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문제 정의
- 이 연구에서는 HPLC post-column oxidation method(이하, PCOX 법) 관련 선행연구를 검토하여 우리나라 마비성 패류독소 발생특성을 반영한 분석조건을 수립하였으며, 시험소 내 유효성 검증을 실시하여 모니터링을 목적으로 한 분석환경에서 활용 가능성을 평가하였다.
제안 방법
- 앞서 기술한 바와 같은 절차에 따라 평가시료를 대상으로 추출과 분석을 실시하였다. 3일간 5회 반복 분석을 실시하여 각 매트릭스 별로 총 15회의 측정으로 반복성을 평가하였다. 재현성 평가도 반복성 평가에 사용된 동일 평가시료를 사용하여 실시되었다.
- HPLC 분석을 위해 추출액 500 µL에 25 µL 30%(w/v) TCA를 가하고 혼합한 후 원심분리(16,000×g, 5분)하여 단백질을 제거하고, 30 µL 1 M NaOH를 가하고 vortex mixer로 혼합하여 TCA를 중화한 후 다시 원심 분리(16,000×g, 5분) 하였다.
- Stock solutions 조제를 위하여 GTXs/STXs 그룹 독소는 0.003 M HCl로, C toxins은 DIW (pH 5.0)를 사용하여 희석한 후 농도를 계산하였다(Table 1). 그리고 나서 Working solutions 혼합액은 첫 번째 그룹은 C1 및 C2로 구성하였고, 두 번째 그룹은 dcGTX2, dcGTX3, dcSTX, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5, NEO 및 STX로 구성하여 두 그룹으로 구분지었다.
- 각 독소의 retention time에서 S/N비는 working standard의 noise response (height unit)에 3을 곱하여 독소의 µM로 변환하여 구하였다.
- 검출한계(LOD; limit of detection)와 정량한계(LOQ; limit of quantification)의 측정을 위해 각 매트릭스 별로 5개의 반복구를 사용하여 분석을 실시하였다. 각 독소의 retention time에서 S/N비는 working standard의 noise response (height unit)에 3을 곱하여 독소의 µM로 변환하여 구하였다.
- Reference method와의 비교 역시 상기한 IUPAC guideline에서 권고되고 있는 사항이다. 그래서 이 시험법에서 얻어진 분석결과와 동물시험법의 비교시험을 진행하였다.
- 0)를 사용하여 희석한 후 농도를 계산하였다(Table 1). 그리고 나서 Working solutions 혼합액은 첫 번째 그룹은 C1 및 C2로 구성하였고, 두 번째 그룹은 dcGTX2, dcGTX3, dcSTX, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5, NEO 및 STX로 구성하여 두 그룹으로 구분지었다. 독소성분 별 stock solution에 GTXs/STXs 그룹에는 0.
- 그리고 나서 Working solutions 혼합액은 첫 번째 그룹은 C1 및 C2로 구성하였고, 두 번째 그룹은 dcGTX2, dcGTX3, dcSTX, GTX1, GTX2, GTX3, GTX4, GTX5, NEO 및 STX로 구성하여 두 그룹으로 구분지었다. 독소성분 별 stock solution에 GTXs/STXs 그룹에는 0.003 M HCl를 가하고, C toxin에는 DIW (pH 5.0)를 가하여 5.0 mL로 정용한 후 용량 플라스크 최종무게를 측정하여 용액의 부피를 계산하고 Stock solution의 농도와 희석비율을 고려하여 최종농도를 계산하였다. 회수율 등의 실험방법의 유효성을 알아보기 위한 Matrix fortified working standards (Spiked samples)은 무독소 패류의 탈단백 처리 추출액을 희석액으로 사용하여 상기 표준용액 조제법에 따라 조제하였다.
- 동물시험법과 동일한 시료 전처리법을 이용하고 HPLC의 높은 감도와 선택성을 극대화하여 독소성분의 그룹분석이 가능한 PCOX법을 우리나라 패류시료의 매트릭스 특성에 맞도록 최적화하였다. 이 분석법은 GTXs/STXs와 C toxins의 그룹별 동시 분석과 독소성분의 분리와 정량이 가능하였다.
- 재현성 평가도 반복성 평가에 사용된 동일 평가시료를 사용하여 실시되었다. 두 명의 시험원이 각각 3일간 매트릭스와 농도 별로 5회 반복 분석을 실시하여 매트릭스와 시험원 별로 총 15회의 측정이 이루어졌다. 결과는 Table 5 및 Table 6과 같다.
- Post-column reaction system은 post-column derivatizer (Pickering Laboratories, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 반응온도를 85℃로 유지하였다. 또한, 분석용 column은 제안 시험법의 column에 대한 둔감도 평가를 위해 시판 column 중 마비성 패류독소 분석에 적용 가능한 제품을 구매하여 Table 2와 같이 독소 성분 별로 적용하여 분석을 실시하였다.
- 물질의 분리를 위한 이동상은 GTXs/STXs 그룹을 분석하기 위한 이동상과 C toxins 을 분리하기 위한 이동상을 따로 조제하였다. GTXs/STXs 그룹을 위한 이동상에서 용액 A는 11 mM heptane sulphonate (Fluka, Buchs, Germany) 및 5.
- 이 연구에서 검토된 PCOX 법과 동물시험법의 동등성을 확인하여 대체 시험법으로 활용 가능성을 확인하기 위해 두 시험법간 비교시험을 진행하였다. 비교 시험에는 현장시료를 사용하였으나 특정 독소함량의 시료를 현장에서 구할 수 없는 경우에는 spiked sample를 조제하여 사용하였다. 그래서 현장시료와 spiked sample으로 조합된 굴 시료 100점과 진주담치 시료 100점으로 전체 시험구를 구성하였다.
- 시료 추출물 또한 GTXs/STXs 분석에는 10 µL를 그리고 C toxins 분석에는 5 µL를 주입하고 가장 최근 실시한 표준품 분석에서 얻은 retention time과 비교하여 peak를 판별하고 구분하였다.
- 시스템 안정화 여부는 희석된 working solution을 GTXs/STXs 그룹 10 µL, C toxins 5 µL로 주입하고, gradient condition에서 성분의 분리를 확인하였다.
- 이 연구에서 검토된 PCOX 법과 동물시험법의 동등성을 확인하여 대체 시험법으로 활용 가능성을 확인하기 위해 두 시험법간 비교시험을 진행하였다. 비교 시험에는 현장시료를 사용하였으나 특정 독소함량의 시료를 현장에서 구할 수 없는 경우에는 spiked sample를 조제하여 사용하였다.
- 시료 추출물 또한 GTXs/STXs 분석에는 10 µL를 그리고 C toxins 분석에는 5 µL를 주입하고 가장 최근 실시한 표준품 분석에서 얻은 retention time과 비교하여 peak를 판별하고 구분하였다. 정량 및 독소의 계산은 single point calibration을 사용하여 peak 면적을 측정하였으며 Table 4에 제시된 독소 성분 별 saxitoxin 상대 독성을 고려하여 개별 독소성분의 기여도를 합하여 시료 중 총 독소농도를 계산하고 mg STX eq/kg으로 표시하였다.
- 제안 시험법의 column에 대한 둔감도(ruggedness) 평가를 위해 시판 C18 column (column No. 1-4, GTXs/STXs 분석용) 4종과 C8 column (column No. 5-7, C toxins 분석용) 3종을 구입하여 독소성분별로 적용하여 column별로 3회 반복분석을 실시하였다. 표준독소 농도는 1.
- 회수율 시험은 각 매트릭스 중 3가지 농도에 대하여 5회 반복측정을 실시하였다. 제조된 평가시료에 대하여 전술한 방법에 따라 분석을 실시하고, 각 독소성분 별로 회수율을 계산하였다. 그 결과는 Table 7과 같다.
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직선성
직선성(linearity) 확인을 위해 working solution을 검출한계에서 stock solution의 1/2 농도까지 단계희석한 후 분석을 실시하였다. 그 결과 Table 9에 나타낸 바와 같이 전 범위에서 직선성이 확보되었으며 이때 상관계수는 모두 0.
- 진주담치와 굴에서 회수율을 평가하기 위해 독소 성분별로 각각 0.1 µg/g의 농도가 되도록 각 매트릭스에 첨가하여 평가시료를 조제하였다.
- 1 µg/g의 농도가 되도록 각 매트릭스에 첨가하여 평가시료를 조제하였다. 회수율 시험은 각 매트릭스 중 3가지 농도에 대하여 5회 반복측정을 실시하였다. 제조된 평가시료에 대하여 전술한 방법에 따라 분석을 실시하고, 각 독소성분 별로 회수율을 계산하였다.
대상 데이터
- 2010년 3월부터 6월까지 통영시 및 거제시 연안 해역에서 양식산 굴(Crassostrea gigas)과 진주담치(Mytilus galloprovincialis)를 직접 채취하여 시험재료로 사용하였다.
- 물질의 분리를 위한 이동상은 GTXs/STXs 그룹을 분석하기 위한 이동상과 C toxins 을 분리하기 위한 이동상을 따로 조제하였다. GTXs/STXs 그룹을 위한 이동상에서 용액 A는 11 mM heptane sulphonate (Fluka, Buchs, Germany) 및 5.5 mM phosphoric acid 수용액, 용액 B는 11 mM heptane sulphonate 및 16.5 mM 11.5% phosphoric acid가 함유된 acetonitrile (Merck, Darmstadt, Germany) 용액을 사용하였다. 이동상의 pH는 Ammonium hydroxide (Sigma)를 사용하여 7.
- 비교 시험에는 현장시료를 사용하였으나 특정 독소함량의 시료를 현장에서 구할 수 없는 경우에는 spiked sample를 조제하여 사용하였다. 그래서 현장시료와 spiked sample으로 조합된 굴 시료 100점과 진주담치 시료 100점으로 전체 시험구를 구성하였다. 총 200점의 시료를 두 방법으로 각각 분석하여 도출된 결과를 검토한 결과, 굴의 경우 두 시험법의 상관계수(r2)는 0.
- 독소의 분리를 위한 HPLC와 fluorescence detector는 Finnigan Surveyor Plus와 Finnigan Surveyor FL Plus Detector (Thermo Electron, San Jose, CA, USA)를 각각 사용하였고, detector의 excitation wavelength는 330 nm, emission wavelength는 390 nm로 설정하였다. Post-column reaction system은 post-column derivatizer (Pickering Laboratories, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 반응온도를 85℃로 유지하였다.
- 반복성과 재현성을 평가하기 위해 blank 패육(진주담치 및 굴)과 표준독소를 첨가한 평가시료를 사용하였다. 앞서 기술한 바와 같은 절차에 따라 평가시료를 대상으로 추출과 분석을 실시하였다.
- 분석에 사용된 deionized water (DW)는 18 Ω resistance 또는 동등 순도를 가진 것을 사용하였으며, 모든 용매와 시약은 HPLC급을 사용하였다. 또한, 조제된 이동상과 post-column 시약은 0.
- 분석에 사용된 표준독소(CRM; certified reference material)는 C1 (N-sulfocarbamoylgonyautoxin-C1), C2 (N-sulfocarbamoylgonyautoxin-C2), dcGTX2 (decarbamoylgonyautoxin-2), dcGTX3 (decarbamoylgonyautoxin-3), dcSTX (decarbamoyl saxitoxin), GTX1 (gonyautoxin-1), GTX2 (gonyautoxin-2), GTX3 (gonyautoxin-3), GTX4 (gonyautoxin-4), GTX5 (gonyautoxin-5), NEO (neosaxitoxin) 및 STX를 National Research Council Institute for Marine Biosciences (Halifax, NS, Canada)에서 구입하여 사용하였다(Table 1).
- 3일간 5회 반복 분석을 실시하여 각 매트릭스 별로 총 15회의 측정으로 반복성을 평가하였다. 재현성 평가도 반복성 평가에 사용된 동일 평가시료를 사용하여 실시되었다. 두 명의 시험원이 각각 3일간 매트릭스와 농도 별로 5회 반복 분석을 실시하여 매트릭스와 시험원 별로 총 15회의 측정이 이루어졌다.
데이터처리
- 분석 시스템의 구성은 아래와 같으며 ChromQuest 4.2.34 ver. 3.16 (Thermo Electron, San Jose, CA, USA)을 사용하여 분석을 실시하고 데이터를 처리하였다.
- 시험소 내에서 시험원 간 재현성을 확인하기 위해 두 시험원이 동일한 평가시료에 대하여 독립적으로 분석을 실시한 결과를 취합하여 진주담치 매트릭스에서 시험 농도별로 Horwitz ratio(HorRat)를 구하였다. 그 결과는 Table 6에 나타내었다.
이론/모형
- AOAC Method 959.08(2)에 따라 1 mL HCl 추출액을 체중 17-23 g의 마우스 복강에 주사하였다. 그리고 시료 중에 존재하는 마비성 패류독소량은 Sommer Table을 이용하여 계산하였다.
- 08(2)에 따라 1 mL HCl 추출액을 체중 17-23 g의 마우스 복강에 주사하였다. 그리고 시료 중에 존재하는 마비성 패류독소량은 Sommer Table을 이용하여 계산하였다.
- 동물시험법을 위한 독소추출은 균질액 100 g을 대상으로 AOAC official Method 959.08(2)에 따라 실시하였다. HPLC 분석을 위해 추출액 500 µL에 25 µL 30%(w/v) TCA를 가하고 혼합한 후 원심분리(16,000×g, 5분)하여 단백질을 제거하고, 30 µL 1 M NaOH를 가하고 vortex mixer로 혼합하여 TCA를 중화한 후 다시 원심 분리(16,000×g, 5분) 하였다.
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정확도
정확도(Accuracy) 평가는 IUPAC Harmonized Guidelines for Single-laboratory Validation of Analytical Methods(18)의 Section A4.3.4를 근거로 반복성(repeatability)과 재현성(Intermediate Precision) 조사를 통하여 실시하였다. Reference method와의 비교 역시 상기한 IUPAC guideline에서 권고되고 있는 사항이다.
- 0 mL로 정용한 후 용량 플라스크 최종무게를 측정하여 용액의 부피를 계산하고 Stock solution의 농도와 희석비율을 고려하여 최종농도를 계산하였다. 회수율 등의 실험방법의 유효성을 알아보기 위한 Matrix fortified working standards (Spiked samples)은 무독소 패류의 탈단백 처리 추출액을 희석액으로 사용하여 상기 표준용액 조제법에 따라 조제하였다.
성능/효과
- 또한 AOAC guidelines에 근거한 시험소 내 시험법 유효성 검증결과 모든 항목에서 적합한 결과가 도출되었다. 동물시험법과의 동등성 비교에서는 굴과 진주담치 매트릭스에 대한 두 시험법은 상관계수가 각각 0.9534와 0.9109로 매우 좋은 상관관계를 나타내었다.
- 동물시험법에 비하여 PCOX 법은 단백질 제거, 크로마토그래피 현상을 이용한 독소성분의 분리, 독소성분 산화를 통한 형광성 퓨린의 형성과 특이적 파장을 이용한 형광검출과 같은 단계를 가지고 있어 특이성이 더 높았다. PCOX 법은 이러한 시험 원리에 기인한 특이성과 더불어 동물시험법에서 방해물질로 작용하는 carbamate와 같은 신경독소와 유기인계 살충제에 영향을 받지 않는 점과 blank 시료에 대한 false positive 결과를 배제할 수 있는 점에서 기인한 특이성을 동시에 가지고 있다.
- 6배 이상의 향상된 분석능력을 가진 것으로 확인되었다. 또한 AOAC guidelines에 근거한 시험소 내 시험법 유효성 검증결과 모든 항목에서 적합한 결과가 도출되었다. 동물시험법과의 동등성 비교에서는 굴과 진주담치 매트릭스에 대한 두 시험법은 상관계수가 각각 0.
- 반복 시험에서 나타난 상대표준편차는 모두 7% 이하로 AOAC international 기준에 부합되어 모든 매트릭스에서 모든 독소의 반복성은 상대적으로 일정한 것을 알 수 있었다.
- 분석결과 표준 column으로 사용한 Zorbax Bonus-RP (Column No. 2)와 비교하여 hydrophobicity는 유사하나 polar surface activity가 높고 surface area가 2배 이상(475 m2/g)되는 column No. 1의 경우에는 retention time이 길어지고 분리능이 낮게 나타났으며 shape selectivity가 높은 column No. 3의 경우에는 분석피크가 관찰되지 않았다. 또한 pore diameter가 다른 3종의 column보다 약 4배(320 Å)정도 큰 column No.
- 동물시험법과 동일한 시료 전처리법을 이용하고 HPLC의 높은 감도와 선택성을 극대화하여 독소성분의 그룹분석이 가능한 PCOX법을 우리나라 패류시료의 매트릭스 특성에 맞도록 최적화하였다. 이 분석법은 GTXs/STXs와 C toxins의 그룹별 동시 분석과 독소성분의 분리와 정량이 가능하였다. 회수율은 83.
- 그래서 현장시료와 spiked sample으로 조합된 굴 시료 100점과 진주담치 시료 100점으로 전체 시험구를 구성하였다. 총 200점의 시료를 두 방법으로 각각 분석하여 도출된 결과를 검토한 결과, 굴의 경우 두 시험법의 상관계수(r2)는 0.9534로 나타났으며, 진주담치의 경우에는 0.9109로 나타나 매우 좋은 상관관계를 얻을 수 있었다(Fig. 3).
- 총 독소에 대한 정량한계는 최고 8.6µg/100 g 수준으로 동물시험법에 비하여 약 4.6배 이상의 향상된 분석능력을 가진 것으로 확인되었다.
- 한편 분석에 사용된 column (C18 및 C8)의 특성차에 의한 시험 결과의 영향 정도를 파악하기 위해 시판 column 7종에 대하여 평가를 실시한 결과, 동일 계열의 column을 사용하더라도 column의 물리화학적 특성과 수지와 반응기의 결합특성과 수지 봉쇄특성에 따라 분리도와 분석시간에 영향을 받는 것으로 나타나 column 적용 가능범위는 다소 좁은 것으로 확인되었다.
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