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문제 정의
- 피부와 관련하여 황기는 피부수분함량 측정 시험에서 보습효과가 확인되었다13). 앞서 설명하였듯이 HA의 함량 증가는 보습효과에 한 기전으로 황기가 어떻게 보습효과를 보이는지 알기위하여 human keratinocyte인 HaCaT에서 HA 생산과 HYAL 저해에 미치는 영향을 알아보았다.
제안 방법
- 1. 황기추출물은 비교적 독성이 약했으며 50, 100, 200 ㎍/㎖을 처리 농도로 정하였다.
- 80% 메탄올 황기 추출물을 10, 50, 100 ㎍/㎖로 처리하여 먼저 MTT assay를 하였고 다음에 100 ~ 300㎍/㎖ 농도 범위에서 생존율을 확인하였다. 10 ~ 300㎍/㎖에서 독성을 보이지는 않았다(Fig.
- 1%) 처리군과 80% 메탄올 황기추출물 100 ㎍/㎖ 처리군의 HAS2 유전자발현 정도를 비교하여 황기 처리군에서 HAS2 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. 80% 메탄올 황기 추출물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리했을 때의 HAS2 유전자의 발현 양상을 RT-PCR로 확인하였다. 양성대조군인 ATRA 1 µM 처리했을 때 HAS2의 유전자 발현이 매우 현저하게 늘어남을 확인 할 수 있었으며 처리 농도 범위 내에서 HAS2의 유전자 발현량이 늘어남을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 5 ㎖)를 넣어주고 다시 37℃에서 20분간 방치한 후 585 nm에서 흡광도를 측정하였다. HYAL 저해제로 알려진 glycyrrhizin과 isoliquiritigenin을 함유한 감초 및 항알러지 약물인 disdium cromoglycate (DSCG)와 비교하였다. 저해율은 [(ODc - ODs) / ODc] x 100 (%)로 계산하였다.
- RNA 농도와 순도 (OD260 / OD280)를 측정한 후에 2 ㎍ RNA로 power cDNA synthesis kit (intron)을 이용하여 cDNA 합성을 하였다. PCR은 premix PCR kit (Solgent)을 이용하였다. PCR product는 1.
- 24시간동안 배양해준 후에 easyBlue (intron)로 RNA를 추출하였다. RNA 농도와 순도 (OD260 / OD280)를 측정한 후에 2 ㎍ RNA로 power cDNA synthesis kit (intron)을 이용하여 cDNA 합성을 하였다. PCR은 premix PCR kit (Solgent)을 이용하였다.
- Isoflavone 천연물을 함유하는 한약재들이 HA함량증가를 통한 보습효과를 보일 가능성이 있으며 보습 관련 화장품의 원료로서 이용가치가 있을 것으로 생각한다. 본 실험에서 황기의 메탄올 추출물은 양성대조군 ATRA과 비교하여 HA를 급격히 증가 시키지는 못했으나 HAS2 유전자 발현을 유도하고 소폭 HA의 함량을증가시켰다. 이는 황기가 갖는 보습효과에 부분적으로 HA 증가가 관여할 수도 있음을 보여준다.
- 황기 추출물 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리 했을 때 HA 의 생성량을 확인하기 위해 ELISA kit를 사용하였다. 48시간 처리가 24시간 처리보다 모든 샘플에서 HA 생성량이 늘었음을 확인 하였으며 양성대조군으로 사용한 ATRA (1 µM) 처리했을 때 HA 생성량이 24시간과 48시간에서 각각 598.
대상 데이터
- ATRA 1 µM을 양성대조군으로 사용하였다.
- All-trans-retinoic acid (ATRA, sigma) 1 µM을 양성대조군으로 사용하였다.
- HaCaT 세포는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)에 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco)과 1% penicillin-streptomycin (PS, Gibco)이 함유된 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 감초와 황기는 퓨어마인드제약 (경북, 영천)에서 구입하였으며 시료는 세명대 자연약재과학과 천연물실험실에 보관 중 사용하였다. 약재는 100 g을 측정하여 80% (v/v) 메탄올 용매에 담가 냉침하였다.
데이터처리
- 통계는 Student's t-test를 이용하였으며 유의성 기준을 p value가 0.05 미만일 경우로 설정하였다.
이론/모형
- 15,000 x g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 ELISA 할 때 까지 -20℃에서 보관하였다. ELISA는 HA-ELISA kit (echelon)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. ATRA 1 µM을 양성대조군으로 사용하였다.
- Hyaluronidase enzyme assay는 Morgan-Elson method에 따랐다. Bovine hyaluronidase 50 ㎕ (8㎎/㎖, 0.
성능/효과
- 2. 황기추출물 200 ㎍/㎖에서 Hyaluronidase에 대해 8.73%의 저해율을 보였으며 감초와 DSCG는 각각 35.78%와 31.17%의 저해율을 보였다.
- 4. 황기 추출물 50, 100, 200 ㎍/㎖을 처리했을 때 DMSO 0.1% 처리한 vehicle 군과 비교하여 24시간에서는 각각 50.55%, 77.2 %, 108.33% 증가하였고 48시간에서는 각각 51.67%, 61.59%, 59.19% 증가하였다.
- 48시간 처리가 24시간 처리보다 모든 샘플에서 HA 생성량이 늘었음을 확인 하였으며 양성대조군으로 사용한 ATRA (1 µM) 처리했을 때 HA 생성량이 24시간과 48시간에서 각각 598.28±39.36 ng/㎖ 과 915.63±23.33 ng/㎖로 현저히 늘어남을 확인하였다.
- DMSO (0.1%) 처리군과 80% 메탄올 황기추출물 100 ㎍/㎖ 처리군의 HAS2 유전자발현 정도를 비교하여 황기 처리군에서 HAS2 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다. 80% 메탄올 황기 추출물을 50, 100, 200 ㎍/㎖ 처리했을 때의 HAS2 유전자의 발현 양상을 RT-PCR로 확인하였다.
- 양성대조군인 ATRA 1 µM 처리했을 때 HAS2의 유전자 발현이 매우 현저하게 늘어남을 확인 할 수 있었으며 처리 농도 범위 내에서 HAS2의 유전자 발현량이 늘어남을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
- 황기는 ononin, calycosin, formononetin등의 isoflavonoids를 함유하고 있다17,18). 위 이 논문에서 저자는 황기에 포함되어 있는 isoflavone인 ononin, calycosin, formononetin 의 함량이 발효에 의해 줄어들며 이는 isoflavone들이 aglycone의 형태나 혹은 다른 관련 물질로 대사함으로서 HA의 함량을 증가시키는데 관여함을 제시하였다. Genistein과 daidzein이 HA의 함량을 늘린다는 보고19)가 있는 것으로 보아 isoflavone들이 HA 생성에 관여할 수도 있을 것으로 생각한다.
후속연구
- Genistein과 daidzein이 HA의 함량을 늘린다는 보고19)가 있는 것으로 보아 isoflavone들이 HA 생성에 관여할 수도 있을 것으로 생각한다. Isoflavone 천연물을 함유하는 한약재들이 HA함량증가를 통한 보습효과를 보일 가능성이 있으며 보습 관련 화장품의 원료로서 이용가치가 있을 것으로 생각한다. 본 실험에서 황기의 메탄올 추출물은 양성대조군 ATRA과 비교하여 HA를 급격히 증가 시키지는 못했으나 HAS2 유전자 발현을 유도하고 소폭 HA의 함량을증가시켰다.
- 인삼에서 분리한 compound K의 경우 1 µM의 24시간 처리에서 약 200%넘는 효과를 보였다6) . 많은 한약재 추출물과 함유 성분에서 HA 증가 효과탐색이 가능할 것으로 사료된다.
- HA 감소는 HYAL의 작용으로 알려져 있다. 본 실험에 사용한 HYAL은 사람유래는 아니나 피부에서 HYAL 저해와 관련하여 간접적으로 확인할 수 있을 것으로 생각한다. 황기의 HYAL 활성저해에 관해서는 보고된 바가 있다14).
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