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문제 정의
- 본 연구에서는 더덕을 초고압 공정처리 후 발효 공정을 이용한 수중 미로 시험과 수동 회피 시험을 통한 더덕 추출물의 인지능 개선 효과 및 마우스 해마 유래 세포주(HT22 cell line)를 이용한 뇌신경세포 보호 활성을 측정하고 초고압 발효에 의한 활성의 증가 효과를 확인하였다.
- 본 연구는 기억 손상이 유발된 마우스에 대한 초고압 발효 더덕 추출물의 기억력 개선 효과와 glutamate에 의한 세포 사멸에 대한 뇌신경 세포 보호 활성을 측정 하였으며, 초고압 발효에 의한 더덕의 활성 증가를 평가하였다. 초고압 발효 더덕 추출물의 인지능 개선 효과를 측정하기 위해 scopolamine을 이용하여 마우스의 기억력을 손상시켰다.
제안 방법
- 적응기간 동안 사료와 물을 제한 없이 자유 공급하였으며, 온도는 22±2℃, 습도는 50±10%를 유지시키고, 명암은 12시간을 주기(09:00~21:00)로 조절하였다.
- 본 실험에 사용된 더덕은 강원도 횡성 지역에서 2012년 8월에 채취한 것을 사용하였다. 대전대학교 서영배 교수님을 통해 식물분류학적 동정을 실시하였다. 더덕을 세정한 후 마하스팀기(Daechang stainless, Korea) 를 사용하여 증숙된 더덕 100 g을 70% 에탄올 200 ml와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 비닐 팩에 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치(Ilshin, Korea)를 이용하여 3,000 bar 압력으로 25℃에서 30분간 초고압 추출을 실행하였다.
- 대전대학교 서영배 교수님을 통해 식물분류학적 동정을 실시하였다. 더덕을 세정한 후 마하스팀기(Daechang stainless, Korea) 를 사용하여 증숙된 더덕 100 g을 70% 에탄올 200 ml와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 비닐 팩에 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치(Ilshin, Korea)를 이용하여 3,000 bar 압력으로 25℃에서 30분간 초고압 추출을 실행하였다. 초고압 공정을 거진 더덕에 8배수의 물을 가한 후, 유산균인 Bifidobacterium longum (KACC 20587), Lactobacillus acidophilus (KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides (KACC 12312)을 각각 106 CFU/g의 농도로 혼합하여 접종하였으며 밀봉 후, 37℃에서 48시간 동안 혐기 조건하에서 dry oven을 이용하여 발효 하였다.
- 일반 생더덕과 발효액을 제거한 초고압 더덕 시료를 100 g씩 10배수(v/w)의 70% 에탄올을 사용하여 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에서 24시간 추출하였다. 추출액은 회전식 감압농축기(EYELA N-1000, Japan)를 사용하여 여과한 추출액을 농축시킨 후 동결건조기(ILSIN, Korea)를 통해 분말 상태로 준비하여 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 사육실에서 일주일 동안 적응시킨 후, 임의로 각 군당 7마리씩 구성하였다. 실험군은 대조군, scopolamine 투여군, donepezil 투여군, 농도 별 일반더덕 추출물 투여군, 농도 별 초고압 발효 더덕 추출물 투여군으로 나누었다. 적응기간 동안 사료와 물을 제한 없이 자유 공급하였으며, 온도는 22±2℃, 습도는 50±10%를 유지시키고, 명암은 12시간을 주기(09:00~21:00)로 조절하였다.
- 동물 실험인 수중 미로 시험 과 수동 회피 시험 120분 전에 양성 대조군인 1 mg/kg의 donepezil과 100과 300 mg/kg의 농도로 일반 더덕 추출물과 초고압 발효 더덕 추출물을 경구 투여 하였으며, 투여 방법은 금속제 경구투여용 존대를 이용하였다. 동물 실험 30분 전에 기억 손상을 유도하기 위한 scopolamine (1 mg/kg)을 피하투여 하였다.
- 동물 실험인 수중 미로 시험 과 수동 회피 시험 120분 전에 양성 대조군인 1 mg/kg의 donepezil과 100과 300 mg/kg의 농도로 일반 더덕 추출물과 초고압 발효 더덕 추출물을 경구 투여 하였으며, 투여 방법은 금속제 경구투여용 존대를 이용하였다. 동물 실험 30분 전에 기억 손상을 유도하기 위한 scopolamine (1 mg/kg)을 피하투여 하였다. 대조군은 같은 량의 생리식염수만을 투여하였다.
- 동물 실험 30분 전에 기억 손상을 유도하기 위한 scopolamine (1 mg/kg)을 피하투여 하였다. 대조군은 같은 량의 생리식염수만을 투여하였다.
- 16) Water maze pool (직경 90 cm, 높이 40 cm) 안에 물(20±1℃)을 채우고 platform이 보이지 않게 하기 위해 우유를 섞어 불투명하게 하였고 Pool을 4구간으로 나누고 그중 한 구간의 중간에 platform(직경 10 cm, 높이 26 cm)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하였다. 4일 동안 2번 반복실험(trial 1 과 trial 2)을 하였으며, trial 사이에 20분씩 간격을 두었다. 입수 지점은 매일 동서남북 방향으로 구간별 위치를 달리하였으며 platform의 위치는 실험기간 동안 고정하였다.
- 실험 첫날은 적응 실험으로 platform 없이 60초 동안 수영을 하도록 하였다. 2일째부터 측정 실험을 진행하였으며, 마우스가 platform에 도달하면 10초 동안 platform에 머물게 하였으며, 120초 동안 platform을 찾지 못하면 실험을 멈추고 마우스를 platform에 올려놓은 후 10초 동안 기억 시킨 후 다음 실험을 진행한다. 입수 지점에서 platform을 찾아가는 시간(escape latency)를 기록하여 공간 기억 개선 능력 평가하였다.
- 2일째부터 측정 실험을 진행하였으며, 마우스가 platform에 도달하면 10초 동안 platform에 머물게 하였으며, 120초 동안 platform을 찾지 못하면 실험을 멈추고 마우스를 platform에 올려놓은 후 10초 동안 기억 시킨 후 다음 실험을 진행한다. 입수 지점에서 platform을 찾아가는 시간(escape latency)를 기록하여 공간 기억 개선 능력 평가하였다. 6일째 platform을 제거한 후, 1분 동안 마우스를 수영하게 한 후, platform이 위치한 구간에서의 머무름 시간을 측정(s)하여 기록하는 probe test를 진행하였다.
- 입수 지점에서 platform을 찾아가는 시간(escape latency)를 기록하여 공간 기억 개선 능력 평가하였다. 6일째 platform을 제거한 후, 1분 동안 마우스를 수영하게 한 후, platform이 위치한 구간에서의 머무름 시간을 측정(s)하여 기록하는 probe test를 진행하였다.
- 기억력 평가를 위해 수동회피 시험을 진행하였으며, 수동 회피 상자(GEMINITM Avoidance System, San Diego Instruments, San Diego, CA, USA)를 통해 step- through test를 실시하였다. 두 개의 아크릴 상자가 있고 상자 사이에는 마우스가 이동할 수 있는 문이 설치되어 있다.
- 7×104 cells/300 µl를 분주하여 24시간 배양한 후 일반 더덕, 초고압 발효 더덕, 50 µM Trolox (positive control)와 2 mM glutamate를 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 MTT assay를 시행하였다. 뇌세포 보호 활성은 relative protection (%)로 나타냈다.
- 초고압 발효 더덕의 공간 기억력 개선 효과를 평가하기 위해 널리 사용되는 수중 미로 시험을 실시하였다. 4일 동안의 실험에서 대조군은 수중 미로 상의 platform을 찾아가는 평균 escape latency가 실험이 진행됨에 따라 감소하였으나, 치매 유발을 위한 scopolamine 처리군은 실험 기간과 관계없이 platform을 찾아가지 못하였다.
- 초고압 발효 더덕의 단순 기억력 증진 효과를 측정하기 위해 수동 회피 실험을 실시하였다. 대조군의 step-through latency는 115.
- 본 연구는 기억 손상이 유발된 마우스에 대한 초고압 발효 더덕 추출물의 기억력 개선 효과와 glutamate에 의한 세포 사멸에 대한 뇌신경 세포 보호 활성을 측정 하였으며, 초고압 발효에 의한 더덕의 활성 증가를 평가하였다. 초고압 발효 더덕 추출물의 인지능 개선 효과를 측정하기 위해 scopolamine을 이용하여 마우스의 기억력을 손상시켰다. 치매 질환의 증상 중 기억력 및 인지능 감퇴는 acetylcholine과 같은 콜린성 신경 전달물질과 관련이 있으며, muscarinic receptor antagonist인 scopolamine의 경우, acetylcholine의 작용을 억제하여 치매를 유발시킨다.
- 더덕을 세정한 후 마하스팀기(Daechang stainless, Korea) 를 사용하여 증숙된 더덕 100 g을 70% 에탄올 200 ml와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 비닐 팩에 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치(Ilshin, Korea)를 이용하여 3,000 bar 압력으로 25℃에서 30분간 초고압 추출을 실행하였다. 초고압 공정을 거진 더덕에 8배수의 물을 가한 후, 유산균인 Bifidobacterium longum (KACC 20587), Lactobacillus acidophilus (KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides (KACC 12312)을 각각 106 CFU/g의 농도로 혼합하여 접종하였으며 밀봉 후, 37℃에서 48시간 동안 혐기 조건하에서 dry oven을 이용하여 발효 하였다. 발효 후 발효액과 발효물(더덕)을 분리하였다.
대상 데이터
- )로부터 구입하여 사용하였다. 발효 공정에 사용된 유산균인 Bifidobacterium longum (KACC 20587), Lactobacillus acidophilus (KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides (KACC 12312)은 농업미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받았다.
- 본 실험에 사용된 더덕은 강원도 횡성 지역에서 2012년 8월에 채취한 것을 사용하였다. 대전대학교 서영배 교수님을 통해 식물분류학적 동정을 실시하였다.
- 일반 생더덕과 발효액을 제거한 초고압 더덕 시료를 100 g씩 10배수(v/w)의 70% 에탄올을 사용하여 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 flask에서 24시간 추출하였다. 추출액은 회전식 감압농축기(EYELA N-1000, Japan)를 사용하여 여과한 추출액을 농축시킨 후 동결건조기(ILSIN, Korea)를 통해 분말 상태로 준비하여 실험에 사용하였다.
- 4주령의 수컷 ICR mouse을 대한 바이오링크(충북 음성군, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 사육실에서 일주일 동안 적응시킨 후, 임의로 각 군당 7마리씩 구성하였다.
- 4주령의 수컷 ICR mouse을 대한 바이오링크(충북 음성군, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물은 사육실에서 일주일 동안 적응시킨 후, 임의로 각 군당 7마리씩 구성하였다. 실험군은 대조군, scopolamine 투여군, donepezil 투여군, 농도 별 일반더덕 추출물 투여군, 농도 별 초고압 발효 더덕 추출물 투여군으로 나누었다.
- 일반 더덕과 초고압 발효 더덕의 뇌신경세포 보호 활성을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 생쥐 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 서울대학교로부터 분양 받아 사용하였다. HT22 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃에서 배양하였다.
- 뇌신경 세포 보호 활성은 glutamate 로 독성을 유발시킨 마우스 유래 해마 세포주(HT22 cell line)을 사용하여 측정하였다. 측정 결과, Fig.
- (Eggenstein, Germany)로부터 구입하였다. Glutamate와 positive control으로 사용되는 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbboxylic acid (trolox), 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), Scopolamine, carboxymethyl cellulose는 Sigma (St. Louis, U.S.A.)로부터 구입하여 사용하였다. 발효 공정에 사용된 유산균인 Bifidobacterium longum (KACC 20587), Lactobacillus acidophilus (KACC 12419), Leuconostoc mesenteroides (KACC 12312)은 농업미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양 받았다.
데이터처리
- 통계처리는 SPSS 통계 (IBM SPSS statistics 20)을 이용하여 분석분석 (ANOVA)을 실시하였고, 각 처리군들의 유의성은 P<0.001의 수준까지 유의성을 검정하였다.
- One-way ANOVA followed by Tukey’s test; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 significant in comparison to control.
- 뇌세포 보호 활성은 relative protection (%)로 나타냈다. 통계처리는 ANOVA test를 적용하였으며, 각각 3회 반복 실험치를 이용하여 계산하였다.
이론/모형
- 수중 미로 시험은 공간 기억력 측정을 위해 널리 이용되고 있는 실험으로 Morris가 제시한 방법을 응용하였다.16) Water maze pool (직경 90 cm, 높이 40 cm) 안에 물(20±1℃)을 채우고 platform이 보이지 않게 하기 위해 우유를 섞어 불투명하게 하였고 Pool을 4구간으로 나누고 그중 한 구간의 중간에 platform(직경 10 cm, 높이 26 cm)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하였다.
- 일반 더덕과 초고압 발효 더덕의 뇌신경세포 보호 활성을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다. 생쥐 해마 유래 세포주인 HT22 세포는 서울대학교로부터 분양 받아 사용하였다.
- 치매 질환의 증상 중 기억력 및 인지능 감퇴는 acetylcholine과 같은 콜린성 신경 전달물질과 관련이 있으며, muscarinic receptor antagonist인 scopolamine의 경우, acetylcholine의 작용을 억제하여 치매를 유발시킨다.17,18) 공간 기억력을 평가하기 위해 Morris water maze test를 진행하였다. 초고압 발효 더덕 추출물의 경우 실험 2일째부터 escape latency가 감소되었으며, scopolamine 처리군과 일반 더덕 추출물 처리군 보다 감소하였다.
성능/효과
- 의학 기술과 생명과학의 발달로 인간의 평균 수명이 연장되었고, 노령인구가 증가함에 따라 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 질환에 대한 관심이 집중되고 있어 사회적인 문제로 대두되고 있다.1) 알츠하이머 병의 경우, 환자 개인의 생산성 상실과, 뇌기능의 손실로 인한 질환의 특수성으로 인해, 간호가 필수적인 질병으로 주변의 피해를 통해 사회, 경제적 손실이 큰 질환이다. 따라서 치매 치료제의 개발은 사회적ㆍ경제적 이익의 극대화에 기여할 수 있다.
- 초고압 발효 더덕 추출물 처리군은 escape latency가 감소하는 경향을 나타내었으며 초고압 발효 더덕 추출물 처리군(300 mg/kg)은 4일째에는 유의적으로 감소하였다(p<0.05) (Fig. 1A).
- Platform을 제거한 Probe test에서 scopolamine 처리군과 초고압 발효 더덕 추출물(300 mg/kg)의 platform이 위치한 구간의 머무름 시간은 각각 10.23±2.21초와 16.85±1.00초로 5.62초 정도의 차이를 보여 통계적으로 유의성 있는 기억력 개선 효과를 확인하였다 (Fig. 1B).
- 측정 결과, Fig. 3에 나타내었듯이 초고압 발효 더덕 추출물은 500 µg/ml에서 38.36%의 세포보호 활성을 나타내었고 일반 더덕 추출물은 500 µg/ml에서 31.79%의 세포보호 활성을 나타내어 초고압 발효 공정 처리 후 뇌신경세포 보호 활성의 증가를 확인하였다.
- 초고압 발효 더덕 추출물 처리군의 경우, 100 µg/ml과 300 µg/ml에서 각각 64.2±4.3초와 77.6±5.3초를 나타내었으며, 일반 더덕 추출물 처리군의 경우, stepthrough latency가 scopolamine 처리군보다 유의적으로 증가하였음을 확인하여 기억력 개선 효과가 있음을 나타내었다 (Fig. 2).
- 초고압 발효 더덕 추출물 처리군은 실험 기간 동안 일반 더덕 추출물 처리군 보다 기억력 개선 효과가 높은 것으로 나타났다.
- 9초이었다. Scopolamine 처리군이 대조군에 비해 step-through latency가 감소되어 치매가 유발된 것을 확인 할 수 있었다. 초고압 발효 더덕 추출물 처리군의 경우, 100 µg/ml과 300 µg/ml에서 각각 64.
- 17,18) 공간 기억력을 평가하기 위해 Morris water maze test를 진행하였다. 초고압 발효 더덕 추출물의 경우 실험 2일째부터 escape latency가 감소되었으며, scopolamine 처리군과 일반 더덕 추출물 처리군 보다 감소하였다. 4일째는 양성 대조군으로 사용된 donepezil (1 mg/kg) 처리군과 유사한 escape latency를 나타내었다.
- Probe test에서도 scopolamine 처리군 보다 platform이 위치한 곳에서의 머무름 시간이 증가됨을 확인되어 초고압 발효 더덕 추출물이 공간 기억력 개선 효과가 있음을 보여 주었다. 수동 회피 실험은 단순 기억력 개선 효과를 평가하였으며, 초고압 발효 더덕 추출물을 처리군은 scopolamine 처리군에 비해 step-through latency이 유의적으로 증가하였다. 이 동물 실험을 통해 초고압 발효 더덕 추출물이 공간인지 기억력 및 단순 기억력 손상에 대한 개선 효과를 나타내며, 초고압 발효 공정이 일반 더덕 추출물의 인지능 개선 효과를 증가 시킨 것으로 확인 되었다.
- 수동 회피 실험은 단순 기억력 개선 효과를 평가하였으며, 초고압 발효 더덕 추출물을 처리군은 scopolamine 처리군에 비해 step-through latency이 유의적으로 증가하였다. 이 동물 실험을 통해 초고압 발효 더덕 추출물이 공간인지 기억력 및 단순 기억력 손상에 대한 개선 효과를 나타내며, 초고압 발효 공정이 일반 더덕 추출물의 인지능 개선 효과를 증가 시킨 것으로 확인 되었다. scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴 마우스 모델을 이용한 행동 실험에서의 초고압 발효 더덕의 인지 능력 향상 효과는 콜린신경계에서의 acetylcholine의 합성, 분해, 분비 및 acetylcholine 수용체와 관련이 있는 것으로 사료된다.
- 22) 결론적으로 초고압 발효 더덕 추출물은 일반 더덕 추출물보다 scopolamine으로 유도된 기억력 손상 마우스를 이용한 수중 미로 실험과 수동 회피 실험에서 향상된 인지능력 개선 효과를 나타내었으며, 마우스 해마 유래 세포주에서 뇌신경 세포 보호 활성을 나타내었다.
- 또한 신경 세포 손상은 알츠하이머 병의 원인이 된다.19) 일반 더덕 추출물과 초고압 발효 더덕 추출물의 뇌신경 세포 보호 활성을 측정한 결과, glutamate로 유도된 마우스 해마 유래 세포주인 HT22 cells의 산화적 손상에 대해 초고압 발효 더덕 추출물은 농도 의존적으로 뇌신경 세포 보호 활성을 보였으며, 일반 더덕 추출물 보다 높은 활성을 나타냈다. Glutamate는 중추 신경계의 흥분성 신경 전달 물질로 뉴런의 생장과 이동을 조절하며, 기억력과 관련하여 중요한 역할을 한다.
- 20,21) 초고압 발효 더덕의 인지능력 개선 효과는 항산화 효과를 통해 산화적 스트레스로부터의 뇌신경 세포 보호와 관련 있는 것으로 보여진다. 일반 더덕과 초고압 발효 더덕의 활성 증가와 관련하여 초고압 발효 공정은 더덕의 총 페놀화합물과 플라보노이드 량을 증가시켰으며, 항산화 효과를 증가 시킨 것을 예전 연구에서 확인하였다.22) 결론적으로 초고압 발효 더덕 추출물은 일반 더덕 추출물보다 scopolamine으로 유도된 기억력 손상 마우스를 이용한 수중 미로 실험과 수동 회피 실험에서 향상된 인지능력 개선 효과를 나타내었으며, 마우스 해마 유래 세포주에서 뇌신경 세포 보호 활성을 나타내었다.
후속연구
- 22) 결론적으로 초고압 발효 더덕 추출물은 일반 더덕 추출물보다 scopolamine으로 유도된 기억력 손상 마우스를 이용한 수중 미로 실험과 수동 회피 실험에서 향상된 인지능력 개선 효과를 나타내었으며, 마우스 해마 유래 세포주에서 뇌신경 세포 보호 활성을 나타내었다. 초고압 발효 더덕 추출물이 치매 예방이나 치료제 개발에 좋은 소재로 활용 될 수 있을 것이며, 추후 제조된 초고압 발효 소재의 표준화 실험과 초고압 발효 더덕의 생리활성 기전에 대한 많은 연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
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