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문제 정의
- 따라서 식품원료로써 이를 활용하기 위해서 식약청의 허가를 받을 수 있도록 2010년부터 식약청에서 시행하고 있는 새로운 식품원료의 안전성 평가 가이드라인의 기준에 부합되는 과학적이고 체계적인 연구결과가 필요하며(17), 우선적으로 식품원료화를 위한 전처리 조건을 확립하여 안전성을 검증할 필요가 있다. 따라서 본 연구를 통해서 식품원료화를 위한 흰점박이꽃무지의 분말 제조의 최적 조건을 확립하기 위하여 사육단계부터 유충 장 내용물로 인한 특유의 이취 및 오염원(세균 및 진균류) 등의 문제들을 해결할 수 있도록 전처리 조건 확립을 위한 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 흰점박이꽃무지를 식품원료화 하기 위한 전처리 조건을 설정하기 위해 세포독성, 이취감소 및 살균조건을 확립하였다. 유충에 살균 후 공급되는 세 가지 사료(참나무톱밥, 볏짚, 목초) 중에서 참나무톱밥을 공급하여 사육한 유충의 분말이 세포독성이 없었고, 유충의 발육단계를 크게 3령 유충, 용화직전 번데기, 번데기로 구분지은 후 각각의 분말이 가지는 세포독성 유무를 확인한 결과에서 세포독성은 나타나지 않았다.
- 사료별 세포독성 평가 흰점박이꽃무지 유충의 사육을 위한 사료는 모두 발효된 상태의 참나무톱밥, 목초, 볏짚을 증기로 5분간 살균처리한 후 공급하였다. 흰점박이꽃무지 유충을 식품원료로 사용하기 위해서 사료종류에 따른 독성 유무를 확인하기 위하여 생쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 cell을 대상으로 세포에 대한 독성 유무(cytotoxicity)를 확인하였다. 그 결과 볏짚을 먹인 유충 분말을 멸균수(DW)에 녹인 현탁액에서 대조군에 비해 약간의 세포증식 억제되는 경향이 확인되었으나, 참나무톱밥과 목초를 먹인 흰점박이꽃무지 분말에서는 세포독성이 없었다.
제안 방법
- 3령 유충의 밀도를 20∼100마리로 조절한 후, 각 그룹별로 12 cm×13 cm×5 cm(가로×세로×높이)의 일정한 공간에서 1∼5일간 절식시키며 사육밀도와 절식기간에 따른 동종포식증(cannibalism)으로 인한 유충의 생존율을 고려한 사육조건을 설정하였다.
- CellTiter 96® AQueous non-radioactive cell proliferation assay (MTS, Promega, Hollywood, CA, USA)를 20 μL/well로 첨가한 후 37°C의 5% CO2 incubator에서 4시간 반응시킨 다음, microplate reader(Beckman, Urbana, IL, USA)를 이용하여 optical density(OD) 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- brevitarsis larvae)은 발효 참나무톱밥(스머프 곤충나라, Gyeonggi, Korea), 발효 목초((주) 청정제주, Jeju, Korea), 발효 볏짚((주)남한산성, Gyeonggi, Korea)을 사료로 하는 3령 유충을 구입하였다. 각 사료는 증기 살균한 후 급여하였고, 실험실에서의 사육을 통해 발육시기에 따라 3령 유충(larvae), 용화직전 번데기(pre-pupa), 번데기(pupa)를 확보하였다. 3령 유충의 밀도를 20∼100마리로 조절한 후, 각 그룹별로 12 cm×13 cm×5 cm(가로×세로×높이)의 일정한 공간에서 1∼5일간 절식시키며 사육밀도와 절식기간에 따른 동종포식증(cannibalism)으로 인한 유충의 생존율을 고려한 사육조건을 설정하였다.
- 관능평가요원은 20대부터 40대 사이의 남녀를 무작위로 20명을 선발하였고 동결건조 흰점박이꽃무지 유충 분말의 색깔과 풍미에 대한 평가를 실시하기 위하여 관능평가요원에게 살균된 참나무톱밥을 섭취한 후, 각 1∼5일까지 절식상태로 배변 유도된 유충의 동결 건조한 분말을 각각 블라인드 테스트(blind test)로 선호도를 평가하였고, 평가결과는 전체 선택빈도를 합산하고 100%로 환산하였다.
- 동결 건조 흰점박이꽃무지 유충의 분말에서 발생되는 고유한 이취는 식품원료로서 이용될 경우 소비자의 기호도를 감소시키는 주요 원인이 될 수 있을 것으로 판단하고, 이를 해결하기 위해 우선적으로 유충의 장 내용물을 감소하기 위한 방법으로 절식을 통한 내용물 배출을 유도하였다. 이는 살균 참나무 발효톱밥을 3일간 공급한 후, 절식상태로 1∼5일까지 배변을 유도하였다.
- 동결건조 된 흰점박이꽃무지 유충 분말의 관능평가를 위해서 증기로 5분간 살균한 참나무톱밥을 급여 및 절식상태로 1∼5일까지 배변 유도 기간에 따른 동결건조 된 유충 분말의 색깔 및 풍미에 대한 관능평가를 실시하였다.
- 동결건조 유충 분말을 멸균수(DW)를 이용하여 용해한 다음 세균 검사를 위해 Luria-Bertani(LB, Sigma-Aldrich Co.) 고체배지에 도말 후 37°C에서 24시간 배양하였고, 진균 검사는 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 고체배지에 도말하고 37°C에서 48시간 배양 후 진균 존재 유무를 확인하였다.
- 발효된 사료(참나무 톱밥, 목초, 볏짚) 중 표준 사료 선정을 위해 증기로 5분간 살균한 사료를 3일간 공급한 후, 사료를 제거한 절식 상태로 1∼5일까지 배변을 유도하였다.
- 사료 및 발육단계별 분말을 각각 멸균수(distilled water, DW)와 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 넣은 후 초음파 분쇄기(Sonics Vibra cell sonicator, LabX, Midland, Canada)로 10초간 2회 파쇄하고, 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 0.25 μm 주사기 필터로여과하였으며 4℃에 보관하여 사용하였다.
- 사료를 제거한 3일 동안 절식상태로 배변 유도된 흰점박이꽃무지의 유충을 115°C, 0.9 kgf/cm3와 121°C, 1.3 kgf/cm3으로 각 5분, 10분 동안 고온고압 멸균을 실시한 후, -70°C 초저온 냉동고(NIHON freezer)에 24시간 이상 냉동시켰고, 동결건조기(Eyela)에 약 48～60시간 동안 건조한 후 일반 가정용 분쇄기를 이용하여 동결건조 분말을 확보하였다.
- 사료별 세포독성 평가 흰점박이꽃무지 유충의 사육을 위한 사료는 모두 발효된 상태의 참나무톱밥, 목초, 볏짚을 증기로 5분간 살균처리한 후 공급하였다. 흰점박이꽃무지 유충을 식품원료로 사용하기 위해서 사료종류에 따른 독성 유무를 확인하기 위하여 생쥐의 대식세포주인 RAW 264.
- 3령 유충(larvae)은 3일간 공급하였고 용화직전 번데기(pre-pupa)와 번데기(pupa)는 자연적인 변태 과정이 일어날 때까지 공급하였다. 절식 후, 24시간 간격으로 40마리씩 무작위 선발한 유충은 -70℃ 초저온 냉동고(NIHON freezer, Tokyo, Japan)에 24시간 이상 냉동시켰고, 동결건조기(Eyela, Tokyo, Japan)에 약 48～60시간 동안 건조한 후 일반 가정용 분쇄기를 이용하여 유충 분말을 확보하였다. 사료 및 발육단계별 분말을 각각 멸균수(distilled water, DW)와 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co.
- 흰점박이꽃무지 유충 분말 확보를 위해 증기로 5분간 살균한 참나무 발효톱밥을 3일 동안 섭취할 수 있도록 공급하였다. 사료를 제거한 3일 동안 절식상태로 배변 유도된 흰점박이꽃무지의 유충을 115°C, 0.
대상 데이터
- 생쥐의 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 penicillin-streptomycin 100 unit/mL와 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco, Grand Island, NE, USA)이 함유된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco) 배지를 사용하여 37°C의 5% CO2 incubator(다솔과학, Gyeonggi, Korea)에서 배양하였으며, 2일 간격으로 계대배양을 실시하였다.
- 유충에 살균 후 공급되는 세 가지 사료(참나무톱밥, 볏짚, 목초) 중에서 참나무톱밥을 공급하여 사육한 유충의 분말이 세포독성이 없었고, 유충의 발육단계를 크게 3령 유충, 용화직전 번데기, 번데기로 구분지은 후 각각의 분말이 가지는 세포독성 유무를 확인한 결과에서 세포독성은 나타나지 않았다. 세포독성 검사 결과를 토대로 식품원료 화하기 위한 유충의 표준사료는 세포독성이 전혀 나타나지 않고 전국 사육농가 중 가장 많이 이용하고 있는 발효 참나무 톱밥을 표준사료로 선정하였다. 흰점박이꽃무지의 분말 전처리 조건으로 증기로 5분 동안 살균처리를 통해 사료 내의 미생물을 제거한 참나무톱밥을 급여하고 3일간 절식상태로 배변유도 후, 중장에 존재하는 내용물의 잔여도가 현저히 감소됨을 확인하였다.
- 흰점박이꽃무지 유충(P. brevitarsis larvae)은 발효 참나무톱밥(스머프 곤충나라, Gyeonggi, Korea), 발효 목초((주) 청정제주, Jeju, Korea), 발효 볏짚((주)남한산성, Gyeonggi, Korea)을 사료로 하는 3령 유충을 구입하였다. 각 사료는 증기 살균한 후 급여하였고, 실험실에서의 사육을 통해 발육시기에 따라 3령 유충(larvae), 용화직전 번데기(pre-pupa), 번데기(pupa)를 확보하였다.
데이터처리
- 본 실험의 결과는 Microsoft Office Excel 2007 program(Microsoft, San Francisco, CA, USA)을 사용하여 평균과 표준편차(standard deviation, SD)를 구하였고, 각 결과에 따른 통계분석을 위해 Welch's ANOVA, oneway ANOVA, Chi-square test를 이용하여 그룹간의 유의성(p<0.05)을 분석하였다.
성능/효과
- 동결건조 된 흰점박이꽃무지 유충 분말의 관능평가를 위해서 증기로 5분간 살균한 참나무톱밥을 급여 및 절식상태로 1∼5일까지 배변 유도 기간에 따른 동결건조 된 유충 분말의 색깔 및 풍미에 대한 관능평가를 실시하였다. 각 시료의 색깔의 밝기에 따른 선호도와 풍미에 대한 선호도 조사 결과에서 증기로 찐 참나무톱밥을 3일 동안 공급한 후 절식 상태로 3일 동안 배변이 유도된 유충 분말이 색깔과 풍미 평가에서 각 75%, 37%로 가장 높은 선호도를 나타내었으며, 반면에 절식 후 1일간 배변이 유도된 유충 분말의 경우 풍미에 대한 선호도가 9%로 가장 낮은 것으로 나타났다(Fig. 4A, B). 이러한 결과를 토대로 절식 후 3일간 배변이 유도된 유충분말이 소비자의 기호도를 고려한 식품원료로 가장 적합할 것으로 판단된다.
- 7 cell을 대상으로 세포에 대한 독성 유무(cytotoxicity)를 확인하였다. 그 결과 볏짚을 먹인 유충 분말을 멸균수(DW)에 녹인 현탁액에서 대조군에 비해 약간의 세포증식 억제되는 경향이 확인되었으나, 참나무톱밥과 목초를 먹인 흰점박이꽃무지 분말에서는 세포독성이 없었다. 세포 성장에 미치는 영향과 농가에 수급의 원활함을 고려했을 때, 세포에 대한 독성이 없고 사육 농가 중 가장 많이 이용하고 있는 발효 참나무 톱밥을 흰점박이꽃무지의 표준사료로서 선정하는 것이 적합할 것으로 판단되었다(Fig.
- 흰점박이꽃무지의 분말 전처리 조건으로 증기로 5분 동안 살균처리를 통해 사료 내의 미생물을 제거한 참나무톱밥을 급여하고 3일간 절식상태로 배변유도 후, 중장에 존재하는 내용물의 잔여도가 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한 관능평가를 통해 3일간의 배변된 유충의 장 내용물의 잔여물이 감소함으로써 유충이 가지는 고유한 이취와 색깔이 눈에 띄게 개선되는 효과를 확인할 수 있었다. 배변 유도된 유충을 115°C, 0.
- 발육시기별 흰점박이꽃무지의 세포독성을 확인하기 위해 결과 최대성장단계인 3령 유충(larvae), 용화직전 유충(pre-pupa) 및 번데기(pupa)의 분말 현탁액을 처리한 모든 실험군에서 세포독성이 없었고, DW현탁액의 경우 대조군에 비해 유의적(p<0.05)으로 세포 증식 수준이 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 2A).
- 발육시기에 따른 유충 및 번데기의 분말이 식품원료로 사용될 수 있으나, 에서 약용으로 이용한 사례와 동일한 3령 유충이 대량으로 확보하기에 가장 용이하고 독성이 없으므로 식품원료로서 사용하기에 가장 적절할 것으로 판단되었다.
- 단, 밀집사육에 따른 환경적 스트레스로 인해 발생될 수 있는 동종포식증(cannibalism)을 조사한 결과, 동종포식증은 거의 발생되지 않았다(그림 생략). 배변 유도 결과, 3일째부터 유충의 배설된 분변의 양과 중장에 잔존한 내용물이 눈에 띄게 감소되었고 3일부터 5일까지 유도한 결과는 서로 유사하였으며, 유충 장 내용물의 잔여도는 배변 유도 기간에 대한 의존성이 매우 높은 것으로 확인되었다(Fig. 3A, B). 뿐만 아니라, 유충의 무게와 전체길이가 배변 유도 기간과 배변 양에 따라서 점차적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig.
- 또한 관능평가를 통해 3일간의 배변된 유충의 장 내용물의 잔여물이 감소함으로써 유충이 가지는 고유한 이취와 색깔이 눈에 띄게 개선되는 효과를 확인할 수 있었다. 배변 유도된 유충을 115°C, 0.9 kgf/cm3의 고온고압멸균을 5분간 실시한 후 동결건조 한 분말에서 세균 및 진균을 포함하는 미생물이 완전히 제거됨으로서 식품원료로서의 안전성을 확보할 수 있었다.
- 3A, B). 뿐만 아니라, 유충의 무게와 전체길이가 배변 유도 기간과 배변 양에 따라서 점차적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3C, D). 이러한 결과를 토대로 절식으로 인한 스트레스 현상, 장 내용물의 잔여도, 유충의 형태학적 변화 등을 고려하였을 때, 3일간의 절식이 가장 적합한 것으로 판단되었으며 이취감소는 관능평가를 통해 확인하였다.
- 그 결과 볏짚을 먹인 유충 분말을 멸균수(DW)에 녹인 현탁액에서 대조군에 비해 약간의 세포증식 억제되는 경향이 확인되었으나, 참나무톱밥과 목초를 먹인 흰점박이꽃무지 분말에서는 세포독성이 없었다. 세포 성장에 미치는 영향과 농가에 수급의 원활함을 고려했을 때, 세포에 대한 독성이 없고 사육 농가 중 가장 많이 이용하고 있는 발효 참나무 톱밥을 흰점박이꽃무지의 표준사료로서 선정하는 것이 적합할 것으로 판단되었다(Fig. 1).
- 본 연구에서는 흰점박이꽃무지를 식품원료화 하기 위한 전처리 조건을 설정하기 위해 세포독성, 이취감소 및 살균조건을 확립하였다. 유충에 살균 후 공급되는 세 가지 사료(참나무톱밥, 볏짚, 목초) 중에서 참나무톱밥을 공급하여 사육한 유충의 분말이 세포독성이 없었고, 유충의 발육단계를 크게 3령 유충, 용화직전 번데기, 번데기로 구분지은 후 각각의 분말이 가지는 세포독성 유무를 확인한 결과에서 세포독성은 나타나지 않았다. 세포독성 검사 결과를 토대로 식품원료 화하기 위한 유충의 표준사료는 세포독성이 전혀 나타나지 않고 전국 사육농가 중 가장 많이 이용하고 있는 발효 참나무 톱밥을 표준사료로 선정하였다.
- 4A, B). 이러한 결과를 토대로 절식 후 3일간 배변이 유도된 유충분말이 소비자의 기호도를 고려한 식품원료로 가장 적합할 것으로 판단된다.
- 3C, D). 이러한 결과를 토대로 절식으로 인한 스트레스 현상, 장 내용물의 잔여도, 유충의 형태학적 변화 등을 고려하였을 때, 3일간의 절식이 가장 적합한 것으로 판단되었으며 이취감소는 관능평가를 통해 확인하였다.
- 전체 사육실 온도 25°C, 습도 70%를 일정하게 유지하였다.
- 흰점박이꽃무지 3령 유충에 증기로 5분간 살균처리 된 발효 참나무톱밥을 3일 동안 급여하고, 사료를 제거한 후 3일 동안 절식 및 배변을 유도한 유충의 동결건조 분말에서 진균과 세균이 각 1.60×105 cfu/g, 3.95×105 cfu/g으로 검출되었다.
- 흰점박이꽃무지를 식품원료로 이용하기 위한 전처리 과정에서 미생물 혼입 및 오염으로 인한 유통기한과 안전성에 대한 문제를 해결하기 위해 실시한 유충의 멸균 처리 결과 115°C에서 0.9 kgf/cm3의 압력으로 5분간 처리하는 것이 가장 효율적인 조건으로 판단되었다(Table 1).
- 세포독성 검사 결과를 토대로 식품원료 화하기 위한 유충의 표준사료는 세포독성이 전혀 나타나지 않고 전국 사육농가 중 가장 많이 이용하고 있는 발효 참나무 톱밥을 표준사료로 선정하였다. 흰점박이꽃무지의 분말 전처리 조건으로 증기로 5분 동안 살균처리를 통해 사료 내의 미생물을 제거한 참나무톱밥을 급여하고 3일간 절식상태로 배변유도 후, 중장에 존재하는 내용물의 잔여도가 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한 관능평가를 통해 3일간의 배변된 유충의 장 내용물의 잔여물이 감소함으로써 유충이 가지는 고유한 이취와 색깔이 눈에 띄게 개선되는 효과를 확인할 수 있었다.
후속연구
- 국내에서 식품의약품안전청(Korea Food & Drug Administration, KFDA)의 식품공전에 등록되어 식품으로 판매 및 이용이 가능한 곤충은 누에(Bombyx mori)와 벼메뚜기(Oxya Chinensis sinuosa)뿐이며, 흰점박이꽃무지의 경우 <동의보감>에서 간질환에 대한 효능이 인정되어 있고 생약 DB에 등록되어 있으며 약용으로의 사용 및 식품으로서의 영양적 가치가 풍부하지만 흰점박이꽃무지를 제조한 식품 섭취에 대해서는 법적으로 규제되어 있다. 따라서 식품원료로써 이를 활용하기 위해서 식약청의 허가를 받을 수 있도록 2010년부터 식약청에서 시행하고 있는 새로운 식품원료의 안전성 평가 가이드라인의 기준에 부합되는 과학적이고 체계적인 연구결과가 필요하며(17), 우선적으로 식품원료화를 위한 전처리 조건을 확립하여 안전성을 검증할 필요가 있다. 따라서 본 연구를 통해서 식품원료화를 위한 흰점박이꽃무지의 분말 제조의 최적 조건을 확립하기 위하여 사육단계부터 유충 장 내용물로 인한 특유의 이취 및 오염원(세균 및 진균류) 등의 문제들을 해결할 수 있도록 전처리 조건 확립을 위한 연구를 수행하였다.
- 본 연구 결과를 통해 흰점박이꽃무지의 식품원료화에 적합한 유충의 표준사료와 발육단계를 선정하고, 특유의 이취를 감소시키는 전처리 조건을 확립함으로써 식품화에 적용이 가능할 것으로 판단되며, 세균 및 진균 등의 미생물이 거의 존재하지 않는 안전한 식품원료로 생산할 수 있는 조건이 될 수 있을 것으로 기대된다.
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