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문제 정의
- 따라서 본 연구는 국내에서 채집하였거나 또는 외국에서 수집한 비늘버섯속 19 균주를 인천대학교 버섯균주 및 DNA은행으로부터 분양받아 이들 버섯의균사체로부터 염색체 DNA를 추출하고 rDNA의 ITS 영역을 중합효소연쇄반응 기법을 이용하여 증폭하여 ITS영역의 염기서열을 밝히고, 또한 arbitary random primer를 이용한 RAPD PCR을 수행하여 비늘버섯속 버섯의 수집지역별 종 간 및 종 내에 유연관계를 밝혀 이를 비늘버섯속 버섯의 종을 동정하는데 이용할수 있는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Gel은 전기영동후 ethidium bromide 용액으로 염색하고 Gel documentation system(Kodak Image Station 4000R, USA)을 사용하여 image를 확인하고 기록하였다. 20개의 OPA primer를 이용하여 RAPD-PCR을 수행하고 전기영동 후 agarose gel상에 나타난 각각의 band를 하나의 형질로 취급하여 band가 존재하면 (+), 존재하지 않으면 (-)으로 코드화하여 자료행렬(data matrix)을 만든다. 유사도 계수(similarity coefficient) S는 모든 균주 간 RAPD-PCR 후 나타난 band의 수를 이용하여 2Nxy/(Nx + Ny)로 계산하였다.
- 4% agarose gel에서 100 V로 75분간 전기 영동하고 이 때 1 kb 크기의 DNA ladder를 size marker로 사용하였다. Gel은 전기영동후 ethidium bromide 용액으로 염색하고 Gel documentation system(Kodak Image Station 4000R, USA)을 사용하여 image를 확인하고 기록하였다. 20개의 OPA primer를 이용하여 RAPD-PCR을 수행하고 전기영동 후 agarose gel상에 나타난 각각의 band를 하나의 형질로 취급하여 band가 존재하면 (+), 존재하지 않으면 (-)으로 코드화하여 자료행렬(data matrix)을 만든다.
- PCR(중합효소연쇄반응)은 Bioneer사의 Taq polymerase kit을 사용하였으며 tube 당 반응액의 부피가 20 μl가되도록 각 첨가물의 양을 조절하였다.
- PCR반응은 96°C에서 30초간 denaturation, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension 순으로 30 cycle의 조건으로 실시하였다.
- PCR이 끝난후 생성된 PCR product를 염기서열을 밝혀내기 위하여 염기서열 분석 전문회사인 Solgen t(Daejeon, Korea)사에 염기서열의 분석을 의뢰하였으며 밝혀진 염기서열과 기타 data를 email로 전달받아 실험 결과의 분석에 사용하였다. 이때 염기서열 분석과정에서 염기가 제대로 밝혀지지 않은 부분의 보완을 위해 모든 sequence들을 수작업으로 보정하였으며 밝혀진 sequence들은 유전자은행인 NCBI(National Center for Biotechnology Information) website(http://www.
- 1. Phylogenetic tree of 26 different mushroom strains of Pholiota species based on the nucleotide sequences of the ITS regions using neighbor-joining method with 1,000 bootstrapping trails.
- 그 후 tube 내의 에탄올을 제거한 후 순수한 DNA pellet에 멸균수를 넣고 DNA를 녹이고, spectrophotometer (Optizen POP, Korea)를 이용하여 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 순도와 양을 계산하고 Total DNA로써 실험에 사용하고 남은 DNA는 -20°C에 보관하여 추후의 실험에 사용하였다(Cubero et al., 1999).
- 또한 신뢰성 있는 자료를 만들기 위하여 이미 ITS 영역의 염기서열의 분석이 끝난 20개의 균주 외에 NCBI의 GenBank로부터 ITS영역의 염기서열 정보가 등록되어 있는 개암다발버섯 (한국), 검은비늘버섯 (한국), 노란갓비늘버섯 (한국), 땅비늘 버섯 (미국), 맛비늘버섯 (중국), 비늘버섯 (스웨덴) 등 총 26개의 균주를 대상으로 유연관계 분석을 수행하였다. 그 후 정리된 염기서열은 하나의 text file로 병합하여 염기서열 전문분석 프로그램인 clustalX로 정렬(alignment)시켰다. 이렇게 정렬된 sequence들을 또 다른 분석프로그램인 PAUP 4.
- 분양받은 버섯균주는 PDA 배지에 옮겨 1~2회 계대 배양하여 순수한 균사체를 얻었다. 또한 배양된 균사는 현미경을 이용하여 담자균의 2차 균사에서 나타나는 형태적인 특징인 꺽쇄연결(clamp connection)을 확인한 후 실험에 사용하였다.
- 8S rDNA, ITS2 region, ITS4 primer binding site(28S rDNA partial sequence) 등의 염기서열을 정리하였다. 또한 신뢰성 있는 자료를 만들기 위하여 이미 ITS 영역의 염기서열의 분석이 끝난 20개의 균주 외에 NCBI의 GenBank로부터 ITS영역의 염기서열 정보가 등록되어 있는 개암다발버섯 (한국), 검은비늘버섯 (한국), 노란갓비늘버섯 (한국), 땅비늘 버섯 (미국), 맛비늘버섯 (중국), 비늘버섯 (스웨덴) 등 총 26개의 균주를 대상으로 유연관계 분석을 수행하였다. 그 후 정리된 염기서열은 하나의 text file로 병합하여 염기서열 전문분석 프로그램인 clustalX로 정렬(alignment)시켰다.
- 본 연구에서 사용된 분석방법은 근린산술결합법(NeighborJoining method)로서 최근 유연관계 분석에 가장 많이 사용되고 있다. 또한 이 방법에 bootstraping을 병행하여 1000회를 반복 분석하였다. 이렇게 얻은 결과로 1000번의 결과 중 50% 이상의 유의성이 있는 결과만을 추려 한가지의 계통도로 작성하였다(Felsenstein, 1985; Saitou and Nei, 1987).
- 우리나라와 전 세계의 여러 지역에서 수집한 비늘버섯속 18 균주와 개암비늘버섯 2 균주를 대상으로 rDNA의 ITS region 염기서열과 genomic DNA의 RAPD-PCR을 수행하였다. ITS1과 ITS2영역의 염기의 수는 각각 233~271, 158~233 그리고 174~219 염기쌍으로 종에 따라 변이가 있었는데 ITS2영역의 염기서열이 ITS1의 영역보다 변이가 높았고 5.
- PCR이 끝난후 생성된 PCR product를 염기서열을 밝혀내기 위하여 염기서열 분석 전문회사인 Solgen t(Daejeon, Korea)사에 염기서열의 분석을 의뢰하였으며 밝혀진 염기서열과 기타 data를 email로 전달받아 실험 결과의 분석에 사용하였다. 이때 염기서열 분석과정에서 염기가 제대로 밝혀지지 않은 부분의 보완을 위해 모든 sequence들을 수작업으로 보정하였으며 밝혀진 sequence들은 유전자은행인 NCBI(National Center for Biotechnology Information) website(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 기존에 등록되어있는 버섯들의 ITS region sequence들과의 상동성을 비교하여 PCR 증폭의 성공여부를 확인하였다.
- 컴퓨터 상에서 기존에 NCBI에 등록되어있는 버섯들의 ITS region sequence들을 토대로, ITS1 primer binding site(18S rDNA partial sequence)와 ITS1 region, 5.8S rDNA, ITS2 region, ITS4 primer binding site(28S rDNA partial sequence) 등의 염기서열을 정리하였다. 또한 신뢰성 있는 자료를 만들기 위하여 이미 ITS 영역의 염기서열의 분석이 끝난 20개의 균주 외에 NCBI의 GenBank로부터 ITS영역의 염기서열 정보가 등록되어 있는 개암다발버섯 (한국), 검은비늘버섯 (한국), 노란갓비늘버섯 (한국), 땅비늘 버섯 (미국), 맛비늘버섯 (중국), 비늘버섯 (스웨덴) 등 총 26개의 균주를 대상으로 유연관계 분석을 수행하였다.
대상 데이터
- 첫 번째 클러스터에는 검은비늘버섯 2 균주가 묶여 있으며, 두 번째 클러스터에는 검은비늘버섯 4 균주가 2개의 소그룹으로 묶여 있는데 이중 하나의 균주는 서울, 3균주는 경기도에서 채집된 균주였다. 세 번째 클러스터에는 상동성이 높은 맛비늘버섯의 2개 균주가 하나의 클러스터를 이루고 있으며 이 균주는 각각 중국의 장수성과 일본의 오사카에서 채집한 균주였다. 그러나 이 클러스터와 연결된 외곽에 맛버섯의 2 균주가 하나로 묶여 있는데 이들 균주는 각각 일본의 홋카이도와 오사카에서 온 균주로 지역이 달라도 상동성이 높게 나타났다.
- 실험에 사용한 버섯균주는 인천대학교 버섯균주 및 DNA은행에서 보존 중인 균주를 분양 받아 사용하였으며, -80oC에 보관중인 버섯균주를 신속하게 해동시켜 감자한천배지 [Potato Dextrose Agar (PDA)]배지에 접종하여 1주일 배양하여 실험에 사용하였으며, 또한 개암다발버섯 (한국), 검은비늘버섯 (한국), 노란갓비늘버섯 (한국), 땅비늘버섯 (미국), 맛비늘버섯 (중국), 비늘버섯 (스웨덴) 등 6종의 버섯균주는 rDNA의 ITS 염기서열 정보가 등록되어 있는 NCBI 의 GenBank에서 rDNA의 ITS 영역의 염기서열 정보를 내려 받아 본 실험의 분석결과와 통합하여 계통도를 작성하였다. 실험에 사용한 버섯균주의 내용은 Table 1에 요약하였다.
- 따라서 실험에 사용된 버섯은 계통도에 따라 총 8개의 작은 클러스터로 나누어졌다. 첫 번째 클러스터에는 검은비늘버섯 2 균주가 묶여 있으며, 두 번째 클러스터에는 검은비늘버섯 4 균주가 2개의 소그룹으로 묶여 있는데 이중 하나의 균주는 서울, 3균주는 경기도에서 채집된 균주였다. 세 번째 클러스터에는 상동성이 높은 맛비늘버섯의 2개 균주가 하나의 클러스터를 이루고 있으며 이 균주는 각각 중국의 장수성과 일본의 오사카에서 채집한 균주였다.
이론/모형
- 이때 Nxy는 각각의 두 균주가 공유하는 band의 수이고, Nx와 Ny는 두 균주 각각의 band 수이다(Nei and Li, 1979). Dendrogram은 위의 유사도의 값을 근거로 UPGMA(unweighted paired group methods with arithmatic average)법을 이용하여 작성하였다.
- 다형성 분석을 위하여 각각의 균주에서 추출한 염색체 DNA를 RAPD-PCR 방법을 이용하여 증폭하였다(Williams et al., 1990). 10 base의 oligonucleotide (Operon Technologies, Inc.
- 0 (for WIN)으로 옮겨서 분석한 후 계통도를 작성하였다. 본 연구에서 사용된 분석방법은 근린산술결합법(NeighborJoining method)로서 최근 유연관계 분석에 가장 많이 사용되고 있다. 또한 이 방법에 bootstraping을 병행하여 1000회를 반복 분석하였다.
- 우리나라와 일본의 여러 지역에서 수집된 비늘버섯 속 20점의 버섯 다양성을 RAPD 기법을 이용하여 실험을 수행하였다. 이들 7종의 버섯 20균주는 고체배지 상에서 7일 배양하고 균사체를 수확한 후 염색체 DNA를 추출하였다.
- 추출된 각 DNA들의 ITS region 증폭을 위하여 White 등(1990)에 의해 보고된 곰팡이류에서 많이 사용되는 ITS region 증폭용 primer set인 ITS1(forward: 5’TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’)와 ITS4(reverse: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’)를 이용하였다.
성능/효과
- 우리나라와 전 세계의 여러 지역에서 수집한 비늘버섯속 18 균주와 개암비늘버섯 2 균주를 대상으로 rDNA의 ITS region 염기서열과 genomic DNA의 RAPD-PCR을 수행하였다. ITS1과 ITS2영역의 염기의 수는 각각 233~271, 158~233 그리고 174~219 염기쌍으로 종에 따라 변이가 있었는데 ITS2영역의 염기서열이 ITS1의 영역보다 변이가 높았고 5.8S지역의 염기의 수는 비교적 변이가 적었다. 각각의 균주 간 유연관계를 알아보기 위해 ITS영역의 염기서열을 이용하여 계통도를 작성한 결과 실험에 사용한 균주는 8개의 클러스터로 나누어지는 것으로 나타났으며 동일한 종의 버섯은 동일한 클러스터에 속하는 것으로 나타났다.
- 이들 7종의 버섯 20균주는 고체배지 상에서 7일 배양하고 균사체를 수확한 후 염색체 DNA를 추출하였다. OPA-1에서 OPA-20까지 총 20가지의 primer를 이용하여 추출된 염색체를 대상으로 RAPD 반응을 수행하여 primer 별로 DNA를 증폭시키고 전기영동 후 확인한 결과, 20개의 primer 중에 OPA-1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18, 19 등 15개의 primer가 염색체 DNA를 효과적으로 증폭시키는 것으로 나타났다(Figs. 2-4). 이 RAPD 반응에서 각각의 primer에 따라 증폭된 DNA의 단편 수는 적은 것은 1개 많은 것은 5개, 단편의 크기는 0.
- 8S지역의 염기의 수는 비교적 변이가 적었다. 각각의 균주 간 유연관계를 알아보기 위해 ITS영역의 염기서열을 이용하여 계통도를 작성한 결과 실험에 사용한 균주는 8개의 클러스터로 나누어지는 것으로 나타났으며 동일한 종의 버섯은 동일한 클러스터에 속하는 것으로 나타났다. 또한 20종류의 primer를 이용하여 비늘버섯속 버섯을 대상으로 RAPD-PCR을 수행한 결과 15개의 primer가 효과적으로 염색체 DNA를 증폭하는 것으로 나타났다.
- 따라서 앞으로 PCR을 이용해검은비늘버섯을 정확히 동정하기 위해서는 다양한 검은비늘버섯 균주를 대상으로 추가적인 PCR 분석이 필요하다고 판단되었다. 그러나 본 실험에서 PCR 기법을 이용해 비늘버섯속 버섯의 rDNA의 ITS 영역 염기서열을 분석한 결과 검은비늘버섯을 제외한 대부분의 비늘버섯속에 속하는 버섯의 종을 동정하는데 유용하였다. 또한 본 실험 결과는 Park 등 (2004)이 rDNA ITS 영역의 PCR을 통해 노루궁뎅이 버섯의 종이나 품종을 구분하는 것이 가능했다는 결과와 일치하였다.
- 그러나 이 클러스터와 연결된 외곽에 맛버섯의 2 균주가 하나로 묶여 있는데 이들 균주는 각각 일본의 홋카이도와 오사카에서 온 균주로 지역이 달라도 상동성이 높게 나타났다. 네 번째 클러스터는 노란갓비늘버섯으로 하나의 균주는 전라북도에서 채집한 균주였고 다른 하나는 경기도에서 채집한 균주인데 이들 균주 간 상동성은 매우 높았다. 다섯 번째 클러스터는 개암비늘버섯로 구성되어 있는데 이들은 각각 서울과 영국의 Hampshire에서 채집한 균주인데 ITS 영역의 염기서열의 분석을 통해 상동성은 매우 높아 동일한 종인 것으로 확인되었다.
- 네 번째 클러스터는 노란갓비늘버섯으로 하나의 균주는 전라북도에서 채집한 균주였고 다른 하나는 경기도에서 채집한 균주인데 이들 균주 간 상동성은 매우 높았다. 다섯 번째 클러스터는 개암비늘버섯로 구성되어 있는데 이들은 각각 서울과 영국의 Hampshire에서 채집한 균주인데 ITS 영역의 염기서열의 분석을 통해 상동성은 매우 높아 동일한 종인 것으로 확인되었다. 여섯 번째의 클러스터는 4개의 비늘버섯이 하나의 클러스터를 이루고 있는데 상동성이 매우 높은 3개의 균주가 하나의 그룹을 그리고 상동성이 떨어지는 하나의 균주가 묶여있다.
- , 2009a). 따라서 균주 별로 나타난 각각의 DNA 단편을 UPGMA 방법을 이용하여 클러스터링(clustering)한 결과 이들 7종의 버섯 20균주는 7개의 소규모 클러스터로 나눠졌으며 각각의 작은 클러스터 내에는 채집지역은 달라도 동일한 종의 버섯균주가 묶이는 것으로 나타나 이는 rDNA의 ITS 영역의 염기서열을 이용해 작성한 계통도의 결과와 유사하게 나타났다. Lim 등(2010)에 의하면 종이나 품종 특유의 primer를 이용해 RAPD PCR을 수행해 만가닥버섯의 종이나 품종을 구분할 수 있었다고 보고하였다.
- 각각의 균주 간 유연관계를 알아보기 위해 ITS영역의 염기서열을 이용하여 계통도를 작성한 결과 실험에 사용한 균주는 8개의 클러스터로 나누어지는 것으로 나타났으며 동일한 종의 버섯은 동일한 클러스터에 속하는 것으로 나타났다. 또한 20종류의 primer를 이용하여 비늘버섯속 버섯을 대상으로 RAPD-PCR을 수행한 결과 15개의 primer가 효과적으로 염색체 DNA를 증폭하는 것으로 나타났다. 증폭의 양상은 primer의 종류와 종에 따라 변이가 있었다.
- 이 결과를 토대로 계통수를 작성한 결과 계통수는 ITS 영역의 PCR 결과와 매우 유사하였다. 본 실험 결과, 실험에 사용한 비늘버섯속 버섯의 종과 계통 간의 유연관계는 높았으며, rDNA ITS 영역의 염기서열 분석 결과를 이용해 공시된 각각의 비늘버섯 종을 분류하는데 유용하게 사용이 가능하였다.
- 실험에 사용한 비늘버섯 속 균주의 ITS1, 5.8S, ITS2 영역의 염기의 수를 분석한 결과 총 염기의 수는 595668 bp로 균주 간 73 bp의 염기 수의 차이가 있었다. ITS1 영역의 염기의 수는 233271 bp, ITS2 영역의 염기의 수는 174214 bp였다.
- 2-4). 이 RAPD 반응에서 각각의 primer에 따라 증폭된 DNA의 단편 수는 적은 것은 1개 많은 것은 5개, 단편의 크기는 0.6 kb에서 1.7 kb까지 다양한 것으로 확인하였다. 이 실험에 사용된 20개의 primer는 곰팡이의 종내 유연성과 유전적 다양성을 밝히기 위해 널리 사용되고 있는 primer이다(Alam et al.
- 증폭의 양상은 primer의 종류와 종에 따라 변이가 있었다. 이 결과를 토대로 계통수를 작성한 결과 계통수는 ITS 영역의 PCR 결과와 매우 유사하였다. 본 실험 결과, 실험에 사용한 비늘버섯속 버섯의 종과 계통 간의 유연관계는 높았으며, rDNA ITS 영역의 염기서열 분석 결과를 이용해 공시된 각각의 비늘버섯 종을 분류하는데 유용하게 사용이 가능하였다.
- 일곱 번째 클러스터에는 상동성이 매우 높은 진노랑비늘버섯 2 균주와 이에 비해 상동성이 조금 떨어지는 진노랑비늘버섯 2개 균주가 하나의 클러스터를 이루고 있다. 이들 버섯은 모두 한국의 경기도, 경기도, 인천, 전라북도 등 다양한 지역에서 채집한 균주였지만 상동성이 높아 동일한 균주로 동정되었다. 마지막 클러스터에는 총 3개의 균주가 하나의 클러스터를 이루고 있는데 의외로 이들 균주 상동성이 높지 않았다.
- 이들 균주 중 2개의 균주는 땅비늘버섯인데 인천과 미국에서 채집된 것이고, 나머지 하나는 땅비늘버섯이 아닌 검은비늘버섯으로 경기도에서 채집한 것인데 동일한 클러스터에 묶여 있어 종을 확정하는데 어려움이 있었다. 이러한 결과가 나오게 된 원인으로는 검은비늘버섯의 rDAN ITS 영역의 염기서열의 변이의 범위가 커서 생긴 것일 수도 또는 비늘버섯 채집시 Pholiota속의 다른 종의 버섯을 오동정해서 생긴 문제점일 수도 있다고 사료되었다. 따라서 앞으로 PCR을 이용해검은비늘버섯을 정확히 동정하기 위해서는 다양한 검은비늘버섯 균주를 대상으로 추가적인 PCR 분석이 필요하다고 판단되었다.
후속연구
- Lim 등(2010)에 의하면 종이나 품종 특유의 primer를 이용해 RAPD PCR을 수행해 만가닥버섯의 종이나 품종을 구분할 수 있었다고 보고하였다. 따라서 본 실험을 통해 RAPD-PCR이 버섯의 종 내의 변이를 확인하는 것 외에도 버섯의 종간 분류와 동정에도 효과적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다(Fig. 5).
- 이러한 결과가 나오게 된 원인으로는 검은비늘버섯의 rDAN ITS 영역의 염기서열의 변이의 범위가 커서 생긴 것일 수도 또는 비늘버섯 채집시 Pholiota속의 다른 종의 버섯을 오동정해서 생긴 문제점일 수도 있다고 사료되었다. 따라서 앞으로 PCR을 이용해검은비늘버섯을 정확히 동정하기 위해서는 다양한 검은비늘버섯 균주를 대상으로 추가적인 PCR 분석이 필요하다고 판단되었다. 그러나 본 실험에서 PCR 기법을 이용해 비늘버섯속 버섯의 rDNA의 ITS 영역 염기서열을 분석한 결과 검은비늘버섯을 제외한 대부분의 비늘버섯속에 속하는 버섯의 종을 동정하는데 유용하였다.
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