오미자 박, schizandrin 및 gomisin A에 의한 RAW264.7 세포주에서 lipopolysaccharide로 유도된 염증 반응의 억제 Effects of Pomace of Schizandra chinensis, Schizandrin, and Gomisin A on LPS-induced Inflammatory Responses in RAW264.7 Cells원문보기
오미자는 전통적인 한약재로서 schizandrin과 gomisin A와 같은 다양한 생리활성물질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 오미자 박의 에탄올 추출물(PSC)과 schizandrin (SZ) 및 gomisin A (GA)에 의한 항염증 활성 및 그들의 작용기전 연구를 수행하였다. 먼저, PSC는 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포생존율에는 영향을 미치지 않고 농도의존적으로 nitric oxide (NO) 생성을 감소시켰다. PSC는 염증유발유전자인 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시켰으나, $TNF-{\alpha}$의 발현에는 영향을 주지 않았다. 또한 오미자 박의 에탄올 추출물은 p38, ERK1/2 및 JNK의 총 단백질의 발현에는 영향을 주지 않으면서, 그들의 인산화를 감소시켰다. 이러한 결과는 PSC가 MAPK 신호를 저해함으로써 염증 반응을 조절할 수 있음을 시사한다. 또한 SZ와 GA도 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 NO 생성을 감소시켰다. SZ은 iNOS 유전자의 발현만을 감소시킨 반면, GA는 iNOS와 COX-2 두 유전자의 발현을 모두 감소시켰다. 종합적으로 이러한 연구결과는 오미자 박 추출물, schizandrin 및 gomisin A에 의해 중재되는 항염증 활성 및 작용기전을 이해하는데 도움을 줄 것이다
오미자는 전통적인 한약재로서 schizandrin과 gomisin A와 같은 다양한 생리활성물질을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 오미자 박의 에탄올 추출물(PSC)과 schizandrin (SZ) 및 gomisin A (GA)에 의한 항염증 활성 및 그들의 작용기전 연구를 수행하였다. 먼저, PSC는 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포생존율에는 영향을 미치지 않고 농도의존적으로 nitric oxide (NO) 생성을 감소시켰다. PSC는 염증유발유전자인 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시켰으나, $TNF-{\alpha}$의 발현에는 영향을 주지 않았다. 또한 오미자 박의 에탄올 추출물은 p38, ERK1/2 및 JNK의 총 단백질의 발현에는 영향을 주지 않으면서, 그들의 인산화를 감소시켰다. 이러한 결과는 PSC가 MAPK 신호를 저해함으로써 염증 반응을 조절할 수 있음을 시사한다. 또한 SZ와 GA도 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 NO 생성을 감소시켰다. SZ은 iNOS 유전자의 발현만을 감소시킨 반면, GA는 iNOS와 COX-2 두 유전자의 발현을 모두 감소시켰다. 종합적으로 이러한 연구결과는 오미자 박 추출물, schizandrin 및 gomisin A에 의해 중재되는 항염증 활성 및 작용기전을 이해하는데 도움을 줄 것이다
Schizandra chinensis has been used as a traditional Chinese medicine and is known to have various bioactive components, including schizandrin and gomisin A. In the current study, we investigated the anti-inflammatory activities and their working mechanisms of ethanol extracts of pomace of Schizandra...
Schizandra chinensis has been used as a traditional Chinese medicine and is known to have various bioactive components, including schizandrin and gomisin A. In the current study, we investigated the anti-inflammatory activities and their working mechanisms of ethanol extracts of pomace of Schizandra chinensis (PSC), schizandrin (SZ), and gomisin A (GA). First, we analyzed the effects of PSC on nitric oxide (NO) production and cell viabilities in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. The results indicated that PSC dramatically reduced NO production in LPS-activated RAW264.7 cells in a dose-dependent manner without affecting cell viabilities. PSC also decreased the expression of pro-inflammatory genes iNOS and COX-2, whereas the expression of TNF-${\alpha}$ was not affected by PSC. In addition, PSC inhibited phosphorylation of p38, ERK1/2, and JNK but did not change the expression of their total protein. The results indicate that PSC can regulate LPS-induced inflammatory responses by suppressing MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling. We also analyzed the effects of SZ and GA on NO production and cell viabilities in RAW264.7 cells. The results showed that SZ and GA also decreased NO production in a dose-dependent manner in LPS-activated RAW 264.7 cells without affecting cell viabilities. SZ reduced the expression of iNOS, whereas GA downregulated iNOS and COX-2. Overall, these findings clarify the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects mediated by PSC, SZ, and GA.
Schizandra chinensis has been used as a traditional Chinese medicine and is known to have various bioactive components, including schizandrin and gomisin A. In the current study, we investigated the anti-inflammatory activities and their working mechanisms of ethanol extracts of pomace of Schizandra chinensis (PSC), schizandrin (SZ), and gomisin A (GA). First, we analyzed the effects of PSC on nitric oxide (NO) production and cell viabilities in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. The results indicated that PSC dramatically reduced NO production in LPS-activated RAW264.7 cells in a dose-dependent manner without affecting cell viabilities. PSC also decreased the expression of pro-inflammatory genes iNOS and COX-2, whereas the expression of TNF-${\alpha}$ was not affected by PSC. In addition, PSC inhibited phosphorylation of p38, ERK1/2, and JNK but did not change the expression of their total protein. The results indicate that PSC can regulate LPS-induced inflammatory responses by suppressing MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling. We also analyzed the effects of SZ and GA on NO production and cell viabilities in RAW264.7 cells. The results showed that SZ and GA also decreased NO production in a dose-dependent manner in LPS-activated RAW 264.7 cells without affecting cell viabilities. SZ reduced the expression of iNOS, whereas GA downregulated iNOS and COX-2. Overall, these findings clarify the molecular mechanisms of the anti-inflammatory effects mediated by PSC, SZ, and GA.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 오미자 박 추출물과 함께 오미자 유래의 순수물질인 schizandrin, gomisin A에 의한 항염증 활성과 작용기전을 연구하고자 하였다.
따라서, 본 연구에서는 오미자 박 에탄올 추출물과 오미자 유래 생리활성물질인 schizandrin 및 gomisin A에 의한 LPS 로 염증 유도된 마우스 대식세포 RAW264.7 세포에서 항염증 활성 및 그 작용기전에 대해 연구하였다.
오미자 박 에탄올 추출물(PSC, Pomace of Schizandra chi- nensis)이 LPS로 활성화된 RAW264.7 세포의 nitric oxide (NO) 생산과 세포생존에 미치는 영향을 연구하였다.
제안 방법
Reverse-transcription polymerase chain reaction Total RNA 추출은 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하였으며 제조사의 매뉴얼을 따라 수행하였다.
본 연구에서는 오미자 유래의 생리활 성물질인 SZ과 GA가 LPS로 활성화된 RAW264.7 세포주에서 NO 생산 및 세포생존율에 미치는 영향을 확인하였다.
추가 연구는 PSC의 처리 농도를 0.25와 0.5 mg/ml 두 가지 농도로 선정하여 진행하였다.
96 well에 2x105 개의 RAW264.7 세포를 접종하여 각 시료를 농도 별로 처리한 후 16시간 동안 반응시켰으며, 세포 배양액 100 μl 에 MTS용액 20μl를 첨가하였다.
LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포주에 0.5 mM의 SZ과 0.2 mM의 GA를 처리한 후 RT-PCR 분석을 실시하였다.
LPS로 활성화된 RAW264.7 세포주에 0.25 및 0.5 mg/ml의 PSC를 처리한 후 염증 유전자 발현을 분석하였다.
PCR product는 1.5% agarose gel에서 전 기영동 하고 ethidium bromide (EtBr, Bioneer, Korea)로 염색하여 gel image analysis system (Corebio, Korea)을 이용하여 사진 촬영하였다.
PCR은 합성된 cDNA를 주형으로 하였으며 유전자 특이적인 oligo primer를 이용하였다.
PCR은 TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)을 이용하여 수행하였으며, PCR 반응은 95℃에서 5 분간 denaturation하고 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 cycle을 25회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분 간 extension하였다.
PSC가 MAPK 경로를 통해 염증 반응을 조절하는지 확인하기 위해 MAPK 발현 분석을 수행하였다.
PSC를 0.25와 0.5 mg/ml의 농도로 RAW264.7에 4시간 동안 처리한 후 LPS로 15 분 동안 자극하여 p38, ERK1/ 2와 JNK 인산화의 변화를 측정하였다.
PSC에 의한 NO 생성 억제 기전을 연구하기 위하여 pro-inflammatory 유전자인 iNOS, COX-2 및 TNF-alpha의 유 전자 발현 분석을 실시하였다.
RAW264.7 세포주로부터 추출한 to- tal RNA 2 μg을 주형으로 PrimeScriptTM RT-PCR kit (TaKaRa, Japan)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 cDNA를 합성하였다.
세포 접종 18시간 후 오미자 박 추출물, schizandrin 및 go-misin A를 serum free media에 혼합하여 4시간 동안 처리한 후, LPS를 1.0 μg/ml의 농도로 15분 동안 처리하였다.
오미자 박 에탄올 추출물, schizandrin 및 gomisin A가 LPS 로 유도된 대식세포 RAW264.7 세포주의 nitric oxide 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여 nitric oxide 생성 분석을 실시 하였다.
오미자 박 에탄올 추출물, schizandrin 및 gomisin A에 의한 세포독성을 측정하기 위해 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit를 이용하였다.
오미자 박 추출물 조제를 위해 오미자 박 15 kg에 20배의 95% ethanol을 가하여 상온에서 24시간 추출하였으며, 상기 추출을 3회 반복하였다.
오미자 유래 순수물질인 SZ과 GA에 의한 항염증 활성 기전을 이해하기 위하여 염증유발유전자인 iNOS, COX-2 및 TNF-alpha의 유전자 발현 분석을 실시하였다.
대상 데이터
본 실험에서는 p38, ERK1/2, JNK, p-p38, p-ERK1/2 및 p-JNK, ACTIN 1차 항체를 사용하였으며, 2차 항체는 HRP- conjugated rabbit antibody 및 HRP-conjugated mouse antibody를 사용하였다.
순수물질인 schizandrin과 gomisin A는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
ACTIN과 2차 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였고, 그 외의 1차 항체 는 Cell signaling사로 부터 구입하여 사용하였다.
PCR에 사용된 primer는 Table 1과 같고, internal control 유전 자로 GAPDH를 사용하였으며, primer는 Bioneer 사(Korea)와 Macrogen 사(Korea)에서 구입하였다.
마우스 대식세포 RAW264.7 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Fredrick, MD, USA)에서 구입하였다.
본 실험의 오미자 박은 2016년 문경 농가에서 수확한 오미자를 오미자 가공 공장에서 착즙기를 이용하여 착즙한 직후의 박(수분함량 60.5±3.3%)으로, 4℃의 냉장조건에서 실험실로 옮겨 사용하였다.
데이터처리
NO 생성 분석은 독립적인 5개의 well에서 수행되었으며, 통계 분석은 Sigma plot을 이용하여 mean ± SD 값으로 나타내었다.
모든 실험은 최소 3회 이상 실시하였으며, 실험결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었고, 각 실험결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student’s t-test에 의해 판정하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
단백질의 정량은 Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 방법을 이용하였다.
성능/효과
그 결과, SZ를 처리한 경우는 iNOS 유전자의 발현만 감소된 반면, GA를 처리한 경우는 iNOS와 COX-2 유전자 모두 발현이 감소됨을 확인하였 다(Fig. 5).
따라서, PSC는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 세포 생존율에는 영향을 미치지 않으면서 NO의 생성을 처리한 PSC 농 도의존적으로 저해함을 확인하였다.
이러한 결과는 PSC가 iNOS와 COX-2와 같은 pro-inflammatory 유전자의 발현을 억제함으로써 항염증 활성을 나타냄을 시사한다.
이러한 결과를 통해 PSC가 MAPK 신호전달 경로를 억제함으로써, LPS로 유도된 염증반응을 억제한다는 것을 확인하였다.
LPS로 활성화된 RAW264.7 세포주 에 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 PSC 시료를 각각 처리한 결과, PSC에 의해 농도의존적으로 NO의 생성이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 1A).
Western blot 분석 결과 0.25 mg/ml 농도의 PSC 처리군에서 p38, ERK 및 JNK의 총 단백질의 발현 변화 없이 인산화가 모두 억제되었으며, 0.5 mg/ml 처리군에서도 MAPK 인산화 수준이 감소된 것을 확인하였다(Fig. 3).
종합적으로, 오미자 박 에탄올 추출물(PSC), 오미자 유래 순수물질인 schizandrin (SZ)과 gomisin A (GA)는 LPS로 염증이 유도된 RAW264.7 세포에서 세포 생존율에 영향을 주지 않으면서 다양한 기전을 통해 항염증 활성을 나타냄을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
오미자 및 오미자 추출액을 활용한 다양한 가공식품이 개발되고 있지만 별도의 활용 없이 대부분 폐기되고 있는 가공부산물은 무엇인가?
최근 식품의 품질 향상을 위해 오미자 및 오미자 추출액을 활용한 다양한 가공식품이 개발되고 있다[8, 15]. 하지만 활용도가 높은 과즙에 비해 착즙 후 다량으로 생기는 가공부산물인 오미자 박(찌꺼기, pomace)은 별도의 활용 없이 대부분 폐기되고 있는 실정이다. 오미자박 에탄올 추출물의 항산화, 항균 및 혈액응고 저해활성이 오미자씨와 열매보다 더 우수하다고 보고된 바 있다[6].
오미자란 무엇인가?
오미자(Schizandra chinensis Baillon)는 목련과의 넝굴성 식물인 오미자나무의 열매로, 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛의 5가지 맛이 나며 약학적 활성이 뛰어나서 약용식물로 이용되고 있다[6]. 2007년 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 보고에 의하면, 오미자의 주요 구성성분은 di- bennzo[a,c]cyclooctadiene 골격을 가진 약 30 종류의 리그난이며, 대표적인 생리활성물질로는 schizandrin과 gomisin A 및 deoxyschizandrin 등이 있다[20].
2007년 세계보건기구의 보고에 의하면 오미자의 주요 구성성분은 무엇인가?
오미자(Schizandra chinensis Baillon)는 목련과의 넝굴성 식물인 오미자나무의 열매로, 단맛, 짠맛, 신맛, 쓴맛, 매운맛의 5가지 맛이 나며 약학적 활성이 뛰어나서 약용식물로 이용되고 있다[6]. 2007년 세계보건기구(World Health Organization, WHO)의 보고에 의하면, 오미자의 주요 구성성분은 di- bennzo[a,c]cyclooctadiene 골격을 가진 약 30 종류의 리그난이며, 대표적인 생리활성물질로는 schizandrin과 gomisin A 및 deoxyschizandrin 등이 있다[20]. 최근 오미자 및 오미자 추출물의 다양한 약리작용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 항산화, 항균 및 항혈전 활성[6], 이상지질혈증과 항비만 효과[5, 14], 간 보호 효과[1], 항염증 활성[4, 13] 그리고 항암 활성[11]에 대한 연구가 보고된 바 있다.
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