갈대(Phragmites communis Trinius) 성숙종자를 이용한 기내 식물체 재분화와 재분화체의 유전적 다양성 Plant Regeneration and Genetic Diversity of Regenerants from Seed-derived Callus of Reed (Phragmites communis Trinius)원문보기
활용가치가 높은 부존식물자원인 갈대의 기내 번식을 통한 배양체계를 확립하고 재분화 식물체들의 유전적 다양성을 검토한 결과, 성숙종자 유래의 캘러스를 통한 기내 식물체 재분화는 N6배지에서 MS배지보다 양호하였고, 0.25~0.5 mg/L의 BA를 포함한 N6배지에서 가장 높았다. ISSR 마커를 이용하여 재분화 식물체의 유전적 안정성을 분석한 결과, 검출된 총 94 유전좌중 유전적 다형성은 17%였고, 평균 유전자다양도 값(h)은 0.03, BA 5 mg/L를 포함한 N6배지에서 0.008, NAA 0.1 mg/L와 kinetin 2 mg/L를 포함한 MS 배지에서 0.040으로 나타났다. 이것은 재분화된 갈대식물체 개체간에 유전적으로 구조가 매우 단순하고 균일하며, 유전적 다양성 진단에 ISSR 마커가 효과적임을 시사한다.
활용가치가 높은 부존식물자원인 갈대의 기내 번식을 통한 배양체계를 확립하고 재분화 식물체들의 유전적 다양성을 검토한 결과, 성숙종자 유래의 캘러스를 통한 기내 식물체 재분화는 N6배지에서 MS배지보다 양호하였고, 0.25~0.5 mg/L의 BA를 포함한 N6배지에서 가장 높았다. ISSR 마커를 이용하여 재분화 식물체의 유전적 안정성을 분석한 결과, 검출된 총 94 유전좌중 유전적 다형성은 17%였고, 평균 유전자다양도 값(h)은 0.03, BA 5 mg/L를 포함한 N6배지에서 0.008, NAA 0.1 mg/L와 kinetin 2 mg/L를 포함한 MS 배지에서 0.040으로 나타났다. 이것은 재분화된 갈대식물체 개체간에 유전적으로 구조가 매우 단순하고 균일하며, 유전적 다양성 진단에 ISSR 마커가 효과적임을 시사한다.
This study was carried out to address an efficient in vitro regeneration system from seed-derived callus of Phragmites communis, and to evaluate genetic variations of the regenerants using ISSR markers. Shoot regeneration via calli was greatly influenced by N6 medium compared with MS medium, and pla...
This study was carried out to address an efficient in vitro regeneration system from seed-derived callus of Phragmites communis, and to evaluate genetic variations of the regenerants using ISSR markers. Shoot regeneration via calli was greatly influenced by N6 medium compared with MS medium, and plant regeneration frequency was 90% in N6 supplemented with BA 0.25 mg/L and BA 0.5 mg/L. According to ISSR analysis of the thirty regenerants, out of 94 loci detected overall, 16 were identified to be polymorphic with a rate (PR) of 17.0%. The mean gene diversity (h) of different in vitro condition was 0.03 and ranged from 0.008 for N6 with BA 5 mg/L, to 0.040 for MS with IAA 0.1 mg/L+kinetin 2 mg/L. The results indicate that the regenerants have a low genetic variation, and ISSR analysis is effective to detect genetic variation of regenerants.
This study was carried out to address an efficient in vitro regeneration system from seed-derived callus of Phragmites communis, and to evaluate genetic variations of the regenerants using ISSR markers. Shoot regeneration via calli was greatly influenced by N6 medium compared with MS medium, and plant regeneration frequency was 90% in N6 supplemented with BA 0.25 mg/L and BA 0.5 mg/L. According to ISSR analysis of the thirty regenerants, out of 94 loci detected overall, 16 were identified to be polymorphic with a rate (PR) of 17.0%. The mean gene diversity (h) of different in vitro condition was 0.03 and ranged from 0.008 for N6 with BA 5 mg/L, to 0.040 for MS with IAA 0.1 mg/L+kinetin 2 mg/L. The results indicate that the regenerants have a low genetic variation, and ISSR analysis is effective to detect genetic variation of regenerants.
ISSR 마커를 이용하여 표 5에 제시한 배지 종류별로 캘러스에서 식물체를 재분화시켜 순화시킨 개체를 대상으로 유전적 다형성을 분석하였다(Table 4). 12개 프라이머를 사용하여 공시한 10조합 30개체를 분석한 결과, 프라이머 당 밴드수는 최저 3개(UBC 812)에서 최고 12개(UBC 842)로한 프라이머 조합당 평균 7.
ISSR에서 분석된 DNA 밴드 양상은 이진수를 이용하여 밴드 유·무에 따라 1과 0으로 data를 표시하고 다형성 비율 (PR), 유전좌당 평균 대립유전자수(na)와 유효대립유전자수 (ne), 유전자 다양도(h), 처리집단간 유전적 거리를 POPGENE Ver. 1.32를 이용하여 분석하였다(Kimura and Crow 1964; Nei, 1973; Nei, 1978).
PCR 반응은 Gene Amp 2700(Applied Biosystem, UK)을 사용하여 94℃에서 5분간 초기 변성시킨 후 94℃에서 45초간 denaturation, 48℃에서 45분간 annealing, 72℃에서 1분 30초간 extension을 40회 수행한 후 최종적으로 72℃에서 7분간 반응시킨 후 종료하였다. PCR이 완료된 후의 증폭산물을 Lapchip GX electrophoresis system (Caliper life science, USA)을 사용하여 밴드를 확인하였다.
성숙종자 순천만 재배 농가(보람농장)에서 구입하여 이용하였다. 구입종자 처리는 1 mm 체(키친크레프트, Korea) 를 이용하여 종자를 채취한 후 1 L 비커의 물에 종자를 처리하여 가라앉는 종자를 수선하여 식물재료로 이용하였다. 이렇게 준비한 성숙종자를 70% ethanol에 15초간 표면살균한 뒤 멸균증류수로 3회 수세하고, 수세한 성숙종자를 2% NaOCl 용액에 15분간 표면살균 하였다.
이렇게 준비한 성숙종자를 70% ethanol에 15초간 표면살균한 뒤 멸균증류수로 3회 수세하고, 수세한 성숙종자를 2% NaOCl 용액에 15분간 표면살균 하였다. 성숙종자 표면에 남아있는 락스 용액을 제거하기 위해서 멸균증류수로 1분 간격으로 3회 수세한 뒤 멸균된 여과지로 수분을 제거시켜 배양용 시료로 사용하였다.
성숙종자에서 캘러스를 얻기 위하여 2,4-D(2,4-dichloro phenoxy acetic acid)와 BA를 혼용첨가(2,4-dichlorophenoxy acetic acid 1.0 mg/L+BA 0.1 mg/L와 2,4-D 0.5 mg/L+BA 0.1 mg/L)한 MS기본배지(Murashige and Skoog, 1962)에 종자를 치상하여 캘러스를 유도하였다. 종자치상은 처리구당 120개씩 5반복으로 총 600개였고, 24±2℃, 16 h light/8 h dark, 20 μmol/m2/sec 광조건으로 배양을 실시하였다.
성숙한 종자로부터 유도된 4주째의 캘러스를 MS배지에 BA, TDZ, kinetin 각각 2.0 mg/L에 IAA와 NAA 0.1 mg/L를 각각 첨가한 배지와 N6(Chu et al., 1975) 배지에 BA 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 mg/L를 농도별로 처리한 배지에서 동일한 종자에서 증식된 캘러스를 각각 10개체 3반복으로 4주간 배양하여 1 cm 이상 자란 것을 재분화 개체로 간주하였다. 재분화된 개체는 MS배지에 계대배양하여 뿌리발생을 유도한 후 원예용 상토(흥농종묘)에 이식, 재배하여 DNA 추출에 이용하였다.
종자치상은 처리구당 120개씩 5반복으로 총 600개였고, 24±2℃, 16 h light/8 h dark, 20 μmol/m2/sec 광조건으로 배양을 실시하였다. 유도된 캘러스는 상기 조건에서 2주 간격으로 계대배양 하였고, 배양 4주후 처리구당 120개체 3반복으로 캘러스 유도율을 산출 하였다. 배지의 pH는 5.
구입종자 처리는 1 mm 체(키친크레프트, Korea) 를 이용하여 종자를 채취한 후 1 L 비커의 물에 종자를 처리하여 가라앉는 종자를 수선하여 식물재료로 이용하였다. 이렇게 준비한 성숙종자를 70% ethanol에 15초간 표면살균한 뒤 멸균증류수로 3회 수세하고, 수세한 성숙종자를 2% NaOCl 용액에 15분간 표면살균 하였다. 성숙종자 표면에 남아있는 락스 용액을 제거하기 위해서 멸균증류수로 1분 간격으로 3회 수세한 뒤 멸균된 여과지로 수분을 제거시켜 배양용 시료로 사용하였다.
0 mg/L를 농도별로 처리한 배지에서 동일한 종자에서 증식된 캘러스를 각각 10개체 3반복으로 4주간 배양하여 1 cm 이상 자란 것을 재분화 개체로 간주하였다. 재분화된 개체는 MS배지에 계대배양하여 뿌리발생을 유도한 후 원예용 상토(흥농종묘)에 이식, 재배하여 DNA 추출에 이용하였다.
종자치상은 처리구당 120개씩 5반복으로 총 600개였고, 24±2℃, 16 h light/8 h dark, 20 μmol/m2/sec 광조건으로 배양을 실시하였다.
대상 데이터
20개의 ISSR 프라이머(UBC primer Set No. 9, University of British Columbia, Canada)로 예비실험을 실시한 후의 밴드가 명확한 12개의 프라이머를 선택하여 ISSR 분석에 이용하였다(Table 3). PCR 반응액의 조성은 총 50 ㎕로 주형 DNA 20 ng/μl, Taq polymerase 1 unit, 10×PCR reaction buffer(10 mM Tris-HCl pH 8.
Media conditions with various kinds of plant growth regulators were included in Table 5. A total of 30 samples (3 samples per medium) were used for ISSR.
성숙종자 순천만 재배 농가(보람농장)에서 구입하여 이용하였다. 구입종자 처리는 1 mm 체(키친크레프트, Korea) 를 이용하여 종자를 채취한 후 1 L 비커의 물에 종자를 처리하여 가라앉는 종자를 수선하여 식물재료로 이용하였다.
이론/모형
기내배양에 의한 변이성을 분석하고자 동일한 종자에서 유래한 캘러스를 재분화 시킨 개체 중 신초 재분화율이 높았던 10개 조합(Table 5)에서 각각 순화된 3개체씩 총 30개체를 대상으로 CTAB 법(Fang et al., 1992)으로 DNA를 추출하였다. DNA 농도 측정은 UV/VIS Spectrophotometer (Ultraspec 2000, Pharamacia Biotech, UK)를 이용하였으며, 최종농도는 20 ng/μl로 희석하였다.
성능/효과
ISSR 마커를 이용하여 표 5에 제시한 배지 종류별로 캘러스에서 식물체를 재분화시켜 순화시킨 개체를 대상으로 유전적 다형성을 분석하였다(Table 4). 12개 프라이머를 사용하여 공시한 10조합 30개체를 분석한 결과, 프라이머 당 밴드수는 최저 3개(UBC 812)에서 최고 12개(UBC 842)로한 프라이머 조합당 평균 7.83개였으며, 4개 프라이머(UBC 809, UBC 812, UBC 813, UBC 847)에서는 모두 동일한 밴드패턴을 보였다. 다형성 밴드의 수는 최소 1개(UBC 808, UBC 811, UBC 841)에서 최대 3개(UBC 821, UBC 835, UBC 842) 사이로 평균 다형성 밴드는 1.
australis. A: Callus induction from mature seeds of reed in MS with 2,4-D 1.0+BA 0.1 mg/L after 4 weeks, B: Shoot induction in MS with 2.0 mg/L of kinetin after 4 weeks, C: Shoot induction in MS with kinetin 2.0+NAA 0.1 mg/L after 4 weeks, D: Shoot induction in MS with kinetin 2.0+IAA 0.1 mg/L after 4 weeks, E: Shoot induction in N6 after 4 weeks, F: Shoot induction in N6 with 0.5 mg/L of BA after 4 weeks, G: Shoot induction in N6+BA 1.0 mg/L after 4 weeks, H: Shoot induction in N6 with 5.0 mg/L of BA after 4 weeks.
5 mg/L를 처리한 배지에서 신초분화후 MS 배지에서 발근을 유도하면 단기간 내에 대량으로 증식이 가능하며, 순화된 개체들은 비교적 유전적 구조가 안정한 것으로 나타났다. ISSR 마커로 유전적 다양성을 평가한 결과, 전체 개체간에는 17.0%의 다형성을 나타내었고, 동일한 처리구내 개체간에는 평균 6.72%의 다형성을 나타내었다. 유전자 다양도(h), 유전적 유사도지수는 평균은 각각 0.
5 mg/L의 BA를 포함한 N6배지에서 가장 높았다. ISSR 마커를 이용하여 재분화 식물체의 유전적 안정성을 분석한 결과, 검출된 총 94 유전좌중 유전적 다형성은 17%였고, 평균 유전자다양도 값(h)은 0.03, BA 5 mg/L를 포함한 N6배지에서 0.008, NAA 0.1 mg/L와 kinetin 2 mg/L를 포함한 MS 배지에서 0.040으로 나타났다. 이것은 재분화된 갈대식물체 개체간에 유전적으로 구조가 매우 단순하고 균일하며, 유전적 다양성 진단에 ISSR 마커가 효과적임을 시사한다.
03이었다. 각 처리간 유전적 유사도는 최소 0.9193(4번과 8번)에서 0.9853(6번과 9번) 사이로 10개 처리 개체간 평균 0.960의 유전적 유사도를 나타내었다(Table 6). 이는 Jikku et al.
83개였으며, 4개 프라이머(UBC 809, UBC 812, UBC 813, UBC 847)에서는 모두 동일한 밴드패턴을 보였다. 다형성 밴드의 수는 최소 1개(UBC 808, UBC 811, UBC 841)에서 최대 3개(UBC 821, UBC 835, UBC 842) 사이로 평균 다형성 밴드는 1.33개가 검출되었다 (Fig. 2). 캘러스에서 재분화된 개체들에서 증폭된 총 94개의 밴드 중 16개의 다형성 밴드가 나타나 17.
본 연구 결과를 종합하면 성숙한 종자에서 유도된 캘러스를 N6배지에 BA 0.5 mg/L를 처리한 배지에서 신초분화후 MS 배지에서 발근을 유도하면 단기간 내에 대량으로 증식이 가능하며, 순화된 개체들은 비교적 유전적 구조가 안정한 것으로 나타났다. ISSR 마커로 유전적 다양성을 평가한 결과, 전체 개체간에는 17.
생장조절제와 농도를 달리한 배지의 조성별 유전적 다형성 비율을 분석한 결과(Table 5), 유전적 다형성은 3번 (MS+IAA 0.1+kinetin 2 mg/L) 10.75%, 6번(N6+BA 0.25 mg/L) 9.68%, 1번(MS+kinetin 2 mg/L) 8.06%, 5번(N6+BA 0.1 mg/L)과 9번(N6+BA 2.5 mg/L) 7.53%, 2번(MS+NAA 0.1+kinetin 2.0 mg/L)과 4번(N6) 6.45%, 7번(N6+BA 0.5 mg/L)과 8번(N6+BA 1.0 mg/L) 4.3%, 10번(N6+BA 5.0 mg/L) 2.15% 순으로 평균 6.72%의 유전적 다형성을 나타내어 생장조절제에 따른 일정한 경향은 찾을 수 없었다. 각 처리별 평균 대립유전자수(na)는 최소 0.
0%로 오히려 감소하였다. 신초의 길이는 BA 0～0.5 mg/L까지는 증가하여 BA 0.5 mg/L 에서 14.6 cm로 가장 길게 나타났으며, BA 1.0 mg/L 이상의 농도에서는 BA 농도가 증가함에 따라서 감소하는 경향이 었다. 이 결과는 본 연구에서 MS배지에 NAA, IAA와 kinetin을 조합하여 나타난 신초 재분화율 보다 높게 나타난 것이며, 벼에서 MS배지와 N6 배지를 비교한 결과 캘러스 유도와 신초분화에 N6배지가 효과적이라는 연구결과 (Muhammad et al.
1-B～D), 전체 9개 처리구에서 신초로 재분화가 일어났다. 싸이토키닌인 kinetin 처리구에서 옥신의 종류와 상관없이 모두 83.3%의 높은 재분화율을 나타내었고, IAA를 혼용하였을때 NAA를 혼용할 때보다 다소 높은 재분화율을 나타내었다. 이는 Kim et al.
유도된 캘러스로부터 식물체 재분화를 관찰하기 위해 BA, TDZ, kinetin 각각 2.0 mg/L와 NAA, IAA 0.1 mg/L를 포함한 MS 고체배지에 캘러스를 배양한 결과(Table 2, Fig. 1-B～D), 전체 9개 처리구에서 신초로 재분화가 일어났다. 싸이토키닌인 kinetin 처리구에서 옥신의 종류와 상관없이 모두 83.
72%의 다형성을 나타내었다. 유전자 다양도(h), 유전적 유사도지수는 평균은 각각 0.03과 0.960으로 안정한 것으로 나타났다.
0 mg/L 이상의 농도에서는 BA 농도가 증가함에 따라서 감소하는 경향이 었다. 이 결과는 본 연구에서 MS배지에 NAA, IAA와 kinetin을 조합하여 나타난 신초 재분화율 보다 높게 나타난 것이며, 벼에서 MS배지와 N6 배지를 비교한 결과 캘러스 유도와 신초분화에 N6배지가 효과적이라는 연구결과 (Muhammad et al., 2008)와 유사한 것을 볼 때 화본과 식물의 특성으로 보인다. 또한 Kim et al.
2012)에 비하여 낮은 수준이다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 종자에서 각각 재분화되 었음에도 불구하고 재분화된 식물 개체간의 유전적 구조가 매우 단순하고 동질성이 높은 구조임을 시사한다. 또한 유전적 변이는 처리한 생장조절제의 종류와 농도에 관계없이 무작위로 발생하였다.
2). 캘러스에서 재분화된 개체들에서 증폭된 총 94개의 밴드 중 16개의 다형성 밴드가 나타나 17.0%의 다형성 비율을 나타내었다. 이는 MS배지에 다양한 생장조절물질을 첨가하여 얻은 Jatropha curcas의 캘러스를 RAPD 분석 하여 얻은 91.
활용가치가 높은 부존식물자원인 갈대의 기내 번식을 통한 배양체계를 확립하고 재분화 식물체들의 유전적을 검토한 결과, 성숙종자 유래의 캘러스를 통한 기내 식물체 재분화는 N6배지에서 MS배지보다 양호하였고, 0.25～0.5 mg/L의 BA를 포함한 N6배지에서 가장 높았다. ISSR 마커를 이용하여 재분화 식물체의 유전적 안정성을 분석한 결과, 검출된 총 94 유전좌중 유전적 다형성은 17%였고, 평균 유전자다양도 값(h)은 0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
갈대는 어디에 사용되는가?
, 1998; Lee, 1993). 우리나라에서도 전국적으로 자생하며, 카드뮴 등에 의해 오염된 수질을 정화시켜주는 phytoremidation 소재, 가축사료, 건축용자재 등에 널리 사용되고 있다 (Koppitz et al., 1997; Ziedler et al.
갈대는 무엇인가?
갈대(Phragmites communis Trinius)는 벼과(Gramineae)에 속하는 다년초로서 중국, 한국, 일본, 러시아, 쿠릴열도 등 북반구의 온대지방에서 아한대에 넓게 분포한다(Kohl et al., 1998; Lee, 1993).
갈대는 어디에 분포하는가?
갈대(Phragmites communis Trinius)는 벼과(Gramineae)에 속하는 다년초로서 중국, 한국, 일본, 러시아, 쿠릴열도 등 북반구의 온대지방에서 아한대에 넓게 분포한다(Kohl et al., 1998; Lee, 1993).
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