[논문]유제품과 육제품에서 황색포도상구균 신속검출을 위한 PCR법의 비교검증

김홍석; 천정환; 김동현; 송광영; 서건호

doi:10.9721/kjfst.2013.45.6.791

유제품과 육제품에서 황색포도상구균 신속검출을 위한 PCR법의 비교검증
Evaluation of a PCR Assay for the Rapid Detection of Staphylococcus aureus in Milk and Meat Products 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.45 no.6, 2013년, pp.791 - 795

김홍석 (건국대학교 KU 식품안전연구소) , 천정환 (건국대학교 KU 식품안전연구소) , 김동현 (건국대학교 KU 식품안전연구소) , 송광영 (건국대학교 KU 식품안전연구소) , 서건호 (건국대학교 KU 식품안전연구소)

초록
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본 연구에서는 유제품 및 육제품에서 Staphylococcus aureus를 검출하기 위한 PCR과 배지배양법을 비교검증 하였다. 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육에 S. aureus를 인위적으로 접종시킨 후, 축산물 가공기준 및 성분규격에 따라 10% NaCl이 첨가된 tryptic soy broth(TSB)에서 증균배양 하였으며, Baird Parker agar에 선택배양 하였다. PCR은 TSB에서 1 mL를 채취한 후 DNA를 추출하여 시행하였으며, S. aureus의 23s rRNA를 표적으로 하는 primer를 사용하였다. 의심집락에 대해 coagulase test와 colony PCR을 통한 확인시험을 실시하였다. 실험결과 우유와 분유에서는 배지배양법과 PCR간에 통계학적 유의차가 존재하지 않았다. 소시지와 소고기 분쇄육의 경우에는 PCR이 배지법에 비해 더 많은 양성을 검출하여 높은 통계학적 유의차를 보였다(p<0.05). 연구결과를 종합하면, 유제품 및 육제품에서 PCR을 통한 S. aureus의 검출은 기존 배지배지배양법에 비해 시간과 노동력을 절감할 수 있는 효과적인 방법으로 나타났다.

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to compare the performance of a standard culture method and polymerase chain reaction (PCR) for the detection of Staphylococcus aureus (S. aureus) in milk and meat products. Milk, dried infant formula, sausage and ground beef that had been artificially inoculated with S. aureus were enriched in tryptic soy broth. After the enrichment, a loopful was inoculated onto Baird-Parker agar with egg-yolk-tellurite. In parallel, 23S rRNA was amplified by PCR from samples of the enriched broth. Suspected S. aureus colonies grown on selective agars were finally confirmed by a coagulase test and colony PCR. No significant statistical differences were observed between the incidence of S. aureus detected by the culture method and the incidence detected by PCR, in milk or dried infant formula. However, in sausage and ground beef, the number of positives detected by PCR was significantly higher than by the culture method (p<0.05). Our findings suggest that PCR could be an effective screening tool for the detection of S. aureus compared to the standard culture method.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 유제품 및 육제품에서 Staphylococcus aureus를 검출하기 위한 PCR과 배지배양법을 비교검증 하였다. 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육에 S.

가설 설정

1)Different letters within a row indicate a significant difference (*p<0.05, **p<0.01).
1)Different letters within a row indicate a significant difference (p<0.05).
모든 실험에서 시료의 음성 및 양성 대조군은 배지배양법과 PCR에서 결과가 모두 음성과 양성으로 나타나 사용된 시료 및 실험방법이 적합했음을 보여주었다. 또한 음성 대조군이 적절하게 나왔으므로 사용된 식품들은 자연적으로 오염된 시료가 없었고 위양성의 가능성은 배제되었다고 가정하였다. 유제품과 육제품 모두에서 coagulase와 colony PCR 확인 시험 비교 결과 두 방법 모두 동일하게 양성으로 검출되어 두 방법 간에 차이가 없었다(자료 미제시).

제안 방법

최종적으로 Staphytect Plus (Oxoid)를 이용한 coagulase 확인 시험을 통해 양성여부를 판정하였다. Coagulase 양성으로 확인된 균주들을 추후 colony PCR법으로 재확인하여 두 확인시험 결과를 비교하였다.
PCR 수행을 위해 추출한 DNA 1 µL를 각각 1 µM 농도의 forward/reverse primer와 함께 Maxime PCR premix (Intron Biotechnology, Sungnam, South Korea)에 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL가 되도록 하였다.
aureus를 인위적으로 접종시킨 후, 축산물 가공기준 및 성분규격에 따라 10% NaCl이 첨가된 tryptic soy broth(TSB)에서 증균배양 하였으며, Baird Parker agar에 선택배양 하였다. PCR은 TSB에서 1 mL를 채취한 후 DNA를 추출하여 시행하였으며, S. aureus의 23s rRNA를 표적으로 하는 primer를 사용하였다. 의심집락에 대해 coagulase test와 colony PCR을 통한 확인시험을 실시하였다.
S. aureus의 식품 내 접종 실험은 통계학적 유의차를 비교할 수 있도록, 20개의 시료(각 25 g씩)에서 부분적인 양성과 음성을 일으킬 수 있는 적정한 수의 균을 접종하여 수행하였다. 추가적으로 50 g을 준비하여 각각 25 g씩 음성 및 양성 대조군으로 사용하였으며, 음성에는 1 mL의 PBS를, 양성에는 10⁷ CFU/g 이상의 균을 접종하였다.
PCR 수행을 위해 추출한 DNA 1 µL를 각각 1 µM 농도의 forward/reverse primer와 함께 Maxime PCR premix (Intron Biotechnology, Sungnam, South Korea)에 혼합하였으며 최종 용량은 20 µL가 되도록 하였다. T-Personal Thermocycler (Biometra, Goettingen, Germany)를 사용하여 PCR을 수행하였으며, 각 PCR 조건은 선행 연구들을 참조하여 제조사(Intron Biotechnology)의 지시에 따라 각 단계별 시간을 최적화하였다(Table 1).
대표적인 축산식품들 중 각 성상을 고려하여 유제품에 해당하는 우유와 분유, 육제품에 해당하는 소시지와 소고기 분쇄육을 시료로 선정하여 실험을 실시하였으며 모든 식품시료는 2012년 6월부터 8월까지 광진구에 위치한 대형마트에서 구매하였다. 각 식품 내 상재균이 목적균의 성장에 영향을 준다는 선행 연구들을 참고하여(20,21), 접종 전 호기성 상재균 수를 측정하였다. 각 식품 시료 25 g 또는 25 mL에 buffered peptone water (BPW, Difco) 225 mL를 첨가하고 BagMixer stomacher (Interscience)을 이용하여 30초간 균질화 한 후, 100 µL를 취해 10배수로 희석한 희석액을 NA에 도말하여 37°C에서 24시간 배양하여 호기성 상재균 수를 측정하였다.
각 식품 시료 25 g 또는 25 mL에 buffered peptone water (BPW, Difco) 225 mL를 첨가하고 BagMixer stomacher (Interscience)을 이용하여 30초간 균질화 한 후, 100 µL를 취해 10배수로 희석한 희석액을 NA에 도말하여 37°C에서 24시간 배양하여 호기성 상재균 수를 측정하였다.
aureus의 효과적인 검출을 위해 23S rRNA, nuc, femA를 표적 유전자(target gene)로 사용하여 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육에서 특이성 및 검출한계를 비교검증하였다. 검증 결과, 가장 우수한 검출능력을 보인 primer를 선정하여, 각 식품에 S. aureus를 인위접종한 후 PCR법과 배지배양법의 검출능력을 비교하여 검증하였다. 한편, 배지 배양법에서 S.
따라서 본 연구에서는 S. aureus의 효과적인 검출을 위해 23S rRNA, nuc, femA를 표적 유전자(target gene)로 사용하여 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육에서 특이성 및 검출한계를 비교검증하였다. 검증 결과, 가장 우수한 검출능력을 보인 primer를 선정하여, 각 식품에 S.
희석액은 희석단계별로 100 µL를 NA에 도말하여 37°C에서 24시간 배양 후, 균 수를 계산하였다. 또한 식품에 접종시의 검출한계를 알아보기 위하여 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육 각각에 10배수로 단계별 희석한 S. aureus 배양액 1 mL를 접종하고, 10% NaCl TSB 90 mL를 넣어 BagMixer stomacher (Interscience, Saint Nom, France)를 이용하여 상온에서 30초간 균질화하였다. 이들을 각각 1 mL씩 취하여 위에서 언급한 바와 같이 DNA를 추출하고 PCR을 수행하였다.
증균 배양액을 선택배지인 egg-yolk-tellurite (50 mL/L, Oxoid, Basingstoke England)를 첨가한 BP agar (Oxoid)에 획선 도말하여 37°C에서 24시간 배양하였다. 또한 증균 배양액 중 1 mL를 취해 위에서 언급한 바와 동일한 방법으로 DNA를 추출하고 PCR법을 통해 양성여부를 판정하였다. 식품 내 인위접종을 통한 S.
순수 배양액 또는 식품 시료에서의 배양액 1 mL을 취해 16,000×g로 3분간 원심분리하여 상층액을 버린 후, 각각의 pellet에 200 µL의 PrepManTM Ultra reagent (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 첨가하였다.
순수 배양액에서 검출한계를 알아보기 위하여 10% NaCl TSB 에서 37°C에서 24시간 배양된 S. aureus 배양액 1 mL를 멸균된 PBS 9 mL에 10배수로 희석하였다.
선정한 세 가지 표적유전자에 대한 PCR법의 검출한계를 알아보기 위하여 Lee 등(20)의 연구를 참조하여 검출한계를 분석하였다. 순수 배양액의 검출한계와 식품에서의 검출한계를 알아보기 위하여 나누어 실험을 실시하였다. 순수 배양액에서 검출한계를 알아보기 위하여 10% NaCl TSB 에서 37°C에서 24시간 배양된 S.
또한 증균 배양액 중 1 mL를 취해 위에서 언급한 바와 동일한 방법으로 DNA를 추출하고 PCR법을 통해 양성여부를 판정하였다. 식품 내 인위접종을 통한 S. aureus의 검출은 검출한계 검사에서 가장 높은 민감도를 보인 primer로만 PCR이 진행되었다.
접종 후 모든 시료는 실제 식품 시료 보관 환경과 유사하게 4°C에서 18-24시간 동안 보관하는 안정화 과정을 거쳤다(22,23). 식품접종과 동시에 실제 접종된 S. aureus의 수를 측정하기 위해 접종에 사용된 양과 동일한 균량을 적절히 희석한 후 NA에 도말하여 균수를 산정하였다.
안정화를 마친 500 g의 시료를 25 g씩 20개로 나누어 225 mL의 10% NaCl TSB와 함께 넣은 다음 stomacher를 이용하여 30초간 균질화 하고 37°C에서 24시간 증균 배양하였으며, 음성 및 양성 대조군도 동일한 과정을 거쳤다.
본 연구에서는 유제품 및 육제품에서 Staphylococcus aureus를 검출하기 위한 PCR과 배지배양법을 비교검증 하였다. 우유, 분유, 소시지, 소고기 분쇄육에 S. aureus를 인위적으로 접종시킨 후, 축산물 가공기준 및 성분규격에 따라 10% NaCl이 첨가된 tryptic soy broth(TSB)에서 증균배양 하였으며, Baird Parker agar에 선택배양 하였다. PCR은 TSB에서 1 mL를 채취한 후 DNA를 추출하여 시행하였으며, S.
반면, 23S rRNA의 경우 크림에서 검출한계가 10³ CFU/mL 수준으로 보고되어(13), 본 연구 중 성상이 유사한 유제품들에서의 검출한계와 비교적 큰 차이를 보이지 않았다. 위의 결과를 토대로 볼 때 세 가지 primer의 특이도는 모두 동일했으나 본 실험 방법에서 민감도는 23S rRNA primer가 가장 높은 결과를 보여주어 추후 PCR 기법과 coagulase법 및 배지기법과의 비교시험에 이 primer를 사용하였다.
aureus의 23s rRNA를 표적으로 하는 primer를 사용하였다. 의심집락에 대해 coagulase test와 colony PCR을 통한 확인시험을 실시하였다. 실험결과 우유와 분유에서는 배지배양법과 PCR간에 통계학적 유의차가 존재하지 않았다.
aureus 배양액 1 mL를 접종하고, 10% NaCl TSB 90 mL를 넣어 BagMixer stomacher (Interscience, Saint Nom, France)를 이용하여 상온에서 30초간 균질화하였다. 이들을 각각 1 mL씩 취하여 위에서 언급한 바와 같이 DNA를 추출하고 PCR을 수행하였다.
선택배지에서의 배양이 끝난 후 투명한 환으로 둘러싸인 검은 광택이 나는 양성 의심 집락을 NA에서 계대배양하였다. 최종적으로 Staphytect Plus (Oxoid)를 이용한 coagulase 확인 시험을 통해 양성여부를 판정하였다. Coagulase 양성으로 확인된 균주들을 추후 colony PCR법으로 재확인하여 두 확인시험 결과를 비교하였다.
aureus의 식품 내 접종 실험은 통계학적 유의차를 비교할 수 있도록, 20개의 시료(각 25 g씩)에서 부분적인 양성과 음성을 일으킬 수 있는 적정한 수의 균을 접종하여 수행하였다. 추가적으로 50 g을 준비하여 각각 25 g씩 음성 및 양성 대조군으로 사용하였으며, 음성에는 1 mL의 PBS를, 양성에는 10⁷ CFU/g 이상의 균을 접종하였다. 접종 후 모든 시료는 실제 식품 시료 보관 환경과 유사하게 4°C에서 18-24시간 동안 보관하는 안정화 과정을 거쳤다(22,23).
표준 시험법인 배지법을 사용한 S. aureus의 검출은 축산물 가공기준 및 성분 규격에 제시되어 있는 정성 시험방법을 사용하여 실험을 실시하였다(3). 안정화를 마친 500 g의 시료를 25 g씩 20개로 나누어 225 mL의 10% NaCl TSB와 함께 넣은 다음 stomacher를 이용하여 30초간 균질화 하고 37°C에서 24시간 증균 배양하였으며, 음성 및 양성 대조군도 동일한 과정을 거쳤다.
aureus를 인위접종한 후 PCR법과 배지배양법의 검출능력을 비교하여 검증하였다. 한편, 배지 배양법에서 S. aureus 의심집락에 대해 확인동정법으로 사용되는 coagulase test의 효율성을 colony PCR법과 비교하는 검증시험도 동시에 수행하였다.

대상 데이터

aureus (ATCC 6538, PH SEA-SEE, PH M 1-10, PH F 1-7)와 4종의 non-S. aureus (S. vitulinus, S. sciuri, S. warneri, S. saprophyticus) 및 11종의 non-Staphylococcus (Bacillus cereus ATCC 1475, Campylobacter jejuni NCTC 11168, C. coli ATCC 33559, Clostridium perfringens ATCC 8238, Cronobacter Sakazakii, Enterococcus faecium ATCC 70021, E. faecalis ATCC 51299, Escherichia coli ATCC 11775, Listeria monocytogenes ATCC 51776, Salmonella spp.)가 사용되었다. 표준균주를 제외한 균주는 모두 식품분리 균주로서 KU식품안전연구소에서 보유하고 있는 것을 사용하였으며, 식품에 접종하기 위해 사용된 S.
대표적인 축산식품들 중 각 성상을 고려하여 유제품에 해당하는 우유와 분유, 육제품에 해당하는 소시지와 소고기 분쇄육을 시료로 선정하여 실험을 실시하였으며 모든 식품시료는 2012년 6월부터 8월까지 광진구에 위치한 대형마트에서 구매하였다. 각 식품 내 상재균이 목적균의 성장에 영향을 준다는 선행 연구들을 참고하여(20,21), 접종 전 호기성 상재균 수를 측정하였다.
표준검출법인 배지배양법의 coagulase 확인시험은 비가공식품의 경우 위양성 결과가 많이 나올 수 있어 colony PCR 같은 확인시험으로의 개선이 필요하다는 보고가 있으나(20), 본 연구에서는 비가공식품인 소고기 분쇄육을 포함한 모든 식품에서 coagulase와 colony PCR 확인시험의 결과가 동일하게 나타났다(Table 4). 본 연구에서 사용된 선택배지인 Baird Parker agar의 검출대상은 coagulase positive staphylococci로, 시료에 존재하는 자연감염균의 종류 및 오염정도에 따라 위양성 집락이 나타날 수 있으며, 그로 인해 S. aureus의 최종 검출률이 달라질 수 있다고 보고되어 있다(25,26). 같은 비가공식품이더라도 앞선 연구의 생 돼지고기와 야채 샐러드가 본 연구의 소고기 분쇄육보다 non-aureus coagulase positive staphylococci의 오염정도가 높았을 것으로 사료된다.
)가 사용되었다. 표준균주를 제외한 균주는 모두 식품분리 균주로서 KU식품안전연구소에서 보유하고 있는 것을 사용하였으며, 식품에 접종하기 위해 사용된 S. aureus는 표준균주인 ATCC 6538을 사용하였다. 영하 70°C에 냉동보관되어 있던 균주를 해동한 뒤 nutrient agar(NA; Difco, Detroit, MI, USA)에 획선도말(streaking)하여 37°C에서 24시간 동안 배양하였다.

데이터처리

각 식품별로 2반복 실험을 수행한 후, GraphPad Instat (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 통계분석을 실시하였으며 Fisher’s exact test로 양성 검출률의 통계학적인 유의차(p<0.05)를 분석하였다.

이론/모형

배양액에서의 DNA 추출은 Seo 와 Brackett(19)의 방법으로 하였으며 자세한 방법은 다음과 같다. 순수 배양액 또는 식품 시료에서의 배양액 1 mL을 취해 16,000×g로 3분간 원심분리하여 상층액을 버린 후, 각각의 pellet에 200 µL의 PrepMan^TM Ultra reagent (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 첨가하였다.
선정한 세 가지 표적유전자에 대한 PCR법의 검출한계를 알아보기 위하여 Lee 등(20)의 연구를 참조하여 검출한계를 분석하였다. 순수 배양액의 검출한계와 식품에서의 검출한계를 알아보기 위하여 나누어 실험을 실시하였다.

성능/효과

PCR법과 배지배양법의 비교 결과는 유제품과 육제품에서 차이를 보였다(Table 3, Table 4). 유제품인 우유의 경우 PCR법을 사용한 신속검사 결과 34개의 양성이 검출되어 위 두 확인시험법과 1개의 시료에서 차이가 있었지만 PCR법과 배지배양법간의 통계학적 유의차는 없었으며, 분유의 경우 각 방법에서 모두 12개의 양성이 검출되어 동일한 결과를 나타내었다.
8×10⁴ CFU/mL까지 검출이 가능하여 차이를 보였다. femA를 표적으로 했을 때는 모든 식품에서 민감도가 낮았으며, 특히 소고기 분쇄육에서 가장 큰 차이를 보였다(Table 2).
각 primer 서열이 발표된 앞선 연구들에서 각 표적유전자들에 대한 검출한계는 순수배양액에서 nuc의 경우 10² CFU/mL 이하(24), femA의 경우 10² CFU/mL 수준으로(12) 본 연구에서 도출된 검출한계보다 약 100배가량 높은 민감도를 보였다. 이 같은 차이는 본 연구에서 S.
또한 같은 육제품 중에서도 소시지에서 보다 소고기 분쇄육에서 PCR법은 배지배양법에 비해 더욱 많은 양성을 검출해 냈는데, 이는 소고기 분쇄육에 분포하는 상재균들에 의해 접종된 S. aureus의 성장이 저해되어 배지배양법에서의 결과에 영향을 미친 것으로 사료된다. 식품의 다양한 성상과 식품 내 상재균 수가 많은 경우에 목표하는 원인균의 분리가 어렵기 때문에(29), 식중독균의 신속하고 정확한 검출을 위해서는 식품의 종류에 적합한 효과적인 검출법을 확립하는 것이 매우 중요하다고 사료된다.
또한 소고기 분쇄육과 앞선 연구 중 이와 성상이 유사한 생 돼지고기에 대한 S. aureus 접종량은 각각 213-384, 25-90(CFU/500 g)이며 상재균 수는 각각 1×104 , 2.7×104 (CFU/mL)으로 소고기 분쇄육의 비교적 낮은 상재균 수와 높은 접종량도 위 시험 결과에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 연구에서 선별된 23S rRNA를 표적 유전자로 하는 PCR법은 5-6일이 소요되는 기존의 표준 검출법과 비교하여 2일 이내에 신속하게 검출이 가능하다. 또한 해당 기법은 유제품 내의 칼슘 같은 PCR inhibitor의 존재에도 불구하고 기존의 표준검출법과 거의 동일한 검출 능력을 보이는 한편, 식품 조성과 총 세균 수에 별다른 영향을 받지 않아 특히 상대적으로 상재균 수가 많은 비가공식품을 포함한 육제품에서는 배지배양법에 비해 뛰어난 검출 능력을 보인다. 따라서 S.
우유, 분유를 포함한 유제품과 소시지, 소고기 분쇄육을 포함한 육제품에서 배지법의 확인시험인 coagulase 확인시험과 colony PCR 확인시험 그리고 PCR법을 이용한 신속 검출법과 비교한 결과를 식품별 상재균 수 및 500 g 당 접종량과 함께 각각 Table 3와 Table 4에 나타내었다. 모든 실험에서 시료의 음성 및 양성 대조군은 배지배양법과 PCR에서 결과가 모두 음성과 양성으로 나타나 사용된 시료 및 실험방법이 적합했음을 보여주었다. 또한 음성 대조군이 적절하게 나왔으므로 사용된 식품들은 자연적으로 오염된 시료가 없었고 위양성의 가능성은 배제되었다고 가정하였다.
본 연구 결과에 의하면 소시지와 소고기 분쇄육 같은 육제품에서 표준검출법인 배지배양법보다 PCR법에서 보다 많은 양성을 검출하였기 때문에 육제품에서는 PCR법이 보다 효과적인 것으로 사료된다. 유제품의 경우에도 두 방법간의 통계적 유의차가 존재하지 않으므로, 기존의 배지배양법에 비해 비교적 빠른 시간 내에 검출이 가능한 PCR법으로 대체 가능할 것으로 사료된다.
본 연구에서 PCR법은 유제품에서 보다 육제품에서 배지배양법에 비해 보다 많은 양성을 검출하였는데, 이는 우유 속의 칼슘이 co-factor인 마그네슘과 경쟁하여 Taq polymerase inhibitor로 작용함으로써 PCR 반응을 저해시킬 수 있다고 보고한 앞선 연구처럼(27), 유제품 내 칼슘 등의 어떤 물질이 PCR 반응의 inhibitor로 작용하여 민감도를 저하시켰을 것으로 사료된다. 칼슘으로 인한 PCR 반응저하는 마그네슘이나 Taq의 첨가로도 거의 개선이 안되고, 또한 humic acid, melanin, hematin, tannic acid 같은 다른 PCR inhibitor에 효과적인 BSA (bovine serum albumin)로도 효과가 없다고 보고 되었다(28).
세 가지 표적유전자에 대한 PCR법의 검출 한계를 분석한 결과 23S rRNA를 표적으로 했을 때 민감도가 가장 높았다. PBS, 분유, 소고기 분쇄육에서는 5.
소시지와 소고기 분쇄육의 경우에는 PCR이 배지법에 비해 더 많은 양성을 검출하여 높은 통계학적 유의차를 보였다(p<0.05).
의심집락에 대해 coagulase test와 colony PCR을 통한 확인시험을 실시하였다. 실험결과 우유와 분유에서는 배지배양법과 PCR간에 통계학적 유의차가 존재하지 않았다. 소시지와 소고기 분쇄육의 경우에는 PCR이 배지법에 비해 더 많은 양성을 검출하여 높은 통계학적 유의차를 보였다(p<0.
05). 연구결과를 종합하면, 유제품 및 육제품에서 PCR을 통한 S. aureus의 검출은 기존 배지배지배양법에 비해 시간과 노동력을 절감할 수 있는 효과적인 방법으로 나타났다.
또한 음성 대조군이 적절하게 나왔으므로 사용된 식품들은 자연적으로 오염된 시료가 없었고 위양성의 가능성은 배제되었다고 가정하였다. 유제품과 육제품 모두에서 coagulase와 colony PCR 확인 시험 비교 결과 두 방법 모두 동일하게 양성으로 검출되어 두 방법 간에 차이가 없었다(자료 미제시). 표준검출법인 배지배양법의 coagulase 확인시험은 비가공식품의 경우 위양성 결과가 많이 나올 수 있어 colony PCR 같은 확인시험으로의 개선이 필요하다는 보고가 있으나(20), 본 연구에서는 비가공식품인 소고기 분쇄육을 포함한 모든 식품에서 coagulase와 colony PCR 확인시험의 결과가 동일하게 나타났다(Table 4).
PCR법과 배지배양법의 비교 결과는 유제품과 육제품에서 차이를 보였다(Table 3, Table 4). 유제품인 우유의 경우 PCR법을 사용한 신속검사 결과 34개의 양성이 검출되어 위 두 확인시험법과 1개의 시료에서 차이가 있었지만 PCR법과 배지배양법간의 통계학적 유의차는 없었으며, 분유의 경우 각 방법에서 모두 12개의 양성이 검출되어 동일한 결과를 나타내었다. 육제품인 소시지의 경우 PCR법을 사용한 신속검사 결과 24개의 양성이 검출되었고, 위 두 확인시험법과 11개의 시료에서 차이를 보여 PCR 과 두 확인시험간의 통계적 유의차가 있었고(p<0.
육제품인 소시지의 경우 PCR법을 사용한 신속검사 결과 24개의 양성이 검출되었고, 위 두 확인시험법과 11개의 시료에서 차이를 보여 PCR 과 두 확인시험간의 통계적 유의차가 있었고(p<0.05), 소고기 분쇄육의 경우 PCR법과 배지배양법에서 각각 32개와 19개의 시료에서 양성이 검출되어 각 방법간의 높은 통계학적 유의차를 보였다(p<0.01).
이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 연구에서 선별된 23S rRNA를 표적 유전자로 하는 PCR법은 5-6일이 소요되는 기존의 표준 검출법과 비교하여 2일 이내에 신속하게 검출이 가능하다. 또한 해당 기법은 유제품 내의 칼슘 같은 PCR inhibitor의 존재에도 불구하고 기존의 표준검출법과 거의 동일한 검출 능력을 보이는 한편, 식품 조성과 총 세균 수에 별다른 영향을 받지 않아 특히 상대적으로 상재균 수가 많은 비가공식품을 포함한 육제품에서는 배지배양법에 비해 뛰어난 검출 능력을 보인다.
접종 후 모든 시료는 실제 식품 시료 보관 환경과 유사하게 4°C에서 18-24시간 동안 보관하는 안정화 과정을 거쳤다(22,23).
총 23종의 S. aureus와 다른 15종의 균들에 대하여 PCR법의 특이도를 23S rRNA, nuc, femA 각 세 가지 표적유전자별로 검사한 결과 각각의 표적유전자에 대해 모든 S. aureus에서 PCR 양성반응이 일어난 반면, S. aureus가 아닌 다른 균들에서는 음성결과를 보였다(자료 미제시). 따라서 특이도는 모두 동일한 것으로 보였다.

후속연구

칼슘으로 인한 PCR 반응저하는 마그네슘이나 Taq의 첨가로도 거의 개선이 안되고, 또한 humic acid, melanin, hematin, tannic acid 같은 다른 PCR inhibitor에 효과적인 BSA (bovine serum albumin)로도 효과가 없다고 보고 되었다(28). 따라서 유제품에서의 PCR법의 검출 효율을 증가시키기 위해서는 추가적인 연구가 절실히 필요할 것으로 사료된다.
본 연구 결과에 의하면 소시지와 소고기 분쇄육 같은 육제품에서 표준검출법인 배지배양법보다 PCR법에서 보다 많은 양성을 검출하였기 때문에 육제품에서는 PCR법이 보다 효과적인 것으로 사료된다. 유제품의 경우에도 두 방법간의 통계적 유의차가 존재하지 않으므로, 기존의 배지배양법에 비해 비교적 빠른 시간 내에 검출이 가능한 PCR법으로 대체 가능할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Staphylococcus aureus의 특징은 무엇인가?	Staphylococcus aureus는 중요한 식중독 원인균 중 하나로 자연환경에 대한 저항성이 강하며 사람과 동물의 화농성 병소에 존재할 뿐만 아니라 피부 등에 상재하여 식품으로의 오염 경로도 매우 다양하다(1). 식품에 오염된 S.
	식품에 오염된 S. aureus이 일으키는 독소형 식중독은 어떠한 증상을 동반하는가?	식품에 오염된 S. aureus는 내열성의 장독소(enterotoxin)를 생성하여 구토, 설사, 위경련 등의 증상을 동반하는 독소형 식중독을 일으킨다(1,2).
	축산물의 가공기준 및 성분규격의 배지배양법의 단점은 무엇인가?	이 검출법에 따르면 10% NaCl을 첨가한 tryptic soy broth (TSB)에서 증균 후 Baird-Parker (BP) agar, coagulase 확인시험 등을 사용하여 S. aureus를 검출하는데, 이 같은 배지배양법은 높은 위양성 결과와 장시간의 검사기간(5-6일), 노동력의 과다소모 등이 고질적인 단점으로 지적되어 왔다(4-6). 다양한 신속검출법 중 polymerase chain reaction (PCR) 기법은 고가의 장비 없이도 신속 정확하게 목표균을 검출할 수 있어서 식중독세균 검출 목적으로 널리 사용되어 왔다(7-9).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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