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문제 정의
- 12) 또한, 슈잔드린 B는 elastase activity와 MMP-1을 통하여 항노화효과를 입증하였고, 슈잔드린 B의 UV에 관한 항산화력 효과도 입증하였다. 10,11) 이에 본 연구는 오미자에서 추출한 천연 슈잔드린의 항노화 효과를 입증하기 하고자, HDF(Human Dermal Fibroblast, Normal, passage11)을 이용하여 SD 및 SD-C에 대하여 MMP-1 발현 억제 기전을 알아보았다. 본 연구는 UV를 조사하지 않은 상태의 섬유아세포에서 피부세포의 결합조직을 구성하는 성분들 가운데 콜라겐을 분해하는 MMP1에 대한 발현 억제 효과를 나타내었다.
- 10,11) 이에 본 연구는 오미자에서 추출한 천연 슈잔드린의 항노화 효과를 입증하기 하고자, HDF(Human Dermal Fibroblast, Normal, passage11)을 이용하여 SD 및 SD-C에 대하여 MMP-1 발현 억제 기전을 알아보았다. 본 연구는 UV를 조사하지 않은 상태의 섬유아세포에서 피부세포의 결합조직을 구성하는 성분들 가운데 콜라겐을 분해하는 MMP1에 대한 발현 억제 효과를 나타내었다.
- 본 연구는 오미자에서 추출한 Schizandrin(SD-C)와 표준 품 Schizandrin(SD)를 항노화에 관련된 지표인 항산화와 피부 결합조직을 분해하는 MMPs에 미치는 영향을 연구하였다. 사람정상섬유아세포(HDF)에서 UV에 의해 발현이 증가되는 MMPs에서 양성대조군 51.
- 10,11) 하지만 이러한 연구는 오미자의 단일 유효성분인 Schizandrin의 효능은 입증되어 있으나 화장품 소재로 사용하기에는 제한적인 부분이 있다. 이러한 이유로 천연오미자에서 추출한 Schizandrin과 표준품인 Schizandrin의 비교실험을 통하여, 피부노화에 관련된 항산화 효능, MMPs의 활성 저해 효능을 규명하여, 천연 Schizandrin이 기능성 화장품 소재 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 0.05 M Na2CO3buffer에 3 m Mxanthine, 3 m MEDTA, 0.72 mM nitrobluetetrazolium (NBT), 0.15% bovineserumalbumin (BSA)용액과 시료를 각각 첨가하여 혼합한 다음, 25° C에서 10분간 반응하였다.
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Radical 소거 효과 측정 − Free radical의 소거 작용은 각 시료가 상업적으로 판매하는 DPPH radical(Aldrich, USA)에 대한 소거 효과를 평가하는 방법으로 측정하였다.
- 10% FBS가 첨가된 DMEM 10 ml에 부유한 세포용액을 약 50 µl를 취하여 동량의 trypan blue와 혼합한 후 약 50 µl를 취하여 Hemocytometer에 200배의 배율로 세포수를 계수하였다.
- 용매조건에 의한 슈잔드린 추출조건 − 각 용매별로 추출한 오미자 분획에서 Schizandrin(SD-C)의 추출 농도를 비교 하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. D.W, Propanediol, 70% 에탄올 각각의 용매 2 kg에 오미자 600 g을 첨가하고 20 kHZ의 초음파를 이용하여 2시간 동안 20℃에서 추출한 후, Schizandrin(SD)의 함량을 분석하였다.
- MMP-1 발현저해 측정 − 시료는 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0% (v/v)되게 serum이 없는 DMEM 배지에 희석하고, TGF-β(10 ng/mL)와 Vehicle(1,3-BG) 도 세포에 첨가하여 24 시간 경과 후, 정량용 완충액-2, 100 µl를 well에 넣은 다음 배양액 및 표준액 각 100 µl를 넣고 상온에서 2시간 반응시킨다.
- SD의 MMP-1 저해효과는 양성대조군인 TGF-β를 이용하여 결과를 비교하였다.
- Schizandrin에 대한 효능은 UV 조사한 동물피부에 Schizandrin B를 도포하여 항산화력을 입증하였고, 또한 UV 조사한 사람 피부세포에 Schizandrin B 처리하여 피부노화에 관한 효능을 입증하였다.10,11) 하지만 이러한 연구는 오미자의 단일 유효성분인 Schizandrin의 효능은 입증되어 있으나 화장품 소재로 사용하기에는 제한적인 부분이 있다.
- Superoxide Anion Radical 소거능 측정 − 초산화 음이온 라디칼의 소거작용은 각 시료의 xanthine-xanthine oxidase system에 의해 생성된 초산화 음이온 라디칼을 소거하는 효과를 평가하는 방법으로 측정하였다.
- 4)을 이용하여 3회 세척하였다. Trypsin-EDTA (Sigma, U.S.A.)를 T75 culture flask에 3ml 정도 투여하고, 37℃에서 약 1분 동안 배양 시킨 후, 현미경을 이용하여 세포가 플라스크 바닥에서 떨어졌는지를 확인하고 trypsinEDTA를 제거하였다. Trypsin-EDTA를 제거한 T75 culture flask에 약 10 ml의 10% FBS가 첨가된 DMEM를 넣고 전동 피펫을 이용하여 배양배지를 흡입하고 배출하는 것을 반복하여 세포를 플라스크 바닥에서 완전히 떼어내었다.
- 검액 및 표준액 20 µl씩을 가지고 다음의 조건으로 고성능 액체 크로마토그래프법에 따라 시험하여 슈잔드린의 피크면적 AT 및 As를 측정하여 오미자에서 추출한 SD-C 양을 정량하였다.
- 또한 양성 대조군으로 사용하는 TGF-β(10 ng/ml)도 같이 세포 독성을 평가하였다.
- 또한, 음성대조군, 양성대조군(TGF-β), 표준품(SD) 그리고 오미자추출물(SD-C)에 대한 MMP-1 발현억제 평가가 동일한 세포농도에서 평가되었는지를 검증을 하였다.
- 사람 정상 섬유아세포(human normal fibroblast, 이하 HDF)를 5×104cells/well 농도로 48-well plate에 접종한 후, 실험하고자 하는 Schizandrin(SD-C)을 각 각 1 mg/ml (SD. 1 µg/ml 함유), 2 mg/ml (SD. 2 µg/ml 함 유), 5 mg/ml (SD. 5 µg/ml 함유), 10 mg/ml (SD. 10 µg/ml 함유), 20 mg/ml (SD. 20 µg/ml 함유)를 serum이 없는 DMEM 배지(serum free medium)에 희석하고, 표준품 Schizandrin(SD)은 SD-C속에 포함되어 있는 SD과 같은 농도인 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml을 동일한 배지에 희석하여 24시간 배양한 후 MTT assay방법을 이용하여 수행하였다.
- 세포 생존율 측정 − 세포 생존율 측정은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 응용하여 실시하였다.
- 세포독성 − 사람 피부 섬유아세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각의 물질을 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml등으로 처리하고 24시간 후에 MTT assay를 수행하여 세포 생존율에 미치는 영향을 평가하였다.
- 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 초산화 음이온 라디칼 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 3-t-butyl-4-hydroxyanisole (BHA)를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 초산화 음이온 라디칼을 50% 소거하는 농도(SC50)를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.
- 시료를 첨가하지 않은 대조그룹과 비교하여 DPPH radical의 소거활성을 백분율로 나타내었다. 양성 대조그룹으로는 vitamin C를 사용하였으며, 농도별로 처리하여 DPPH radical을 50% 소거하는 농도 (SC50)를 구하여 시료와 활성을 비교하였다.
- 용매에 따른 추출조건 − 초음파 추출조건에서 다양한 용매조건에 따른 Schizandrin(SD-C)의 효과적으로 수득율을 높이기 위해, 오미자를 D.W, Propanediol, 70% EtOH의 용매조건으로 시간대별 슈잔드린(SD-C)을 정량 분석하였다.
- 용매조건에 의한 슈잔드린 추출조건 − 각 용매별로 추출한 오미자 분획에서 Schizandrin(SD-C)의 추출 농도를 비교 하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
- 20 µg/ml 함유)를 serum이 없는 DMEM 배지(serum free medium)에 희석하고, 표준품 Schizandrin(SD)은 SD-C속에 포함되어 있는 SD과 같은 농도인 1 µg/ml, 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml을 동일한 배지에 희석하여 24시간 배양한 후 MTT assay방법을 이용하여 수행하였다. 이때 시료를 만들기 위해 사용한 용매 (1,3 butylene glycol 수용액)를 Vehicle로 설정하고 시료가 가장 많이 들어가는 농도에서의 용매의 양을 Vehicle 농도로 정하여 세포 독성 여부를 확인하는 시험을 병행하였다. 또한 양성 대조군으로 사용하는 TGF-β(10 ng/ml)도 같이 세포 독성을 평가하였다.
- 또한, 음성대조군, 양성대조군(TGF-β), 표준품(SD) 그리고 오미자추출물(SD-C)에 대한 MMP-1 발현억제 평가가 동일한 세포농도에서 평가되었는지를 검증을 하였다. 총 세포 농도 측정을 위한 단백질 정량은 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량하였고, 정량된 단백질양으로 MMP-1의 발현 억제 효력을 보정하였다. 최종적으로 생성되는 MMP-1 합성량을 구하여 SD와 SD-C가 fibroblast에서 MMP-1 발현 억제에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
- 최적조건에서의 슈잔드린 함량 분석 − 각 용매별 분석조 건에서 최적 조건으로 70% 에탄올을 이용한 20 kHZ의 초음파를 이용하여 2시간 동안 20℃에서 추출 한 방법을 선정하였으며, 선정된 방법에 의해서 추출한 후 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10일 경과하는 동안 HPLC(Alliance 2695)를 이용하여 Schizandrin(SD)을 분석하였다.
- 총 세포 농도 측정을 위한 단백질 정량은 BCA protein assay kit를 이용하여 단백질을 정량하였고, 정량된 단백질양으로 MMP-1의 발현 억제 효력을 보정하였다. 최종적으로 생성되는 MMP-1 합성량을 구하여 SD와 SD-C가 fibroblast에서 MMP-1 발현 억제에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
- 항산화작용을 측정하는 활성산소의 소거능 실험으로 DPPH 는 free radical의 안정된 모델로 측정하고 양성대조군으로는 vitamin C를 이용하여 SD-C의 항산화력을 비교하였다. 그 결과, 1, 2, 5, 10, 20 µg/ml에서 22.
대상 데이터
- 세포 − 세포는 연구용으로 제공된 생검 조직에서 일차 배양된 사람의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast)를 사용하였다.
- 실험재료 − 본 실험에 사용된 생약재 오미자(Schizandra fructus(Schizandra chinensis))는 경북 문경에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 자료 분석 및 통계처리 − 모든 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성 검정은 Student's t-test로 실시하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- Xanthine oxidase에 의해 형성되는 superoxide anion의 생성저해 결과는 양성대조군의 BHA를 이용하여 superoxide radical 소거효과를 비교한 결과, SD-C에서 2, 5, 10, 20 µg/ ml에서 17.7%, 29.3%, 55.5%, 62.9%, 89.8%로 8.53 µg/ml 에서 50%소거를 확인하여 superoxide radical 우수한 소거 효과를 나타내었다.
- 그 결과, 1, 2, 5, 10, 20 µg/ml에서 22.3%, 35.5%, 64.7%, 77.8%, 90.1%로 나타내었다.
- 그 결과, TGF-β 10 ng/ml에서 51.5% 의 MMP-1의 활성을 저해하였고, SD-C군의 1, 2, 5, 10 µg/ ml에서 31.9, 36.3, 45.7, 56.6%의 저해효과를 나타내어 유의성 있는 결과를 나타내었다.
- 사람정상섬유아세포(HDF)에서 UV에 의해 발현이 증가되는 MMPs에서 양성대조군 51.5%의 발현저해효과를 나타 냈으며, 10 µg/ml 농도에서 SD-C는 56.6%, SD는 53.6%로 우수한 발현저해 효과를 나타내었다.
- 6%의 저해효과를 나타내어 유의성 있는 결과를 나타내었다. 이로써 SD-C군과 SD 군의 결과에서 유의성이 검증되어, MMP-1의 발현을 효과적으로 억제하여 주름의 생성촉진을 억제함으로써 주름개선의 효력이 있는 것으로 나타내었다.
- 이에 반하여 SD-C는 3.86 µg/ml에서 50%의 소거를 확인하여 항산화력에 우수한 효과가 있는 것으로 나타내었다.
- 이에, 70% 에탄올에서 4시간 가량 초음파 추출하여 10일 간 침지한 조건에서 가장 많은 Schizandrin을 추출할 수 있었다.
- 초음파 추출조건 − 건조된 오미자(수분함량 20% 이하) 600 g에 70% 에탄올 2,000 g에 침지하고, 70% 에탄올 상태에서 20~30 KHz로 4시간 동안 초음파 추출을 한 후, 1day~10day까지 침지하여, 시간경과에 따른 슈잔드린의 추출효율을 HPLC로 정량한 결과, 10일간 침지한 조건에서 가 장 많은 Schizandrin(SD-C)가 분리되었다.
- 추출 효율은 70% EtOH > propanediol > D.W 순이었으며, 70% EtOH 추출 조건에서는 가장 높은 Schizandrin(SD)을 나타내었다.
- 항산화력 실험인 DPPH 에서는 농도 의존적으로 결과를 나타내었으며, SD-C 20 µg/ ml에서 각각 90.1%로 3.86 µg/ml에서 50%의 소거를 확인하였으며, superoxide radical 소거효과에서는 20 µg/ml에서 각각 89.8%로 8.53 µg/ml에서 50%의 소거를 확인하였다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 오미자에서 추출한 에탄올 분획인 오미자추출물Schizandrin(SD-C)와 표준품인 Schizandrin (SD)는 농도의존적으로 항산화 효과와 MMP-1을 효과적으로 저해하여 피부 항노화 기능성 소재로 적극적으로 이용 될 수 있을 것으로 사료된다.
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