선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 농식품의 Staphylococcus aureus 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동 면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 Staphylococcus aureus이 포함된 표준인산버퍼 시료와 닭고기 세척 버퍼 시료를 이용하여 검증하였다.
- 본 연구는 식중독 사고의 주요 원인균인 Staphylococcus aureus의 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 표준버퍼 또는 식품 추출물에 오염된 Staphylococcus aureus을 이용하여 검증하였다.
제안 방법
- 예비 실험 결과 표지항체를 Abcam사의 ab20920, 그리고 포획항체를 Abcam사의 ab68954로 하였을 때 Staphylococcus aureus이 검출되지 않았다. Staphylococcus aureus 진단키트 제작을 위한 최적의 항체 조합을 선정하기 위하여 Table 1과 같은 항체 조합으로 진단키트를 제작한 다음 표준인산용액에 109CFU/mL의 농도로 희석된 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 검출 실험을 수행하였다. 실험결과 18가지 항체 조합 중 C 조합 (표지항체 ab20920, 포획항체 ab20002) 에서만 Staphylococcus aureus 이 검출되었다.
- Staphylococcus aureus의 포획을 위한 검사점은 결합 패드의 가장자리에서 1 cm 떨어진 니트로셀룰로오스 막의 중심선 근처에 위치하며, 마이크로피펫을 이용해 1 μL의 Staphylococcus aureus 항체를 떨어뜨리는 방식으로 제작하였다.
- 본 연구는 농식품의 Staphylococcus aureus 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동 면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 Staphylococcus aureus이 포함된 표준인산버퍼 시료와 닭고기 세척 버퍼 시료를 이용하여 검증하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 본 연구는 식중독 사고의 주요 원인균인 Staphylococcus aureus의 오염 여부를 신속하게 진단할 수 있는 측방유동면역방법 기반의 간이 진단키트를 개발하기 위하여 수행되었다. 간이 진단키트는 니트로셀룰로오스 막과 항체를 이용하여 제작하였으며, 키트의 검출 성능은 표준버퍼 또는 식품 추출물에 오염된 Staphylococcus aureus을 이용하여 검증하였다.
- 간이 진단키트는 플라스틱 지지막 위에 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드를 붙여서 제작하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 시료 용액이 끊이지 않고 흐를 수 있도록 각각의 끝부분이 서로 3 mm씩 겹치도록 조립하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 Staphylococcus aureus 검출 실험은 Staphylococcus aureus을 표준인산용액에 104～108 CFU/mL로 희석시킨 시료를 이용하여 수행하였다. 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 104～108 CFU/mL의 농도로 접종한 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 수행하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 Staphylococcus aureus 검출시 시료 및 시약의 원활한 유동을 위하여 각 구성부의 전처리를 수행하였다. 시료패드와 결합패드의 전처리는 2% BSA (Bovine serum albumin) 및 10% 자당(Sucrose)이 첨가된 0.
- 간이 진단키트를 이용한 Staphylococcus aureus 검출은 100μL의 시료 용액을 시료패드에 주입하는 방식으로 수행하였다.
- 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출성능 향상 가능성은 균일한 조명이 가능하도록 자체 제작한 영상 획득 시스템을 이용하여 조사하였다. 영상획득 시스템의 CCD 카메라를 이용하여 검출 실험에 사용된 간이 진단키트의 영상을 획득한 다음 색변화가 발생한 검사점의 밝기를 영상처리 프로그램(Image Tool 3.
- 간이 진단키트의 검출성능 향상을 위하여 영상획득시스템을 이용하여 진단키트의 검출 결과를 분석하였다. 황색포도상구균이 검출된 간이 진단키트의 영상분석 결과 Fig.
- 간이 진단키트의 식품시료 적용 가능성을 조사하기 위하여, 닭고기 세척 버퍼에 104～108CFU/mL의 농도로 접종된 Staphylococcus aureus을 대상으로 검출 실험을 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼를 이용한 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출 실험 결과도 표준인산버퍼에서의 Staphylococcus aureus 검출 실험과 마찬가지로, 세균의 농도 증가에 따라 시험선에 형성된 띠의 색이 짙어 졌으며, Staphylococcus aureus의 농도가 108 CFU/mL일 때 가장 짙은 색을 나타내었다(Fig.
- 식중독균이 검출되었을 때 표시를 위해 사용하는 색입자로는 콜로이드 형태의 40 nm 금입자를 사용하였다. 금입자와 항체의 결합은 금입자 제조사에서 제공된 결합 방법을 따랐으며, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 실험을 통해 구명한 다음 이후 검출 실험에 사용하였다.
- 1). 네 개의 막은 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드이며, 결합패드와 니트로셀룰로오스 막은 항체와 금입자 결합물, 분석 물질, 시료 등의 이동이 원활하도록 버퍼 등으로 미리 처리한다. 결합패드는 시료의 식중독균과 반응 하여 색 변화 등으로 확인이 가능한 항체-색 입자의 결합물을 포함한다.
- 니트로셀룰로오스 막의 검사점과 컨트롤점은 금입자에 결합시킨 항체와 다른 종류의 Staphylococcus aureus 항체와 금입자에 결합된 항체를 포획하는 anti-mouse 항체를 각각 도포한 다음 37℃ 에서 1시간 건조하여 형성시켰다. Staphylococcus aureus의 포획을 위한 검사점은 결합 패드의 가장자리에서 1 cm 떨어진 니트로셀룰로오스 막의 중심선 근처에 위치하며, 마이크로피펫을 이용해 1 μL의 Staphylococcus aureus 항체를 떨어뜨리는 방식으로 제작하였다.
- 닭고기 세척 버퍼는 시중에서 구입한 닭 가슴살 부위 25 g을 225 mL의 표준인산버퍼에 넣고 교반하는 방법으로 제조하였다. 또한, Staphylococcus aureus 검출용 간이 진단키트의 다른 세균에 대한 선택성은 다른 종의 식중독균인 Campylobacter jejuni 109 CFU/ml을 이용하여 조사하였으며, 키트의 검출 성능 향상을 위하여 키트의 폭을 2 mm로 줄여서 검출 실험을 수행하였다.
- 0, The University of Texas, USA)을 이용하여 측정하였다. 밝기 측정은 검사 점에서 가장 진한 색변화를 나타내는 부위에 대하여 일정면적의 폄균값을 구하는 방법으로 수행하였다.
- 간이 진단키트는 플라스틱 지지막 위에 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드를 붙여서 제작하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 시료 용액이 끊이지 않고 흐를 수 있도록 각각의 끝부분이 서로 3 mm씩 겹치도록 조립하였다. 조립된 키트는 길이 6 cm, 폭 5 mm로 절단하여 냉장 보관한 뒤 이후 실험에 사용하였다.
- 간이 진단키트를 이용한 Staphylococcus aureus 검출시 시료 및 시약의 원활한 유동을 위하여 각 구성부의 전처리를 수행하였다. 시료패드와 결합패드의 전처리는 2% BSA (Bovine serum albumin) 및 10% 자당(Sucrose)이 첨가된 0.2 M 표준인산버퍼(pH 7.4)에 패드를 담가 버퍼용액을 충분히 흡수시킨 다음 37℃에서 4시간 건조시키는 방법으로 수행하였다. 니트로셀룰로오스 막의 전처리는 표준인산버퍼(pH 7.
- 식중독균의 검출 여부 표시를 위한 금입자와 항체의 결합은 버퍼의 pH 값에 크게 영향을 받기 때문에, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값을 실험을 통해 구명하였다. 항체-금입자 결합을 위한 최적 pH 선정을 위한 실험 결과는 Fig.
- CFU/mL로 희석시킨 시료를 이용하여 수행하였다. 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 104～108 CFU/mL의 농도로 접종한 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼는 시중에서 구입한 닭 가슴살 부위 25 g을 225 mL의 표준인산버퍼에 넣고 교반하는 방법으로 제조하였다.
- 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출성능 향상 가능성은 균일한 조명이 가능하도록 자체 제작한 영상 획득 시스템을 이용하여 조사하였다. 영상획득 시스템의 CCD 카메라를 이용하여 검출 실험에 사용된 간이 진단키트의 영상을 획득한 다음 색변화가 발생한 검사점의 밝기를 영상처리 프로그램(Image Tool 3.0, The University of Texas, USA)을 이용하여 측정하였다. 밝기 측정은 검사 점에서 가장 진한 색변화를 나타내는 부위에 대하여 일정면적의 폄균값을 구하는 방법으로 수행하였다.
- 이후 실험에서는 색변화를 보이지 않은 pH 값 중에서 pH 6.6을 이용해 항체와 금입자를 결합하는데 사용하였다.
- 실험결과 18가지 항체 조합 중 C 조합 (표지항체 ab20920, 포획항체 ab20002) 에서만 Staphylococcus aureus 이 검출되었다. 이후 실험에서는 이들 항체를 이용하여 제작한 진단키트를 이용하여 성능 검증 실험을 수행하였다.
- 제작된 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출 성능은 농도가 다른 Staphylococcus aureus(104～108 CFU/mL)이 포함된 표준인산버퍼 시료를 이용하여 조사하였다. 간이 진단키트를 이용한 Staphylococcus aureus 검출은 100μL의 시료 용액을 시료패드에 주입하는 방식으로 수행하였다.
대상 데이터
- 식중독균 검출 실험은 식중독 사고 발생 빈도가 높은 Staphylococcus aureus을 대상으로 하여 수행하였다. Staphylococcus aureus 균주는 한국미생물보존센터 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisma, Korea)에서 분양받은 KCCM 12103를 사용하였으며, 세균 군락을 Brain Heart Infusion (BHI)(Difco, USA) 배지에 계대 배양하여 이용하였다. Staphylococcus aureus 균수는 표준인산버퍼를 사용하여 단계적으로 희석 한 후 Mannitol Salt agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 표준평판법으로 측정하였다.
- Staphylococcus aureus의 포획을 위한 검사점은 결합 패드의 가장자리에서 1 cm 떨어진 니트로셀룰로오스 막의 중심선 근처에 위치하며, 마이크로피펫을 이용해 1 μL의 Staphylococcus aureus 항체를 떨어뜨리는 방식으로 제작하였다. Staphylococcus aureus 항체는 표준인산버퍼에 용해된 1 mg/mL 농도의 것을 사용하였다. 컨트롤점은 표준인산버퍼 용액에 1 mg/mL 농도로 용해시킨 anti-mouse 항체 용액을 검사점에서 흡수패드 쪽으로 5 mm 떨어진 위치에 도포하여 제작하였다.
- 검사 결과를 색으로 나타내는 금입자는 40 nm의 직경을 갖는 것(Gold-in-a-box, Bioassay works, USA)을, 이 금입자와 결합되는 표지항체와 Staphylococcus aureus 포획을 위한 검사점의 Staphylococcus aureus 항체는 Abcam(Cambridge, UK), Virostat Inc(ME, USA), Fitzgerald Industries International (MA, USA) 사로부터 구입하여 사용하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 Millipore사(Hi-Flow Plus, MA, USA), 컨트롤점 제작을 위한 anti-mouse 항체는 KPL사(MD, USA)와, 그 외 PBS 등의 시약은 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 실제 농식품 시료에 대한 간이 진단키트의 적용 가능성은 닭고기 세척 버퍼에 104～108 CFU/mL의 농도로 접종한 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼는 시중에서 구입한 닭 가슴살 부위 25 g을 225 mL의 표준인산버퍼에 넣고 교반하는 방법으로 제조하였다. 또한, Staphylococcus aureus 검출용 간이 진단키트의 다른 세균에 대한 선택성은 다른 종의 식중독균인 Campylobacter jejuni 109 CFU/ml을 이용하여 조사하였으며, 키트의 검출 성능 향상을 위하여 키트의 폭을 2 mm로 줄여서 검출 실험을 수행하였다.
- 검사 결과를 색으로 나타내는 금입자는 40 nm의 직경을 갖는 것(Gold-in-a-box, Bioassay works, USA)을, 이 금입자와 결합되는 표지항체와 Staphylococcus aureus 포획을 위한 검사점의 Staphylococcus aureus 항체는 Abcam(Cambridge, UK), Virostat Inc(ME, USA), Fitzgerald Industries International (MA, USA) 사로부터 구입하여 사용하였다. 시료패드, 결합패드, 니트로셀룰로오스 막, 흡수패드는 Millipore사(Hi-Flow Plus, MA, USA), 컨트롤점 제작을 위한 anti-mouse 항체는 KPL사(MD, USA)와, 그 외 PBS 등의 시약은 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 식중독균 검출 실험은 식중독 사고 발생 빈도가 높은 Staphylococcus aureus을 대상으로 하여 수행하였다. Staphylococcus aureus 균주는 한국미생물보존센터 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisma, Korea)에서 분양받은 KCCM 12103를 사용하였으며, 세균 군락을 Brain Heart Infusion (BHI)(Difco, USA) 배지에 계대 배양하여 이용하였다.
- 식중독균이 검출되었을 때 표시를 위해 사용하는 색입자로는 콜로이드 형태의 40 nm 금입자를 사용하였다. 금입자와 항체의 결합은 금입자 제조사에서 제공된 결합 방법을 따랐으며, 금입자와 항체의 최적 결합을 위해 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 실험을 통해 구명한 다음 이후 검출 실험에 사용하였다.
이론/모형
- Staphylococcus aureus 균주는 한국미생물보존센터 KCCM (Korean Culture Center of Microorganisma, Korea)에서 분양받은 KCCM 12103를 사용하였으며, 세균 군락을 Brain Heart Infusion (BHI)(Difco, USA) 배지에 계대 배양하여 이용하였다. Staphylococcus aureus 균수는 표준인산버퍼를 사용하여 단계적으로 희석 한 후 Mannitol Salt agar(Difco, USA) 배지를 사용하여 표준평판법으로 측정하였다. 배양 시 조건은 액체배양의 경우 37℃에서 18～24시간 동안, 평판배양의 경우 37℃에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 1. 금입자와 항체의 최적 결합을 위한 반응 버퍼의 적절한 pH 값은 6.6인 것으로 조사되었다.
- 2. 표준인산버퍼에 대한 Staphylococcus aureus 검출 실험결과 간이 진단키트를 이용하여 10분 이내에 시료의 Staphylococcus aureus을 검출할 수 있었으며, 검출한계는 106CFU/mL였다.
- 3. 닭고기 시료에 대한 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출한계는 105CFU/mL인 것으로 조사되었다.
- 보라색으로 변색된 항체-금입자 혼합용액은 항체의 등전점에서 금입자 끼리의 교차결합을 유도하여 서로 응집됨으로써 Staphylococcus aureus과 반응할 수 없게 되어 면역분석에 사용하기에 부적합하였다. Staphylococcus aureus 항체 (Ab20920, Abcam)의 최적 pH값 선정 실험에서 육안으로 혼합용액의 색변화를 관찰한 결과 pH 5.4～8.4 용액에서는 색변화가 일어나지 않고 응집현상도 없었지만, pH 8.8～10.1 용액에서는 금입자가 응집하여 푸른색으로 변했다.
- Staphylococcus aureus의 농도가 108CFU/mL일 때 밝기 신호는 94 ± 14로 기준신호보다 71만큼 밝기 차이가 크게 나타났다.
- Staphylococcus aureus의 농도가 108CFU/mL일 때 밝기 신호는 94 ± 14로 기준신호보다 71만큼 밝기 차이가 크게 나타났다. 간이 진단키트의 선택성을 나타내는 Campylobacter jejuni 검출실험에서는 밝기 신호가 기준신호 보다 감소하지 않아 개발된 진단키트가 Staphylococcus aureus만 선택적으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다.
- 닭고기 세척 버퍼를 이용한 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출 실험 결과도 Staphylococcus aureus의 농도 증가에 따라 검사점의 밝기 신호가 감소하였으며, Staphylococcus aureus의 농도가 108CFU/mL일 때 가장 낮은 밝기 신호를 나타내었다(Fig. 6). 화소의 평균 밝기는 Staphylococcus aureus가 포함되지 않은 닭고기 세척 버퍼의 기준신호 165 ± 13에서 105CFU/mL일 때 156 ± 14로 감소하여, 기준신호와의 평균 밝기차이는 9였다.
- CFU/mL의 농도로 접종된 Staphylococcus aureus을 대상으로 검출 실험을 수행하였다. 닭고기 세척 버퍼를 이용한 간이 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출 실험 결과도 표준인산버퍼에서의 Staphylococcus aureus 검출 실험과 마찬가지로, 세균의 농도 증가에 따라 시험선에 형성된 띠의 색이 짙어 졌으며, Staphylococcus aureus의 농도가 108 CFU/mL일 때 가장 짙은 색을 나타내었다(Fig. 4). 닭고기 시료에 포함된 여러가지 다른 물질들의 간섭으로 인한 검출 성능 저하는 나타나지 않았으며, 오히려 검출 신호가 더 선명하게 나타나는 것으로 조사되었다.
- 4). 닭고기 시료에 포함된 여러가지 다른 물질들의 간섭으로 인한 검출 성능 저하는 나타나지 않았으며, 오히려 검출 신호가 더 선명하게 나타나는 것으로 조사되었다. 육안으로 확인한 닭고기 시료에 대한 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출한계는 표준인산 버퍼에서의 검출한계보다 우수한 105 CFU/mL였다.
- 육안으로 관찰된 검출한계는 106 CFU/mL인 것으로 조사되었다. 또한, Campylobacter jejuni 균을 반응시켰을 때 검사점에 색변화가 일어나지 않아 개발된 진단키트가 Staphylococcus aureus 균에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
- 실험 결과 Fig. 3과 같이 Staphylococcus aureus의 농도 증가에 따라 검사점의 색이 짙어 졌으며, Staphylococcus aureus의 농도가 108 CFU/mL일 때 가장 짙은 색을 나타내어 개발된 간이 진단키트가 효과적으로 Staphylococcus aureus을 검출하는 것으로 나타났다. 육안으로 관찰된 검출한계는 106 CFU/mL인 것으로 조사되었다.
- Staphylococcus aureus 진단키트 제작을 위한 최적의 항체 조합을 선정하기 위하여 Table 1과 같은 항체 조합으로 진단키트를 제작한 다음 표준인산용액에 109CFU/mL의 농도로 희석된 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 검출 실험을 수행하였다. 실험결과 18가지 항체 조합 중 C 조합 (표지항체 ab20920, 포획항체 ab20002) 에서만 Staphylococcus aureus 이 검출되었다. 이후 실험에서는 이들 항체를 이용하여 제작한 진단키트를 이용하여 성능 검증 실험을 수행하였다.
- 간이 진단키트의 검출 성능은 사용하는 항체에 따라 크게 영향을 받는다. 예비 실험 결과 표지항체를 Abcam사의 ab20920, 그리고 포획항체를 Abcam사의 ab68954로 하였을 때 Staphylococcus aureus이 검출되지 않았다. Staphylococcus aureus 진단키트 제작을 위한 최적의 항체 조합을 선정하기 위하여 Table 1과 같은 항체 조합으로 진단키트를 제작한 다음 표준인산용액에 109CFU/mL의 농도로 희석된 Staphylococcus aureus 시료를 이용하여 검출 실험을 수행하였다.
- 닭고기 시료에 포함된 여러가지 다른 물질들의 간섭으로 인한 검출 성능 저하는 나타나지 않았으며, 오히려 검출 신호가 더 선명하게 나타나는 것으로 조사되었다. 육안으로 확인한 닭고기 시료에 대한 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출한계는 표준인산 버퍼에서의 검출한계보다 우수한 105 CFU/mL였다. 표준인산버퍼에서의 검출 실험에서와 마찬가지로, Campylobacter jejuni 에 대해 검사점의 색변화가 일어나지 않아 개발된 진단키트가 닭고기 시료에서도 Staphylococcus aureus에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
- 육안으로 확인한 닭고기 시료에 대한 진단키트의 Staphylococcus aureus 검출한계는 표준인산 버퍼에서의 검출한계보다 우수한 105 CFU/mL였다. 표준인산버퍼에서의 검출 실험에서와 마찬가지로, Campylobacter jejuni 에 대해 검사점의 색변화가 일어나지 않아 개발된 진단키트가 닭고기 시료에서도 Staphylococcus aureus에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
- 화소의 평균 밝기는 256 단계로 표시했을 때 황색포도상구균이 포함되지 않은 시료의 기준신호 157 ± 12에서 106CFU/mL일 때 147 ± 12로 감소하여, 기준신호와의 평균 밝기차이는 10이었다.
- 화소의 평균 밝기는 Staphylococcus aureus가 포함되지 않은 닭고기 세척 버퍼의 기준신호 165 ± 13에서 105CFU/mL일 때 156 ± 14로 감소하여, 기준신호와의 평균 밝기차이는 9였다.
- 간이 진단키트의 검출성능 향상을 위하여 영상획득시스템을 이용하여 진단키트의 검출 결과를 분석하였다. 황색포도상구균이 검출된 간이 진단키트의 영상분석 결과 Fig. 5와 같이 검출되는 황색포도상구균의 농도가 높을수록 화소의 평균밝기가 감소하는 것으로 나타났다. 화소의 평균 밝기는 256 단계로 표시했을 때 황색포도상구균이 포함되지 않은 시료의 기준신호 157 ± 12에서 106CFU/mL일 때 147 ± 12로 감소하여, 기준신호와의 평균 밝기차이는 10이었다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.