[논문]재래 식초에서 초산균의 분리와 발효특성 신속 비교

백성열; 박혜영; 이충환; 여수환

doi:10.11002/kjfp.2014.21.6.903

재래 식초에서 초산균의 분리와 발효특성 신속 비교
Comparison of the fermented property and isolation of acetic-acid bacteria from traditional Korean vinegar 원문보기

한국식품저장유통학회지 = Korean journal of food preservation, v.21 no.6, 2014년, pp.903 - 907

백성열 (농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과) , 박혜영 (농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과) , 이충환 (건국대학교 생명공학과) , 여수환 (농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부 발효식품과)

초록
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식초 제조용 종초 선발을 위해 다양한 초산균을 분리한 후, 그들의 발효특성 분석하여 종초 가능성을 검토하였다. 수집된 식초 시료에서 분리된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, A. pasteurianus, A. malorum, Ga. entanii, Ga. intermedius, Ga. xylinus로 동정되었다. 식초 제조용 초산균의 발효특성을 분석한 결과, 초산의 과산화능은 모든 시험 균주에서 음성으로 나타나 과산화를 보이지 않았으며, 초산 내성은 Gluconacetobacter 속 균주만 관찰되었다. pH 내성은A. malorum V5-7 균주가 가장 높았다. 식초 품질에 해로운 영향을 주는 섬유질상의 세포외 다당체인 콜로이드 생성 균주는 Ga. intermedius V11-5, Ga. xylinus V8-1 균주로 나타났다. 초산 생성능은 A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga. intermedius V11-5에서 가장 높은 산 생성능을 나타내었다. 본 연구에서는 종초용 초산균의 발효 특성 연구를 통해 국내 발효 식초의 품질 향상을 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

For the selection of a starter for vinegar, six strains of acetic-acid bacteria were isolated from traditional Korean vinegar fermented through the static method. These strains were investigated for their acetic-acid fermentation and identification characteristics. The 16S rRNA sequences of six strains were identified as Acetobacter pasteurianus, A. malorum, Gluconacetobacter entanii, Ga. intermedius, and Ga. xylinus respectively. The overoxidation of acetic acid, acetic-acid and pH tolerances, and acetic-acid production of these strains were investigated. None seemed to have been overoxidized. The Gluconacetobacter genus showed acetic-acid tolerance. Among the acetic-acid bacteria, A. malorum V5-7 exhibited the highest pH tolerance. The Ga. intermedius V11-5 and Ga. xylinus V8-1 strains produced colloids that exopolysaccharides of fiber. The acetic-acid production by isolated acetic-acid bacteria and type strain was a achieved at a shaking culture at $30^{\circ}C$ for 5 days. A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, and Ga. intermedius V11-5 exhibited the highest acetic acid production. The study results indicate that appropriate strains of acetic-acid bacteria improved the thraditional Korean vinegar fermented through the static method.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 기존에 종초로 사용하던 A.pasteurianus 균주 외에 다른 종의 초산균을 분리하여 이들의 초산발효 특성을 신속 비교하여, 종초로써의 특성 결과를 보고하고자 한다.
식초 제조를 위해, 요구되는 초산균의 특징은 알코올을 보다 산화시킬 수 있는 능력, 빠른 초산 생성능, 초산 내성, 초산의 비과산화, 낮은 pH 내성, 박테리오파지 저항성, 세포외 다당 비생성, 불쾌한 냄새를 내지 않는 것이 필요하다 (11). 본 연구에서 국내 재래식초에서 분리된 초산균을 대상으로 웰빙형 발효식초 제조를 위한 초산균의 특성 일부를 규명하였다. 하지만 제조 현장에 적용하기 위해서는 현장 기술과 환경에 적합한 맞춤형 종초 제조 기술에 대한 연구가 필요하다.
intermedius V11-5에서 가장 높은 산 생성능을 나타내었다. 본 연구에서는 종초용 초산균의 발효 특성 연구를 통해 국내 발효 식초의 품질 향상을 기대한다.

제안 방법

프라이머는 Universal PCR primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다. PCR 산물의 염기서열은 ㈜제노셀에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다(12). Phylogenetic tree 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software (Seqman Pro, Ver 8.
PCR 산물의 염기서열은 ㈜제노셀에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다(12). Phylogenetic tree 작성은 Lasergene사의 DNASTAR pro software (Seqman Pro, Ver 8.1.5)와 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank에 보고 된 유사 균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA V4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model과 neighbor-joining method에 의해 계통도를 작성하였다(14,15
본 연구에서는 한국미생물자원센터(KCTC) 및 한국농업 미생물자원센터(KACC)에서 분양받은 초산균을 대조구로, 국립농업과학원 발효식품과에서 분리한 균주를 공시균으로 사용하였다. 분리균은 전국의 4개 지역(경기 성남, 경북 청도, 전북 무주, 충남 서천)에서 복분자 식초 및 감식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30℃에서 배양한 후, 초산균을 순수분리 하였다(12). 분리균의 동정은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 하였다.
분리균은 전국의 4개 지역(경기 성남, 경북 청도, 전북 무주, 충남 서천)에서 복분자 식초 및 감식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30℃에서 배양한 후, 초산균을 순수분리 하였다(12). 분리균의 동정은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 하였다. 프라이머는 Universal PCR primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다.
식초 제조용 종초 선발을 위해 다양한 초산균을 분리한 후, 그들의 발효특성 분석하여 종초 가능성을 검토하였다. 수집된 식초 시료에서 분리된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, A.
4, ethanol 20 mL/L, agar 15g/L)에 초산균을 접종하여 30℃ 및 37℃에 3일간 배양하여 콜로니 생성 유무로써 초산 내성을 판정하였다(16). 정치배양시 콜로이드 생성은 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 20 mL/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, potato extract 200 mg/L)에 초산균을 30℃에 3일간 정치배양 후, 콜로이드 형성 유무를 판정하였다(16). 초산 생성능은 시험배지(D-glucose 10 g/L, glycerol 10 mL/L, polypeptone 2 g/L, yeast extract 2 g/L, potato extract 100 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 40 mL/L)에 초산균을 30℃에 5일간 진탕 배양하여 2일마다 적정산도를 측정하였다(17)
초산 과산화는 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, bromocresol purple 30 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 10 mL/L, agar 15 g/L)에 초산균을 접종하여 푸른색의 콜로니가 생성되면 과산화 특성이 있는 것으로 판정하였다(16). 초산 및 pH 내성 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, acetic acid 30 mL/L, ethanol 20 mL/L, agar 15 g/L), (D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, pH 3.0~3.4, ethanol 20 mL/L, agar 15g/L)에 초산균을 접종하여 30℃ 및 37℃에 3일간 배양하여 콜로니 생성 유무로써 초산 내성을 판정하였다(16). 정치배양시 콜로이드 생성은 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 20 mL/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, potato extract 200 mg/L)에 초산균을 30℃에 3일간 정치배양 후, 콜로이드 형성 유무를 판정하였다(16).
정치배양시 콜로이드 생성은 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 20 mL/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 10 g/L, potato extract 200 mg/L)에 초산균을 30℃에 3일간 정치배양 후, 콜로이드 형성 유무를 판정하였다(16). 초산 생성능은 시험배지(D-glucose 10 g/L, glycerol 10 mL/L, polypeptone 2 g/L, yeast extract 2 g/L, potato extract 100 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 40 mL/L)에 초산균을 30℃에 5일간 진탕 배양하여 2일마다 적정산도를 측정하였다(17)
초산균의 발효 특성을 분석하기 위해, 초산 과산화, 초산 및 pH 내성, 정치배양시 콜로이드 생성 유무, 초산 발효능을 조사하였다. 초산 과산화는 시험배지(D-glucose 5 g/L, glycerol 5 mL/L, polypeptone 5 g/L, yeast extract 5 g/L, bromocresol purple 30 mg/L, acetic acid 10 mL/L, ethanol 10 mL/L, agar 15 g/L)에 초산균을 접종하여 푸른색의 콜로니가 생성되면 과산화 특성이 있는 것으로 판정하였다(16).
프라이머는 Universal PCR primer인 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였고, PCR은 initial denaturation 5분, 그리고 94℃에서 45초간 denaturation, 55℃에서 60초간 annealing 및 72℃에서 60초간 extension cycle을 35회 수행하였다.

대상 데이터

본 연구에서는 한국미생물자원센터(KCTC) 및 한국농업 미생물자원센터(KACC)에서 분양받은 초산균을 대조구로, 국립농업과학원 발효식품과에서 분리한 균주를 공시균으로 사용하였다. 분리균은 전국의 4개 지역(경기 성남, 경북 청도, 전북 무주, 충남 서천)에서 복분자 식초 및 감식초 시료를 수집하여 GYCEA 배지에 도말하고 30℃에서 배양한 후, 초산균을 순수분리 하였다(12).

성능/효과

상위 4종의 균주가 발효 3일 이후부터 식초 발효에 필요한 총산 4%이상 생성하는 것으로 나타냈다. A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga. intermedius V11-5, A. malorum KACC12222에서 가장 높은 산 생성능을 보였다. 상위 4종 외 A.
xylinus V8-1 균주만 다량의 콜로이드를 생성하였으며, 이는 식초 발효균으로 적합하지 않은 성질이다(16). Acetobacter 속 균주중 A. malorum KACC1222, V5-7, A. pasteurianus KACC16934, Gam2는 상층부에 얇은 균막이 발견되었으나, 이는 균주의 성장이 활발한 것을 의미함으로 식초 발효균으로 적합한 것으로 생각된다. 초산균이 생성하는 콜로이드는 초산균의 glucose 대사에 의해 생산되는 dextrans, levans, cellulose이며 세포 외 다당체이다.
1과 같다. KACC16934(RDA-F) 및 Gam2 균주는 A. pasterianus DSM3509(GQ240636)와 염기서열이 99.9%, 100% 일치하여 유연관계가 가장 가까움을 확인할 수 있었다. 따라서 KACC16934, Gam2 균주는 A.
pasterianus로 동정하였다. V5-7균주는 A. malorum DSM14337(JF793957)과 V8-1 균주는 Gluconacetobacter xylinus NRBC15237(AB680815)와 염기서열이 각각 100% 일치하여 A. malorum V5-7 Ga. xylinus V8-1로 동정하였다. 또한, V11-5 균주는 Ga.
초산에 대한 내성은 Gluconacetobacter 속 균주에서만 나타나는 것으로 확인되었다. pH에 대한 내성은 A. malorum V5-7, A. acetii KCTC1010에서 가장 높은 활성을 보였고, Gluconacetobacter 속 균주와 A. pasteurianus Gam2에서도 pH 3.3 까지 내성을 보이는 것으로 나타났다. A.
9%, 100% 일치하여 유연관계가 가장 가까움을 확인할 수 있었다. 따라서 KACC16934, Gam2 균주는 A. pasterianus 또는 그 근연종으로 판단되어 A. pasterianus로 동정하였다. V5-7균주는 A.
xylinus V8-1로 동정하였다. 또한, V11-5 균주는 Ga. intermedius DSM11804(JF793991)와 RDA-S 균주는 Ga. entanii LTH4560(NR028909)와 염기서열이 99.8%, 99.7% 일치하여 Ga. intermedius V11-5, Ga. entanii RDA-S로 동정하였다.
초산균은 당과 알코올을 초산으로 산화시킬 수 있는 능력에 따라 초산과 젖산을 과산화시킬 수 있는 Acetobacter 속 및 Gluconacetobacter 속이 있으며 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 과산화시킬 수 없는 Gluconobacter 속으로 구분된다(3). 본 실험에서는 Acetobacter 속과 Gluconacetobacter 속 모두 과산화하지 않는 것으로 나타났다. Saeki 등(16)이 보고한 바에 따르면 A.
malorum KACC12222에서 가장 높은 산 생성능을 보였다. 상위 4종 외 A. pasteurianus KACC13994, A. pasteurianus KACC16934, Ga. entanii RDA-S 균주도 발효 5일 이후에는 총산이 3% 이상 될 것으로 예상되며, 초산균 7균주가 종초로써 가능성을 나타내었다.
2에 나타내었다. 상위 4종의 균주가 발효 3일 이후부터 식초 발효에 필요한 총산 4%이상 생성하는 것으로 나타냈다. A.
식초 제조용 종초 선발을 위해 다양한 초산균을 분리한 후, 그들의 발효특성 분석하여 종초 가능성을 검토하였다. 수집된 식초 시료에서 분리된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, A. pasteurianus, A. malorum, Ga. entanii, Ga. intermedius, Ga. xylinus로 동정되었다. 식초 제조용 초산균의 발효특성을 분석한 결과, 초산의 과산화능은 모든 시험 균주에서 음성으로 나타나 과산화를 보이지 않았으며, 초산 내성은 Gluconacetobacter 속 균주만 관찰되었다.
xylinus로 동정되었다. 식초 제조용 초산균의 발효특성을 분석한 결과, 초산의 과산화능은 모든 시험 균주에서 음성으로 나타나 과산화를 보이지 않았으며, 초산 내성은 Gluconacetobacter 속 균주만 관찰되었다. pH 내성은 A.
malorum V5-7 균주가 가장 높았다. 식초 품질에 해로운 영향을 주는 섬유질상의 세포외 다당체인 콜로이드 생성 균주는 Ga. intermedius V11-5, Ga. xylinus V8-1균주로 나타났다. 초산 생성능은 A.
xylinus V8-1균주로 나타났다. 초산 생성능은 A. malorum V5-7, A. pasteurianus Gam2, Ga. intermedius V11-5에서 가장 높은 산 생성능을 나타내었다. 본 연구에서는 종초용 초산균의 발효 특성 연구를 통해 국내 발효 식초의 품질 향상을 기대한다.
초산에 대한 내성은 Gluconacetobacter 속 균주에서만 나타나는 것으로 확인되었다. pH에 대한 내성은 A.
초산을 한 번 더 산화시켜 pH를 높이고, 산도를 떨어뜨리는 초산의 과산화 조사에서는 분리 균주 모두 음성으로 나타났으며, 식초 발효시 과산화로 인한 식초 제조의 실패는 적은 것으로 판단된다. 초산균은 당과 알코올을 초산으로 산화시킬 수 있는 능력에 따라 초산과 젖산을 과산화시킬 수 있는 Acetobacter 속 및 Gluconacetobacter 속이 있으며 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 과산화시킬 수 없는 Gluconobacter 속으로 구분된다(3).

후속연구

고품질의 발효식초 제조시 필요한 초산균의 특징은 알코올 산화력, 초산 생성능, 초산의 비과산화, 낮은 pH 저항성, 세포외 다당 비생성 및 이취 미생성 등이 있다(11). 따라서 재래식초의 품질을 향상 시킬 수 있는 산업용 우수 초산균에 대한 연구가 필요하다.
하지만 제조 현장에 적용하기 위해서는 현장 기술과 환경에 적합한 맞춤형 종초 제조 기술에 대한 연구가 필요하다. 본 연구를 통해 종초용 초산균의 선발과 계량으로 국내 발효 식초의 품질 향상에 도움이 되길 바란다.
본 연구에서 국내 재래식초에서 분리된 초산균을 대상으로 웰빙형 발효식초 제조를 위한 초산균의 특성 일부를 규명하였다. 하지만 제조 현장에 적용하기 위해서는 현장 기술과 환경에 적합한 맞춤형 종초 제조 기술에 대한 연구가 필요하다. 본 연구를 통해 종초용 초산균의 선발과 계량으로 국내 발효 식초의 품질 향상에 도움이 되길 바란다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	초산균은 어떻게 분류되는가?	초산균은 그 종류에 따라 생성하는 acetic acid 함량이 다르며 총산 함량을 좌우하는 품질판정의 지표로 이용되므로 우수한 초산균을 개량하는 것은 산업적으로 매우 중요하다. 초산균은 당과 알코올을 초산으로 산화시킬 수 있는 능력에 따라 초산과 젖산을 재산화시킬 수 있는 Acetobacter 속 및 Gluconacetobacter 속과 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 재산화시킬 수 있는 능력이 없는 Gluconobacter 속으로 분류되어 있다. Acetobacter 속 계열의 초산균 대부분은 식초 제조에 이용되고 있다(3)
	식초란?	발효식품은 미생물이 생산한 다양한 유기물들과 2차 대사산물을 가지고 있어 원래의 식품에는 없는 독특한 풍미를 만들어 저장식품보다 음료, 조미 등의 기호성 식품으로서 역할이 커지게 되었다. 식초는 오랜 역사를 가진 조미료로 우리 일상생활과 밀접한 관련을 맺고 있으며, 세계인들이 좋아하는 발효식품이다. 최근, 소비자들의 지적수준 향상으로 발효식품의 기능성에 큰 주목을 받고 있다.
	Acetobacter 속 계열의 초산균 중 정치발효를 하는 발효식초에서 자주 발견되는 대표적인 초산균은?	농촌진흥청에서는 발효식품 제조의 품질 차별화 및 현대화를 위해, 유용 발효미생물을 농업기술센터에 보급함으로써 농산업가공업체의 부가가치 향상에 매진하고 있다. 특히, Acetobacter pasteurianus은 정치발효를 하는 발효식초에서 자주 발견되는 대표적인 초산균이다. 국내 재래 발효식초의 다양화와 부가가치 향상을 위해서는 산 생성능이 우수한 초산균과 종초의 개발이 요구된다.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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