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문제 정의
- 이러한 갱년기 증후군을 치료하기 위해 호르몬 대체 요법으로 치료를 하고 있으나 유방암과 자궁암 등의 부작용에 대한 논쟁의 여지가 있어 갱년기 증후군을 치료하는데 양면성을 가진다. 그러므로 본 연구에서는 쉽게 섭취 할 수 있으며, 부작용이 없는 해조류인 감태 추출물을 이용하여 in vivo 실험을 통해 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실에 미치는 영향을 검토하였다.
- 본 연구에서는 감태추출물을 시료로 하여 in vivo 실험을 통하여 갱년기 장애 시 나타날 수 있는 골 손실 개선효과를 검토하기 위하여 골 형성 지표인 ALP 활성 및 osteocalcin 농도, 골용해 지표인 CTx 및 골 조직의 collagen 함량을 측정하였다.
- 즉 IL-1, IL-6 및 TNF-α의 생산이 증가하고 이로 인해 조골세포 및 파골세포의 수가 증가하며 결국 골재형성의 활성화 빈도가 증가된다[13]. 본 연구에서는 난소절제로 인하여 에스트로겐이 결핍 되었을 때 collagen 생성 변화에 있어 감태 추출물이 어떠한 영향을 주는지 검토하였다(Table 5). 연골의 경우 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 난소를 절제한 OVX-CON 군은 collagen의 함량은 감소하였으나, 난소 절제 후 감태 추출물 투여함으로써 유의성 있게 증가하는 경향을 나타내었다.
가설 설정
- 2)Values are means±SD.
- 3)Vahies are mean±S.D, (n=7).
제안 방법
- 180-190 g인 9주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐를 오리엔트 바이오에서 분양받아 1주일간 적응시킨 후 난소 절제 수술을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다.
- 본 실험에서 사용한 감태는 2007년 10월 제주전역 해안일 대에서 채취된 것을 태림상사에서 구입하여 물로 4~5회 씻어 염분과 불순물을 제거하고, 자연 건조시켜 분쇄하여 분말 화하여 실험에 사용하였다. 건조된 감태는 80% ethanol 2 1를 가해 3회 열 추출하여 감압농축기로 농축하고 동결 건조한 ethanol 추출물을 0.9% 생리식염수로 희석한 후 동물실험에 사용하였다.
- , USA)를 이용하여 ELASA reader로 분석하였다. 골 용해 지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide (CTx) 농도는 RatLaps ELASA kit (Nordicbioscience diagnostic)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type I collagen의 C-terminal telopeptide al 사슬에 특징 적 인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다. 조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 200 mg 씩 취하여 가수분해(6N HQ, 110℃, 20 hr)하고 여과, 농축하여 실험에 사용하였다.
- 골격 형성 지표인 serum alkaline phosphatase (ALP) 활성은 측정용 kit를 사용하여 자동생화학분석기 DRY CHEM 3600i (Fuji, Japan)를 사용하여 분석하였다. 혈청 osteocalcin 은 rat 전용 osteocalcin ELASA kit (Biomedical Technologies Inc.
- 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50-55%를 유지시켰고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였으며, 실험 시료는 0.9% 생리식염수로 용해하여 사용하였고 대조군은 동일 용량의 생리식염수를 투여하였다.
- 180-190 g인 9주령의 암컷(Sprague-Dawley) 쥐를 오리엔트 바이오에서 분양받아 1주일간 적응시킨 후 난소 절제 수술을 하였고 비 난소절제 대조군에게는 sham-operation을 실시하였다. 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준비 난소절제 대조군(SHAM), 난소를 절제한 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 감태 추출물 50 ㎎/㎏ 투여 군 (OVX-EC50), 난소절제 후 감태 추출물 200 ㎎/㎏ 투여군 (OVX-EC200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1)
- 실험기간 동안 식이 섭취량과 체중은 매일 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2℃, 습도 50-55%를 유지시켰고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였으며, 실험 시료는 0.
- 골 용해 지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide (CTx) 농도는 RatLaps ELASA kit (Nordicbioscience diagnostic)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type I collagen의 C-terminal telopeptide al 사슬에 특징 적 인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다. 조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 200 mg 씩 취하여 가수분해(6N HQ, 110℃, 20 hr)하고 여과, 농축하여 실험에 사용하였다. 시료 중의 collagene Woessner [39]의 방법으로 colorimetric method로 hydroxyproline (Hyp)량을 측정한 후, collagen의 아미노산 조성으로부터 collagen량을 환산하였다.
- 수술 후 1주일간 고형 사료를 주어 상처가 회복되면, 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 4군으로 나누었다. 즉 실험동물은 난소절제는 하지 않고 같은 수술의 스트레스를 준비 난소절제 대조군(SHAM), 난소를 절제한 대조군(OVX-CON), 난소절제 후 감태 추출물 50 ㎎/㎏ 투여 군 (OVX-EC50), 난소절제 후 감태 추출물 200 ㎎/㎏ 투여군 (OVX-EC200)으로 각 7마리씩 4군으로 나누어 1 ml의 시료를 매일 경구 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1)
- Collagen 중의 Hyp 의 비율은 평균 110잔기/1000잔기 이므로 조직중의 collagen 량은 다음의 식에 따라 산출하였다. 표준검체로는 4-hydroxyL-proline을 0, 2, 4, 8 μg/ml로 하여 검량선을 작성하였다.
- 골격 형성 지표인 serum alkaline phosphatase (ALP) 활성은 측정용 kit를 사용하여 자동생화학분석기 DRY CHEM 3600i (Fuji, Japan)를 사용하여 분석하였다. 혈청 osteocalcin 은 rat 전용 osteocalcin ELASA kit (Biomedical Technologies Inc., USA)를 이용하여 ELASA reader로 분석하였다. 골 용해 지표인 혈청 중 콜라겐 가교 C-terminal telopeptide (CTx) 농도는 RatLaps ELASA kit (Nordicbioscience diagnostic)를 이용하여 측정하였으며 원리는 Type I collagen의 C-terminal telopeptide al 사슬에 특징 적 인 polyclonal antibody의 항원 biotinylated EKSQDGGR에 대한 경쟁적 결합을 기본으로 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 감태는 2007년 10월 제주전역 해안일 대에서 채취된 것을 태림상사에서 구입하여 물로 4~5회 씻어 염분과 불순물을 제거하고, 자연 건조시켜 분쇄하여 분말 화하여 실험에 사용하였다. 건조된 감태는 80% ethanol 2 1를 가해 3회 열 추출하여 감압농축기로 농축하고 동결 건조한 ethanol 추출물을 0.
데이터처리
- 연구결과 얻어진 자료를 SPSS Version 14.0 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술통계치(mean, SD)를 산출 하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(oneway ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey를 적용하였다.
- 0 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술통계치(mean, SD)를 산출 하였다. 집단 간의 차이를 알아보기 위해 일원변량분석(oneway ANOVA)를 이용하여 분석하였고, 사후검증은 Tukey를 적용하였다. 유의수준은 α<0.
이론/모형
- 조직 중의 collagen 함량 측정을 위하여 골, 연골, 피부 및 폐 조직은 각각 200 mg 씩 취하여 가수분해(6N HQ, 110℃, 20 hr)하고 여과, 농축하여 실험에 사용하였다. 시료 중의 collagene Woessner [39]의 방법으로 colorimetric method로 hydroxyproline (Hyp)량을 측정한 후, collagen의 아미노산 조성으로부터 collagen량을 환산하였다. Collagen 중의 Hyp 의 비율은 평균 110잔기/1000잔기 이므로 조직중의 collagen 량은 다음의 식에 따라 산출하였다.
성능/효과
- 이것은 난소 절제 후 에스트로 겐의 분비가 감소되는데 반해 감태 추출물 투여가 에스트로겐 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시켜 준 것으로 추측되어진다. 골 용해 지표인 혈액 중의 CTx는 난소절제군이 비 절제군에 비해 높은 수준을 보여 난소 절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다. 반면 감태 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 감소하였으며, EC-200군 의 경우 SHAM과 비슷한 수준으로 나타났다.
- 골 조직에서도 난소를 절제한 OVX-CON군이 난소를 절제하지 않은 SHAM군에 비해 감소하는 경향을 나타내 었지만, 난소를 절제한 후 감태를 투여한 군에서 SHAM군 수준으로 증가하는 결과가 나타났다. 한편, 피부 조직의 경우 난소절제에 의하여 collagen함량이 감소되었지만, 감태 추출물 투여로 인해 증가하였고, 특히 OVX-EC200군에서 유의적으로 증가하였다.
- 난소 절제술을 시행한 군들에서 전체적으로 체중이 증가하 였으나, 난소절제 후 감태 추출물을 투여에 의한 체중 감소는 나타나지 않아 감태 추출물이 체중 감소에는 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 난소절제 시(OVX-CON) 에스트로겐 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제 (SHAM)군에 비해 혈장 중의 ALP의 활성이 증가되 었으나, 난 소 절제 후 감태 추출물을 투여한 군에서 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다.
- 난소 절제술을 시행한 군들에서 전체적으로 체중이 증가하 였으나, 난소절제 후 감태 추출물을 투여에 의한 체중 감소는 나타나지 않아 감태 추출물이 체중 감소에는 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 난소절제 시(OVX-CON) 에스트로겐 결핍으로 bone turnover가 증가되어 비 난소절제 (SHAM)군에 비해 혈장 중의 ALP의 활성이 증가되 었으나, 난 소 절제 후 감태 추출물을 투여한 군에서 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소 절제 후 에스트로 겐의 분비가 감소되는데 반해 감태 추출물 투여가 에스트로겐 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시켜 준 것으로 추측되어진다.
- Table 3은 감태 추출물이 혈청 ALP의 활성에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 난소절제 시에 스트로겐 결핍으로 bone turnover이 증가되어 비난소절제군에 비해 혈장 중의 ALP의 활성이 증가되었으나, 난소 절제 후 감태 추출물을 투여한 군에서 그 활성이 유의적으로 감소하는 경향이 나타났다. 이것은 난소 절제 후 에스트로겐의 분비가 감소되는데 반해 감태 추출물 투여가 에스트로겐 대체 작용을 함으로써 난소절제로 인한 골 손실 정도를 완화시켜 준 것으로 추측되어진다.
- 식 이효율은 공식에서 의미하는 바와 같이 사료를 섭취하는 양이 많음에도 불구하고 체중의 증가가 적다는 것은 비만조절 효과가 있는 것으로 생각할 수 있다. 따라서 식이효율은 비만을 나타내는 하나의 척도로 사용할 수 있고, 식이효율의 수치가 적을수록 비만조절효과가 있다고 할 수 있다. 본 연구에서 식이 효율은 난소절제군인 OVX-CON군이 비난소절제군인 SHAM보다 높았으며, EC200군의 경우 OVX-CON군보다 낮게 나타났으나 유의적인 차이는 없었다.
- 이는 난소절제 로 인해 bone turnover가 증가된 상태에서 감태 추출물의 투여로 bone turnover가 감소하여 골 흡수 저해 효과를 타나낸 것으로 추정된다. 또한 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절 제로 인하여 감소하였으나, 감태 추출물의 투여에 의해 점진적으로 회복되는 경향을 나타내었다. 이상의 결과로부터 estrogen 부족으로 인한 골 손실의 예방에 감태가 유익한 효과를 가지며, 이를 활용한 기능성식품 개발도 가능할 것으로 기대되어 진다.
- 폐경이 되면 혈중 osteoclacine 증가하고 에스트로겐 치료 후 감소가 되므로 골밀도의 변화와 골 조직 검사와도 유의한 상관관계가 있다[3]. 본 실험 결과 혈청 osteocalcine SHAM군에 비해 난소를 절제한 OVX-CON군이 높은 경향을 나타내었고 감태 추출물의 투여에 의해 감소하는 경향을 나타내었다(Table 4). 한편, 박형무[29] 등은 폐경 후 여성에게 있어 혈중 osteocalcin 농도는 40%, deoxypyridinolinee 80%까지 증가하는데, 이는 골 대사에서 골 흡수가 골 형성에 비해 상대적으로 더욱 증가한 것을 의미하며, 따라서 전체적인 골 형성은 노화에 의해 그 비율이 줄어들어 골 중의 osteocalcine 감소한 것으로 보고 하였다.
- Turner 등[38]은 흰쥐에서 난소를 제거하면 성장속도가 증가하여 체 중이 증가 된다고 하였고, Yamazaki [4이와 Kassem [15] 등의 연구에서도 일치된 결과를 볼 수 있었다. 본 실험에서도 난소 절제술을 시행한 군들에서 전체적으로 체중이 증가하는 경향을 볼 수 있었다. 한편 난소절제 후 감태 추출물을 투여한 군은 SHAM군과 비교하였을 때 높은 체중 증가량을 나타내어 감태 추출물이 체중 감소에는 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
- 따라서 식이효율은 비만을 나타내는 하나의 척도로 사용할 수 있고, 식이효율의 수치가 적을수록 비만조절효과가 있다고 할 수 있다. 본 연구에서 식이 효율은 난소절제군인 OVX-CON군이 비난소절제군인 SHAM보다 높았으며, EC200군의 경우 OVX-CON군보다 낮게 나타났으나 유의적인 차이는 없었다.
- Garnero [8] 등은 폐경 후 여성을 대상으로 한 전향적 코호트 연구에서 대퇴골 골밀도를 보정 후에도 혈청 CTx와 대퇴골의 골절 위험이 양의 관계를 보였으며, Pi [3이 등도 폐경 후 골다 공증 여성에서 정상군보다 높은 혈청 CTx 수준을 보고하여, 혈청 CTx가 골절 위험에 대한 예측인자로도 유용한 지표라 하였다. 본 연구에서도 난소절제군이 비 절제군에 비해 높은 CTx 수준을 보여 난소절제군에 있어 골 용해가 증가되었음을 나타내었다. 한편 감태 추출물의 투여로 인해 CTx 함량이 감소하였으며, EC-200군의 경우 SHAM과 비슷한 수준으로 나타 났다(Table 4).
- 본 실험에서도 난소 절제술을 시행한 군들에서 전체적으로 체중이 증가하는 경향을 볼 수 있었다. 한편 난소절제 후 감태 추출물을 투여한 군은 SHAM군과 비교하였을 때 높은 체중 증가량을 나타내어 감태 추출물이 체중 감소에는 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
후속연구
- Estrogen결핍에 의한 골다공증은 골절이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 되며[5], 이 경우의 estrogen투여는 골의 무기질성분의 증가와 함께 교원섬유의 조성에도 영향을 미쳐서 골절의 예방에 효과를 지닌다고 보고되고 있다. 본 연구 결과에서 난 소절제로 인한 결합 조직 중의 collagen 합성의 감소가 감태 추출물의 투여에 의해 점진적으로 회복되는 경향을 나타내어 estrogen 부족으로 인한 골 손실의 예방에 감태가 유익한 효과를 가지며, 이를 활용한 기능성식품 개발도 가능할 것으로 기대되어 진다.
- 또한 결합조직 중의 collagen 함량은 난소절 제로 인하여 감소하였으나, 감태 추출물의 투여에 의해 점진적으로 회복되는 경향을 나타내었다. 이상의 결과로부터 estrogen 부족으로 인한 골 손실의 예방에 감태가 유익한 효과를 가지며, 이를 활용한 기능성식품 개발도 가능할 것으로 기대되어 진다.
- 한편, 박형무[29] 등은 폐경 후 여성에게 있어 혈중 osteocalcin 농도는 40%, deoxypyridinolinee 80%까지 증가하는데, 이는 골 대사에서 골 흡수가 골 형성에 비해 상대적으로 더욱 증가한 것을 의미하며, 따라서 전체적인 골 형성은 노화에 의해 그 비율이 줄어들어 골 중의 osteocalcine 감소한 것으로 보고 하였다. 혈중 osteocalcine 골대사가 균형을 유지 할 때에는 골 대사 표지자로서 작용하여 폐경 후 증가하는 것으로 나타나고 골대사가 불균형 시에는 골 형성 표지자로서 작용하여 증가 또는 감소하는 것으로 나타나 폐경 후 혈중 osteocalcin의 증감에 대한 해석이 다르게 나타날 수 있으므로 보다 많은 연구가 추가적으로 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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