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문제 정의
- 본 연구에서는 우리밀의 활용성을 증대시킬 일환으로 경남 지역에서 재배한 우리밀(금강밀)을 이용한 식초 발효를 시도하였으며 이를 위해 우리밀 식초 발효용 초산균 분리 및 동정, 우리밀을 이용한 엿기름 제조와 우리밀 식초 발효 조건 등을 검토하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- 핵산 염기서열은 PRISM Ready Reaction Dye terminator/primer cycle sequencing kit를 사용한 dideoxy chain termination method를 이용하여 분석하였다. 16S rDNA 염기서열은 BLAST network service와 nonredundant DNA sequence database를 제공하는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균종의 16S rDNA와 비교 분석하였다. 16S rDNA 유사성 값은 DNAMAN analysis system(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 사용하여 alignments, evolutionary distance로부터 계산하였다.
- 16S rDNA 염기서열은 BLAST network service와 nonredundant DNA sequence database를 제공하는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균종의 16S rDNA와 비교 분석하였다. 16S rDNA 유사성 값은 DNAMAN analysis system(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 사용하여 alignments, evolutionary distance로부터 계산하였다. Phylogenetic tree는 neighbour-joining method와 distance matrix data를 사용하여 확인하였다.
- A8 균주를 GYE(3% glucose, 0.5% yeast extract, 4% ethanol) 액체배지에서 48시간 배양한 후 Intron Genomic DNA Purification Kit(Intron Biotechnology Co., Suwon, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 16S rDNA(1.5 kb)를 증폭 하였다. 증폭은 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 30초간 풀림, 72℃ 에서 1분 30초 신장으로 30 cycle로 수행하였다.
- 경남지역의 가정에서 재래식 방법으로 제조한 식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30℃에서 배양한 후 다양한 초산균을 순수분리 하였다. 선발된 초산균은 우리밀을 기질로 사용 하여 제조한 알코올 발효액(알코올 농도 약 6%)에 접종하여 초산 생성능을 검토하였고 이로부터 우리밀 식초 발효를 위한 초산균으로 초산 생성능과 풍미가 우수한 균주 A8을 최종 선정하였다.
- 당 분석 column(Polyamine II, 4.6×150 mm, µm, YMC Co., Kyoto, Japan)에 시험용액 20 µL을 주입하고 35℃에서 이동상 용매(acetonitrile : water = 70 : 30(v/v))를 1.0 mL/min 속도로 이동시키면서 refractive index(RI, Agilent 1200 series) 검출기 상에서 당을 검출하였다.
- 당 분석은 HPLC(Agilent 1200 series, Agilent Co., Forest Hill, Vic, Australia)를 이용하여 분석하였다. 시료 5 g에 물 25 mL를 가하여 녹인 후 acetonitrile로 50 mL까지 채웠다.
- )에 기술된 대로 plasmid를 분리 정제하였다. 분리된 plasmid를 주형가닥으로 사용하여 DNA 염기서열을 결정하였다. 핵산 염기서열은 PRISM Ready Reaction Dye terminator/primer cycle sequencing kit를 사용한 dideoxy chain termination method를 이용하여 분석하였다.
- 경남지역의 가정에서 재래식 방법으로 제조한 식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30℃에서 배양한 후 다양한 초산균을 순수분리 하였다. 선발된 초산균은 우리밀을 기질로 사용 하여 제조한 알코올 발효액(알코올 농도 약 6%)에 접종하여 초산 생성능을 검토하였고 이로부터 우리밀 식초 발효를 위한 초산균으로 초산 생성능과 풍미가 우수한 균주 A8을 최종 선정하였다.
- 순수 분리된 형질전환체를 50 µg/mL의 ampicillin이 함유된 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 16시간 배양한 후 균체를 수확하고 Plasmid Purification Kit(Intron Biotechnology Co.)에 기술된 대로 plasmid를 분리 정제하였다.
- 알코올 분석은 여과한 시료 100 mL에 동량의 증류수를 가한 후 증류한 다음 주정계를 이용하여 측정하였으며 Gay Luccac Table을 이용하여 15℃로 보정하였고 알코올 함량은 백분율로 표 시하였다. 각 실험은 3회 반복 수행하여 평균값으로 나타내었다.
- 우리밀 당화-알코올 발효액의 알코올 농도를 각각 5.0%(v/v), 7.5%(v/v), 및 10.0%(v/v)로 조정한 후 A. pasteurianus A8을 5.0%(v/v) 접종하여 30℃에서 각각 24일 정치배양하면서 초산 생 산량을 측정한 결과 Fig. 1C와 같다. 알코올 농도 5.
- 우리밀 당화효소 제조를 위해 먼저 우리밀을 이용하여 엿기름 제조를 시도하였다. 우리밀 엿기름의 제조를 위해 발아 온도를 15-30℃로 조정하여 발아 온도 조건에 따른 amylase 활성은 Fig.
- 정선 수세한 우리밀을 50℃ 열풍건조기에서 수분함량 15% 이하가 되도록 건조시킨 후 분쇄하고 80 mesh 채로 걸러 우리밀 통밀가루를 제조하였다. 정제수 5 L에 통밀가루 1.
- 증폭된 16S rDNA PCR 산물은 1% agarose에 전기영동하고 1.5 kb 단편을 회수 정제하고 pGEM-T Easy(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 클로닝하여 Escherichia coli DH5α에 형질 전환 후 형질전환체를 무작위로 선정하여 순수 분리하였다.
- 초산 분석 column(Rezex 8u 8% H. Org Acid, 7.8×300 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)에 전처리한 시료 20 µL을 주입하고 30℃에서 이동상 용매(0.1% phosphoric acid)를 1.0 mL/min 속도로 이동 시키면서 UV 검출기(Agilent 1200 series, Agilent Co.) 210 nm에서 초산을 검출하였다.
- ) 210 nm에서 초산을 검출하였다. 표준품 초산(0, 25, 50, 75, 및 100 mg/g) 으로 상기와 동일한 조건으로 분석하여 검량곡선을 구하고 이와 비교하여 시료의 초산 함량을 백분율로 표시하였다. 각 실험은 3 회 반복 수행하여 평균값으로 나타내었다.
- 효모 배양 배지는 우리밀 통분말 30% 현탁액에 엿기름 분말 5% 첨가하여 60℃에서 5시간 당화 후 얻은 상등액에 0.2% yeast extract, 0.01% MgSO4 · 7H2O, 0.01% K2HPO4 첨가한 것(우리밀 30% 당화액 배지)을 사용하였고 초산균 배양은 효모 배양용 배지에 에탄올 2%를 첨가한 것을 사용하였다.
대상 데이터
- 16S rDNA 단편 증폭을 위한 PCR primer는 5'-CGGAGATTTGATCCTGG-3'(forward)과 5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'(reverse)을 사용하였다(10).
- 본 연구에서 선발된 A. pasteurianus A8는 발효 온도 30-35℃, 초산균 접종량 5.0%(v/v) 이상 및 초기 알코올 농도 5.0-7.5%(v/v) 에서 4.5-5.8%의 초산이 생산되었다. 식품위생법에서 양조 식초의 규격을 초산 함량이 4% 이상으로 규정하고 있으므로 A.
- 알코올 발효를 위한 효모는 GYPA(2% glucose, 0.5% yeast extract, 0.5% peptone, 1.5% agar) 배지에서 보관 중인 Saccharomyces cerevisiae KCCM 11215를 사용하였다. 알코올 발효를 위한 효모 배양은 우리밀 30% 당화액 50 mL이 들어 있는 250 mL Erlenmyer flask에 접종하고 25℃ 진탕배양기(IS-971RF model, Jeiotech Co.
- 우리밀은 2010년 6월에 경남 고성군에서 수확된 우리밀(품종명: 금강밀)을 구입하여 실험에 사용하였고 식품공전법에 따라 수분, 탄수화물, 조단백질, 조지방 및 회분을 분석하였다. 초산균 분 리와 보존용 배지는 GYCEA(3% glucose, 0.
- 우리밀은 2010년 6월에 경남 고성군에서 수확된 우리밀(품종명: 금강밀)을 구입하여 실험에 사용하였고 식품공전법에 따라 수분, 탄수화물, 조단백질, 조지방 및 회분을 분석하였다. 초산균 분 리와 보존용 배지는 GYCEA(3% glucose, 0.5% yeast extract, 1% CaCO2, 4% ethanol, 1.5% agar)로 구성된 배지를 사용하였다. 효모 배양 배지는 우리밀 통분말 30% 현탁액에 엿기름 분말 5% 첨가하여 60℃에서 5시간 당화 후 얻은 상등액에 0.
이론/모형
- 16S rDNA 유사성 값은 DNAMAN analysis system(Lynnon Biosoft, Quebec, Canada)를 사용하여 alignments, evolutionary distance로부터 계산하였다. Phylogenetic tree는 neighbour-joining method와 distance matrix data를 사용하여 확인하였다.
- 초산 분석은 Cho 등(10)의 방법에 준하여 HPLC(Agilent 1200 series, Agilent Co.)를 이용하여 분석하였다. 즉, 발효액을 원심분리한 후 상등액을 0.
- 분리된 plasmid를 주형가닥으로 사용하여 DNA 염기서열을 결정하였다. 핵산 염기서열은 PRISM Ready Reaction Dye terminator/primer cycle sequencing kit를 사용한 dideoxy chain termination method를 이용하여 분석하였다. 16S rDNA 염기서열은 BLAST network service와 nonredundant DNA sequence database를 제공하는 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 얻은 다른 균종의 16S rDNA와 비교 분석하였다.
성능/효과
- 15℃에서 6일간 발아시켜 제조한 엿기름 250 g을 우리밀 현탁액(우리밀 통밀가루 1.5 kg을 5 L 정제수에 현탁)에 가하여 60℃ 에서 5시간 당화시킨 우리밀 당화액의 유리당을 분석한 결과 glucose 16.9 g/L, maltose 123.1 g/L 및 maltotriose 20.8 g/L를 함유하고 있었다. 일반적으로 엿기름의 제조방법(발아 조건, 건조 방법 등)에 따라 amylase 활성과 이에 따른 당화력의 차이가 발생을 한다.
- 1과 같다. A8 균주는 Acetobacter pasteurianus NCRC 105185(AB682238)와 염기서열이 99.7% 일치하여 유연관계가 가장 가까움을 확인할 수 있었다. 따라서 선발된 A8 균주는 A.
- 2와 같다. Amylase 활성은 발아 일수 경과에 따라 증가하였으며, 발아 경과 6일 이후에는 발아 온도가 높을수록 더욱 감소하는 경향을 보였다. 15℃에 발아한 경우 발아 1일째에는 46.
- 88% 초산이 생성되었다. 균 접종량과 초산의 생성량을 고려할 때 5.0%(v/v) 이상이 적당한 것으로 판단되었다.
- 1B와 같다. 균 접종량이 증가할수록 초산 생성량은 증 가하여 발효 24시간째 균 접종량이 1%(v/v)인 경우 3.58%의 초산이 생산되었으나, 2.5%(v/v) 접종량에서는 4.41%, 5.0%(v/v)에 서는 4.61% 및 10.0%(v/v)에서는 4.88% 초산이 생성되었다. 균 접종량과 초산의 생성량을 고려할 때 5.
- 7% 일치하여 유연관계가 가장 가까움을 확인할 수 있었다. 따라서 선발된 A8 균주는 A. pasterurians 또는 그 근연종으로 판단되어 A. pasteurianus A8로 동정하였다.
- 본 연구에 사용한 금강밀의 일반성분은 수분 9.93%, 조단백질 13.79%, 조지방 1.47%, 회분 1.28% 및 탄수화물 73.08%로 분석되었다.
- 8%의 초산이 생산되었다. 식품위생법에서 양조 식초의 규격을 초산 함량이 4% 이상으로 규정하고 있으므로 A. pasteurianus A8을 이용한 우리밀 식초 생산이 가능한 것으로 판단되었다. 우리밀 식초를 상업적으로 생산하기 위해서는 우리밀 식초의 관능적 특성과 물리·화학적 특성, 저장 안정성, 및 생리 활성과 관련된 기능적 특성에 관한 연구가 더 필요할 것으로 판단되었다.
- 알코올 농도 5.0%에서 초산 생산량이 5.78%로 가장 높았으며, 알코올 농도 7.5%(v/v)에서는 초산 생산 속도가 지연되어 4.4%가 생산되었으며, 초기 알코올 농도가 10%(v/v)인 경우에는 초산 생성이 관찰되지 않았다.
- 일반적으로 GYCEA 배지에서 초산균이 생육하면 초산이 생성되어 CaCO3를 분해하여 그 결과로 clear zone 이 형성되게 되는데 clear zone의 크기가 클수록 초산 생성력이 뛰어난 것으로 판단할 수 있다(12). 우리밀 알코올 발효액(알코올 농도 6%)에 선발된 초산균을 접종하여 30℃에서 20일 동안 정치배양한 후 산도를 측정한 결과 A8를 제외한 균주들은 4.0-4.30% 수준 이었고 A8 균주는 4.56%로 가장 높은 초산을 생성하여 우리밀 식초 발효를 위한 균주로 선정하였다. A8 균주의 16S rDNA 염기서열(1,498 bp)을 분석하여 연관이 있는 균주와 비교한 결과는 Fig.
- 한편 과실 함량이 높은 과실 식초는 일반 식초에 비하여 풍부한 유기산을 가지고 있으며 곡물함량이 높은 현미 식초와 보리 등의 잡곡 식초 등은 유기산뿐만 아니라 다양한 유리아미노산을 함유하고 있어 기능적 특성이 더 우수한 것으로 보고되고 있다(5). 우리밀은 현미보다 단백질 함량이 높으며 보리 등의 잡곡과는 유사한 함량을 지니고 있어 우리밀로 제조된 식초는 유기산과 더불어 다양한 유리아미노산을 함유하고 있을 것으로 판단되었다. 향후 우리밀 식초에 대한 유리당, 유기산, 유리아미노산 및 향기성분 등의 분석이 이루어져야 할 것으로 판단되었다.
후속연구
- 우리밀 식초를 상업적으로 생산하기 위해서는 우리밀 식초의 관능적 특성과 물리·화학적 특성, 저장 안정성, 및 생리 활성과 관련된 기능적 특성에 관한 연구가 더 필요할 것으로 판단되었다.
- 일반적으로 엿기름의 제조방법(발아 조건, 건조 방법 등)에 따라 amylase 활성과 이에 따른 당화력의 차이가 발생을 한다. 한편 우리밀 엿기름의 건조 방법과 저장 중 엿기름의 안전성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되며 이에 따른 amylase 활성과 당화력에 대한 보다 상세한 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- 우리밀은 현미보다 단백질 함량이 높으며 보리 등의 잡곡과는 유사한 함량을 지니고 있어 우리밀로 제조된 식초는 유기산과 더불어 다양한 유리아미노산을 함유하고 있을 것으로 판단되었다. 향후 우리밀 식초에 대한 유리당, 유기산, 유리아미노산 및 향기성분 등의 분석이 이루어져야 할 것으로 판단되었다.
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