 모두 식별이 되었다.
EST의 SSR flanking 부분을 증폭하기 위하여 3,906개의 SSR에 대하여 프라이머를 제작한 결과 총 474개의 프라이머의 제작이 가능한 것으로 분석되었다. 제작된 474개의 프라이머 중 dinucleotide 176개, trinucleotide 69개, tetranucleotide 1개, pentanucleotide 2개, compound formation 226개로 나타났다. 프라이머 제작 조건에 맞지 않는 SSR과 SSR의 앞뒤 말단에 염기서열이 짧은 경우 프라이머 제작이 되지 않은 것으로 사료되며 이러한 연구결과는 Van de Wiel et al.
1차로 선발된 다형성을 보이는 47개 마커 중 밴드 패턴이 선명하고, 반복 실험간 뚜렷한 재현성을 보이는 26개의 마커를 최종 선발하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET 중 한가지로 형광 표지한 다음 상추 유전자원 9점과 61품종에 대한 다형성 정도를 조사하였다(Table 4). 총 26개의 EST-SSR 마커에 의해 분석된 대립유전자의 수는 127개였으며, 대립유전자의 수는 마커별로 2-9개로 나타나, 마커당 평균 대립유전자의 수는 4.88개로 나타났다. 총26개 마커별로 유전적 다양성 정도를 나타내 주는 PIC 값의 분포는 0.
88개로 나타났다. 총26개 마커별로 유전적 다양성 정도를 나타내 주는 PIC 값의 분포는 0.269-0.768이였으며, 평균 PIC 값은 0.542로 조사되었다(Table 4). SSR 마커를 이용한 상추의 대립유전자의 수 및 PIC값에 대한 연구 결과로 Van de Wiel et al.
267개의 마커 중 47개의 EST-SSR마커가 7개 품종 내에서 다형성을 보였으며, 이 중 다형성 정도와 반복 재현성 및 밴드의 선명성을 고려하여 26개의 EST-SSR 마커를 선발하였다. 최종 선발된 26개의 SSR 마커를 이용하여 70개 공시재료를 분석한 결과 대립유전자 수는 총 127개였으며, 최소 2개에서 9개의 분포를 나타내었으며 마커당 평균 대립유전자 수는 4.88개를 나타내었다. PIC 평균값은 0.
특히 ‘무적여름흑치마’와 ‘선조흑치마’는 유사도가 0.94로 가장 높게 분석되었는데 두 품종을 재배시험을 통해 형태적 특성을 조사한 결과 형태적으로도 매우 유사한 것으로 조사되었다.

후속연구

94로 가장 높게 분석되었는데 두 품종을 재배시험을 통해 형태적 특성을 조사한 결과 형태적으로도 매우 유사한 것으로 조사되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 26개의 분자표지와 국립종자원 상추 특성조사 요령에 따라 기 공시된 품종의 형태적 특성이 정밀하게 조사되어, 분자표지와 형태적 특성과의 상관관계가 구체적으로 밝혀진다면, 국내외 유통되고 있는 상추 품종의 관리와 품종보호 출원품종에 대한 새로운 심사기법 개발 등의 분야에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
26개의 EST-SSR 마커를 이용한 유전적 다양성 분석 결과 9점의 유전자원과 61개의 유통품종이 마커의 유전자형에 의해 모두 식별이 되었다. 본 연구를 통해 신규 개발된 EST-SSR 마커는 상추의 품종식별과 구별성, 균일성, 안정성 검정에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
virosa 종으로의 마커 증폭율이 각각 100%, 87%, 75%인 것으로 보고된 바 있다(Simko, 2009). 본 연구에서 최종 선발된 L. sativa의 EST 유래 SSR 마커도 야생종인 L. saligna, L. serriola, L. virosa에서 특이적인 증폭 산물을 얻을 수 있는 것으로 나타나 향후 상추 야생종의 유전적 다양성 분석에도 효과적일 것이라 판단된다. 또한 EST-SSR 마커는 genomic-SSR 마커에 비해 PCR 증폭반응이 안정적일 뿐만 아니라 밴드 또한 선명하기 때문에 다형성이 높은 마커를 선발한다면 보다 정밀도 높은 품종 지문화에 효과적인 것으로 보고된 바 있는데(Leigh et al.
, 2010). 상추의 경우 genomic library 유래 SSR 마커와 EST 유래 SSR 마커를 개발하여 다양성 분석에 활용한 바 있으나(Simko, 2009; Van de Wiel et al., 1999), 기 개발된 마커가 제한적이며 재배종인 L. sativa로부터 개발된 EST-SSR 마커 정보가 부족하여 비교적 유전적 다양성이 협소할 것으로 추정되는 국내 유통품종에 대한 품종식별을 위해서는 추가적인 분자표지 개발과 품종식별을 위한 체계적인 연구가 필요한 것으로 판단되었다.
청색 잎상추인 ‘뚝섬청축면’, ‘그랜드래피드TBR’품종은 청색상추군에 포함되지 않고, 결구상추군에 포함되었는데, 두 품종의 육성에 활용된 유전자원에 대한 정확한 정보가 추가적으로 필요할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 상추 EST로부터 SSR 마커를 개발하고 이를 활용하여 상추 유전자원과 국내 유통품종을 대상으로 자동염기서열분석기를 이용하여 정밀도 높은 유전자 분석을 하였을 때 공시된 유전자원과 유통품종이 분자표지에 의해 구분됨을 확인할 수 있었다. 향후 이 결과를 활용하여 형태적 특성 결과와 분자표지와 특성과의 상관관계가 구체적으로 밝혀 진다면 상추 품종보호 출원품종의 대조품종 선정과 품종보호 침해 또는 종자분쟁 발생시에 이를 해결할 수 있는 근거자료로 매우 유용하게 활용될 것이며, 본 연구를 통해 개발된 마커는 상추의 유전자 지도 작성 및 분자육종 등의 다양한 분야에도 효과적으로 활용될 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	채소작물의 품종보호 등록할 때 어떤 문제가 종종 발생하는가?	상추의 신품종이 품종보호 등록이 되기 위해서는 구별성(distinctness, D), 균일성(uniformity, U), 안정성(stability, S)의 3가지 DUS 요건을 충족해야 되는데, 재배시험 수행 시 가장 중요하고 어려운 부분이 출원품종과 형태적으로 가장 유사한 대조품종을 선정하는 것이다. 또한 채소작물의 경우 2년간(또는 2작기) 재배시험이 수행되며, 재배 환경의 영향을 받는 양적형질의 경우 특성조사에 의해 구별성을 판단하기가 어려운 문제가 종종 발생한다. 그러나 분자표지는 재배환경의 영향을 받지 않고 DNA 수준에서 품종간 유전자형을 비교할 수 있으며 많은 품종에 대한 DNA profile 데이터베이스 구축을 통하여 출원품종의 대조품종 선정 등에 활용 가능성을 알아볼 수 있다.
	상추는 무엇인가?	상추(Lactuca sativa L.)는 국화과(Asteraceae), Lactuca속에 속하며 전세계적으로 다양한 형태의 식물 그룹들이 분포되어 있다(Funk et al., 2005).
	상추는 어떻게 분류되는가?	, 2007). 상추는 결구여부, 잎의 형태 등의 형태적인 특성에 따라 결구, 버터헤드, 코스 또는 로메인, 잎, 줄기, 라틴, 기름으로 이용되는 상추로 분류한다(Kristkova et al., 2008).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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