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문제 정의
- , 2006). 그러므로 본 연구에서는 배추 작물의 불임성 소재 개발과 우수한 유전자원 및 신품종 보호를 위해 이원적 전사유도 시스템의 기능을 공동형질전환 방법을 통해 조기 검정하고자 하였다. 또한 자성 배우체 특이적 발현 프로모터를 이원적 전사유도 시스템에 도입하여 조직 특이적으로 발현을 유도하는 이원적 전사유도 시스템의 기능을 검정하고자 하였다.
- 그러므로 본 연구에서는 배추 작물의 불임성 소재 개발과 우수한 유전자원 및 신품종 보호를 위해 이원적 전사유도 시스템의 기능을 공동형질전환 방법을 통해 조기 검정하고자 하였다. 또한 자성 배우체 특이적 발현 프로모터를 이원적 전사유도 시스템에 도입하여 조직 특이적으로 발현을 유도하는 이원적 전사유도 시스템의 기능을 검정하고자 하였다.
제안 방법
- 16개의 형질전환체 중에서 2단계의 PCR 검정을 통해 선발된 10개의 T1 공동형질전환체를 이용하여 reporter 유전자의 발현을 분석하였다. GUS 발색시약에 암술 조직을 침지한 결과 공동형질전환된 애기장대의 암술조직 내의 자성 배우체에서 GUS 유전자의 발현에 의해 푸른색이 나타났다(Fig.
- Activator construct (35SLhG1300와 795LhGBart)의도입을 검정하기 위해 LhG4 유전자 특이적 프라이머 F1 (5’-ATGAAACCGGTAACGTTATACGACG-3’)과 R2 (5’- TTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTGGGG-3’)를 사용하였고 reporter construct (pOpGUSBart)의 도입을 검정하기 위하여 GUS 유전자 특이적 프라이머 F2 (5’-CAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGAT-3’)와 R2 (5’-CTATCAGCTCTTTAATGCCTGTAAGT-3’)를 사용하였다.
- DNA 농도는 NanoVue(GE healthcare, USA)로 측정한 후 각각의 카세트 도입을 검정하기 위하여 30μg의 DNA를 100units의 SalI (Fig. 2A) 또는 NotI(Fig. 2B)으로 각각 자른 후 전기영동하여 Nylon HybondTM-N+ membrane(Amersham Life science, UK)에 블롯팅하였다.
- 1kb부분을 이용하였다. LhG4 유전자 카세트(Dr. John Bowman 실험실에서 분양 받음)에 At1g26795 프로모터(ProAt1g26795)를 삽입한 후 제초제 저항성 유전자를 포함하는 pMLBart(Gleave, 1992) 카세트로 옮겨 조직 특이적 activator construct (795LhGBart)를 작성하였다(Fig. 2C).
- 2B)으로 각각 자른 후 전기영동하여 Nylon HybondTM-N+ membrane(Amersham Life science, UK)에 블롯팅하였다. RedyprimeIITM Random Prime labeling System (Amersham Life science, UK)을 이용하여 hpt 유전 자와 bar 유전자의 탐침을 제작하여 혼성화 반응을 수행한 후 세척하고(Sambrook et al., 1989) BAS-1800II Bio-Imaging analyzer(FUJIFILM, Japan)를 이용하여 밴드를 확인하였다.
- Southern 분석을 위해 2-3g 배추 식물체로부터 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 버퍼를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다(Raz and Ecker, 1997). DNA 농도는 NanoVue(GE healthcare, USA)로 측정한 후 각각의 카세트 도입을 검정하기 위하여 30μg의 DNA를 100units의 SalI (Fig.
- PCR 검정과 Southern 분석을 통해 형질전환체의 유전자의 도입여부를 확인하였다. 식물체 내에서 카세트의 도입 여부를 확인하기 형질전환 식물체의 잎으로부터 DNeasy kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 gemomic DNA를 분리하였다. Activator construct (35SLhG1300와 795LhGBart)의 도입을 검정하기 위해 LhG4 유전자 특이적 프라이머 F1 (5’-ATGAAACCGGTAACGTTATACGACG-3’)과 R2 (5’- TTACTCTTTTTTTGGGTTTGGTGGGG-3’)를 사용하였고 reporter construct (pOpGUSBart)의 도입을 검정하기 위하여 GUS 유전자 특이적 프라이머 F2 (5’-CAAGAAAAAGCA GTCTTACTTCCATGAT-3’)와 R2 (5’-CTATCAGCTCTT TAATGCCTGTAAGT-3’)를 사용하였다.
- 애기장대의 공동형질 전환은 혼합된 배양액을 애기장대의 꽃봉오리에 분무하는 방법이 사용되었으며 접종 후 1일간 온도 25℃, 습도 100% 배 양기 내에서 배양하였다. 공동형질전환으로 획득한 애기장대의 T1 형질전환체는 1차적으로 제초제(0.3%, phosphinothricin)로 선발 한 후 PCR을 이용하여 공동형질전환체를 선발하였다.
- 대조구로 activator construct(35SLhG1300)와 reporter construct(pOpGUSBart)가 도입된 아그로박테리움을 각각 배 추 절편체에 접종하여 형질전환하였다. Activator construct가 도입된 2988개 절편체는 접종 후 하이그로마이신을 포합하는 선발배지에 선발하여 73개의 재분화 식물체를 획득하였다.
- 또한 pOp 프로모터 카세트(Dr. John Bowman 실험실에서 분양 받음)에 GUS(β-glucuronidase) 유전자를 삽입한 후 제초제 저항성 유전자를 포함하는 pMLBart 카세트로 옮겨서 reporter construct(pOpGUSBart)를 작성하였다(Fig. 2B).
- 위의 결과는 배추 형질전환체에서 activator와 프로모터의 활성에 의해 reporter 유전자의 발현이 유도되는 것을 보여줌으로써 이원적 전사유도 시스템이 배추작물에서 이용될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 이 시스템의 이용가능성을 공동형질전환 방법으로 검정하여 이원적 전사유도 시스템의 기능을 배추 작물에서 조기에 검정할 수 있는 방법을 구축하였다.
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배추에서 이원적 전사유도 시스템 도입 조기 검정을 위한 공동형질전환
배추 작물에서 이원적 전사유도 시스템의 조기 검정을 위해 activator construct(35SLhG1300)와 reporter construct (pOpGUSBart)가 각각 도입된 아그로박테리움을 혼합하여 배추의 절편체에 접종한 후, 하이그로마이신과 PPT가 포함된 배지에서 선발하였다. Activator construct와 reporter construct가 도입되지 않은 절편체는 빠르게 갈변되어 고사 하였으나 두 construct가 동시에 도입된 절편체는 캘러스를 형성한 후 신초로 분화되어 총 7974개의 절편체 중에서 8개가 신초로 재분화하였다.
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식물 형질전환용 Activator Construct와 Reporter Construct 작성
이원적 전사유도시스템의 구성요소인 activator construct (35SLhG1300)는 LhG4 유전자 카세트(Dr. John Bowman 실험실에서 분양 받음)에 35S 프로모터를 삽입한 후 하이그로마이신(C20H37N3O13) 선발 유전자를 포함하고 있는 pCAMBIA1300카세트로 옮겨 작성하였다(Fig. 2A). 또한 pOp 프로모터 카세트(Dr.
- 애기장대 형질전환체의 잎조직과 꽃봉오리는 동일한 방법 으로 염색한 후 엽록체를 제거하고 관찰하였다. 자성배우체 검경을 위해 암술을 염색한 후 자성배우체만 분리하여 Hoyer 배지를 이용하여 조직을 투명화 한 다음 광학 현미경(Lica DMLB, Germany)으로 관찰하였다(Meinke et al.
- 형질전환체의 잎조직을 샘플링하여 GUS 침전액에 37℃에 서 16시간 동안 침지하였다. 염색이 끝난 조직은 70% 에탄올을 이용하여 엽록체를 완전히 제거한 다음 실체 현미경 (iMT technology i-30, USA)을 이용하여 관찰하였다.
- 이원적 전사유도 시스템의 기능을 검정하고자 reporter 유전자 GUS의 발현을 분석하였다. 형질전환된 배추 형질전환체(T0 세대)의 잎 조직을 GUS 침전액에 염색하여 관찰한 결과 공동형질전환된 식물체의 잎 조직은 모두 푸른색이 나타났으나, activator construct 또는 reporter construct 단독으로 도입된 형질전환체의 잎은 모두 색이 나타나지 않았다 (Figs.
- 이원적 전사촉진 시스템의 활용성을 높이기 위하여 이 시스템에 조직 특이적 프로모터를 도입하여 기능을 검정하였다. 조직 특이적 프로모터 중에서 자성배우체 특이적 발현 프로모터(ProAt1g26795)를 도입한 activator construct(795LhGBart)를 작성 후 reporter construct와 동시에 애기장대에 공동형질전환 하였다(Fig.
- 애기장대 형질전환체의 잎조직과 꽃봉오리는 동일한 방법 으로 염색한 후 엽록체를 제거하고 관찰하였다. 자성배우체 검경을 위해 암술을 염색한 후 자성배우체만 분리하여 Hoyer 배지를 이용하여 조직을 투명화 한 다음 광학 현미경(Lica DMLB, Germany)으로 관찰하였다(Meinke et al., 1994).
- 이원적 전사촉진 시스템의 활용성을 높이기 위하여 이 시스템에 조직 특이적 프로모터를 도입하여 기능을 검정하였다. 조직 특이적 프로모터 중에서 자성배우체 특이적 발현 프로모터(ProAt1g26795)를 도입한 activator construct(795LhGBart)를 작성 후 reporter construct와 동시에 애기장대에 공동형질전환 하였다(Fig. 2C). 제초제 저항성을 가진 32개 형질전환체 중에서 activator construct와 reporter construct가 도입된 형질전환체는 각각 78.
- , 1996). 혼합 배양액에 접종한 배축 조직은 공동배양 배지에서 2일간 공동배양 후 하이그로마이신과 phosphinothricin(PPT)가 포함된 선발배 지에 치상한 후 2주마다 계대배양하였다.
대상 데이터
- 대조구로 activator construct(35SLhG1300)와 reporter construct(pOpGUSBart)가 도입된 아그로박테리움을 각각 배 추 절편체에 접종하여 형질전환하였다. Activator construct가 도입된 2988개 절편체는 접종 후 하이그로마이신을 포합하는 선발배지에 선발하여 73개의 재분화 식물체를 획득하였다. PCR 검정 결과, LhG4 유전자 도입이 확인된 개체는 70개였다.
- 배추 작물에서 이원적 전사유도 시스템의 조기 검정을 위해 activator construct(35SLhG1300)와 reporter construct (pOpGUSBart)가 각각 도입된 아그로박테리움을 혼합하여 배추의 절편체에 접종한 후, 하이그로마이신과 PPT가 포함된 배지에서 선발하였다. Activator construct와 reporter construct가 도입되지 않은 절편체는 빠르게 갈변되어 고사 하였으나 두 construct가 동시에 도입된 절편체는 캘러스를 형성한 후 신초로 분화되어 총 7974개의 절편체 중에서 8개가 신초로 재분화하였다. 공동형질전환된 재분화 신초를 PCR을 이용하여 검정한 결과, 재분화된 모든 신초에서 activator construct의 LhG4 유전자가 증폭된 1346bp의 DNA 밴드와 reporter construct의 GUS 유전자가 증폭된 728bp의 DNA 밴드가 증폭되어 각각의 construct가 안정적으로 도입되어 있다는 것을 확인하였다(Figs.
- , 2011). 애기장대의 형질전환은 애기장대(Arabidopsis thaliana, Columbia-0) 종자와 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens GV3101)을 사용하였다. 애기장대의 공동형질 전환은 혼합된 배양액을 애기장대의 꽃봉오리에 분무하는 방법이 사용되었으며 접종 후 1일간 온도 25℃, 습도 100% 배 양기 내에서 배양하였다.
- 조직 특이적 activator construct 작성을 위해 애기장대의 자성 배우체 특이적 발현 유전자 At1g26795의 상위 약 1.1kb부분을 이용하였다. LhG4 유전자 카세트(Dr.
데이터처리
- 이러한 공동형질전환의 선발 효율은 공동형질전환이 다양한 목적으로 배추의 형질전환체 생산에 이용될 수 있는 가능성을 보여 주는 것으로 생각된다. PCR 검정으로 유전자 도입여부를 확인한 형질전환체는 Southern 분석을 통하여 도입 유전자 수를 확인하였다. Southern을 통한 검정결과, 형질전환되지 않은 대조군(NC)에서는 어떠한 밴드로 나타나지 않았으나 형질전환된 식물체는 1-6개의 밴드가 확인되어 각각의 이원적 전사유도 카세트가 배추의 genomic DNA 내에 각각 안정적으로 도입되어 있음을 알 수 있었다(Fig.
이론/모형
- (2000)와 Kang and Park(2001)의방법을 기초로 ‘서울’ 배추(Brassica rapa L. ssp. Pekinensiscv. Seoul)를 이용하여 수행하였다.
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GUS 활성 분석을 통한 이원적 전사 유도 시스템 확인
배추 형질전환체에서 GUS 유전자의 활성을 확인하기 위 하여 GUS 염색방법을 이용하였다(Jefferson et al., 1987). 형질전환체의 잎조직을 샘플링하여 GUS 침전액에 37℃에 서 16시간 동안 침지하였다.
성능/효과
- 공동형질전환체를 이용하여 reporter 유전자의 발현을 분석하였다. GUS 발색시약에 암술 조직을 침지한 결과 공동형질전환된 애기장대의 암술조직 내의 자성 배우체에서 GUS 유전자의 발현에 의해 푸른색이 나타났다(Fig. 7A). 또한 화기의 어린 꽃 봉오리에서도 약간의 푸른 색을 띄었는데 이는 GUS 염색이 번진 것으로 생각되며, 대부분이 자성 배우체에서만 선명한 푸른색을 나타내었고 (Fig.
- Activator construct가 도입된 2988개 절편체는 접종 후 하이그로마이신을 포합하는 선발배지에 선발하여 73개의 재분화 식물체를 획득하였다. PCR 검정 결과, LhG4 유전자 도입이 확인된 개체는 70개였다. Reporter construct가 도입되어 PPT로 선발된 형질 전환체는 7416개 절편체 중에서 18개의 재분화 식물체를 획득하였고, PCR 검정 결과 15개체에서 GUS 유전자의 도 입을 확인하였다(Figs.
- PCR 검정 결과, LhG4 유전자 도입이 확인된 개체는 70개였다. Reporter construct가 도입되어 PPT로 선발된 형질 전환체는 7416개 절편체 중에서 18개의 재분화 식물체를 획득하였고, PCR 검정 결과 15개체에서 GUS 유전자의 도 입을 확인하였다(Figs. 3C and 3D). 배추에서 공동형질전환의 선발효율은 0.
- PCR 검정으로 유전자 도입여부를 확인한 형질전환체는 Southern 분석을 통하여 도입 유전자 수를 확인하였다. Southern을 통한 검정결과, 형질전환되지 않은 대조군(NC)에서는 어떠한 밴드로 나타나지 않았으나 형질전환된 식물체는 1-6개의 밴드가 확인되어 각각의 이원적 전사유도 카세트가 배추의 genomic DNA 내에 각각 안정적으로 도입되어 있음을 알 수 있었다(Fig. 4).
- Activator construct와 reporter construct가 도입되지 않은 절편체는 빠르게 갈변되어 고사 하였으나 두 construct가 동시에 도입된 절편체는 캘러스를 형성한 후 신초로 분화되어 총 7974개의 절편체 중에서 8개가 신초로 재분화하였다. 공동형질전환된 재분화 신초를 PCR을 이용하여 검정한 결과, 재분화된 모든 신초에서 activator construct의 LhG4 유전자가 증폭된 1346bp의 DNA 밴드와 reporter construct의 GUS 유전자가 증폭된 728bp의 DNA 밴드가 증폭되어 각각의 construct가 안정적으로 도입되어 있다는 것을 확인하였다(Figs. 3A and 3B).
- 5%를 차지하였다. 또한 공동형질전환체 중에서 activator construct와 reporter construct가 단독으로 형질전환되어 제초제 저항성을 가지는 형질전환체는 각각 16.5%와 21.8%로써 두 종류의 카세트를 이용한 공동형질전환의 효율이 대체적으로 높다는 것을 알 수 있었다(Fig. 6).
- 이 결과는 이원적 전사유도 시스템에서 reporter 유전자의 발현이 activator의 발현패턴과 동일하게 나타나는 특성으로 조직특이적으로 발현하는 activator에 의해 reporter 유전자 GUS가 조직특이적으로 유도된 것이라고 생각된다. 반면에 activator construct 또는 reporter construct가 단독으로 도입된 형질전환체의 자성 배우체는 푸른 색을 나타내지 않았으며 화기와 잎 조직에서도 GUS 유전자 발현이 관찰되지 않았다(Figs. 7D, 7E, 7F, 7G, 7H, and 7I).
- 위의 결과는 배추 형질전환체에서 activator와 프로모터의 활성에 의해 reporter 유전자의 발현이 유도되는 것을 보여줌으로써 이원적 전사유도 시스템이 배추작물에서 이용될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 또한 이 시스템의 이용가능성을 공동형질전환 방법으로 검정하여 이원적 전사유도 시스템의 기능을 배추 작물에서 조기에 검정할 수 있는 방법을 구축하였다.
- 2C). 제초제 저항성을 가진 32개 형질전환체 중에서 activator construct와 reporter construct가 도입된 형질전환체는 각각 78.1%와 84.3%였으며 두 construct가 동시에 도입된 개체는 20개체로써 전체 형질전환체의 62.5%를 차지하였다. 또한 공동형질전환체 중에서 activator construct와 reporter construct가 단독으로 형질전환되어 제초제 저항성을 가지는 형질전환체는 각각 16.
- 이원적 전사유도 시스템의 기능을 검정하고자 reporter 유전자 GUS의 발현을 분석하였다. 형질전환된 배추 형질전환체(T0 세대)의 잎 조직을 GUS 침전액에 염색하여 관찰한 결과 공동형질전환된 식물체의 잎 조직은 모두 푸른색이 나타났으나, activator construct 또는 reporter construct 단독으로 도입된 형질전환체의 잎은 모두 색이 나타나지 않았다 (Figs. 5A, 5B, 5C. and 5D). 공동형질전환된 식물체의 GUS발현은 형질전환 내의 activator LhG4가 reporter construct를 활성화시켜 이원적 전사유도 시스템이 정상적으로 작동되었기 때문에 GUS 유전자의 발현이 유도된 것으로 생각된다.
후속연구
- , 1998). 따라서 자성 배우체 발달관련과 같은 식물 생존과 번식에 치명적인 영향을 미칠 수 있는 유전자의 발현제어에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 즉 배추의 자성 배우체 발달에 필수적인 유전자를 reporter construct에 자성 배우체 특이적 프로모터를 activator construct로 작성하여 모본과 부본으로 형질전환한 후 교배를 통하여 자성불임 F1을 생산하는 방법으로 불임성 소재개발에 사용될 수 있을 것이다.
- 5E, 5F, 5G, and 5H). 또한 activator construct와 reporter construct가 독립적으로 도입된 대조구는 앞으로 모, 부본을 이용한 이원적 전사유도 시스템 검정에 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 본 실험에 사용된 조직 특이적 프로모터(ProAt1g26795)를 리포터 유전자를 이용하여 배추작물에서 검정한 결과, 조직 특이적인 발현을 보였으므로(자료 미제시) 이 프로모터는 앞으로 이원적 전사유도 시스템과 더불어 배추작물에 활용될 수 있을 것으로 생각된다. 이 시스템은 activator construct가 도입된 식물체와의 교배를 통해서만 reporter 유전자의 발현을 유도할 수 있어, 목적 유전자의 기능에 관계없이 reporter construct가 도입된 형질전환체는 정상적인 생육을 나타낸다(Moore et al.
- 또한 최근 애기장대의 자성 배우체 돌연변이체와 유전자 칩을 기반으로 한 자성 배우체 발달과 자성불임 기능 연구에 대한 유전자 정보가 축적되고 있으므로(Drews and Yadegari 2002; Yu et al, 2005) 이들 유전자의 발현을 이원적 전사유도 시스템을 통하여 제어함으로써 자성 배우체 불임을 유기하는 방법으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 이것은 목적 유전자의 발현을 시간적 공간적으로 조절할 수 있는 종합 제어 시스템으로 앞으로 배추 작물의 불임성 소재 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이며 더 나아가 우수한 유전자원을 보호하는 전략에 응용 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 2%와는 큰 차이가 없었다. 이러한 공동형질전환의 선발 효율은 공동형질전환이 다양한 목적으로 배추의 형질전환체 생산에 이용될 수 있는 가능성을 보여 주는 것으로 생각된다. PCR 검정으로 유전자 도입여부를 확인한 형질전환체는 Southern 분석을 통하여 도입 유전자 수를 확인하였다.
- 따라서 자성 배우체 발달관련과 같은 식물 생존과 번식에 치명적인 영향을 미칠 수 있는 유전자의 발현제어에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 즉 배추의 자성 배우체 발달에 필수적인 유전자를 reporter construct에 자성 배우체 특이적 프로모터를 activator construct로 작성하여 모본과 부본으로 형질전환한 후 교배를 통하여 자성불임 F1을 생산하는 방법으로 불임성 소재개발에 사용될 수 있을 것이다. 또한 최근 애기장대의 자성 배우체 돌연변이체와 유전자 칩을 기반으로 한 자성 배우체 발달과 자성불임 기능 연구에 대한 유전자 정보가 축적되고 있으므로(Drews and Yadegari 2002; Yu et al, 2005) 이들 유전자의 발현을 이원적 전사유도 시스템을 통하여 제어함으로써 자성 배우체 불임을 유기하는 방법으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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