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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 진범 추출물의 항산화 및 항당뇨 효과 연구를 통하여 인류건강과 관련된 의약품, 식품 및 화장품 등 여러 분야에서 천연항산화제 및 항당뇨 기능 소재로의 활용 가능성을 제시하고자 본 실험을 수행하였다.
- 이에 따라 항산화 활성을 나타낸 진범 추출물의 α-glucosidase의 저해 활성을 탐색하여 혈당 조절은 물론 이차적 산화 스트레스를 막을 수 있는 기전을 찾고자 하였다.
제안 방법
- β-carotene-linoleate model system을 이용하여 대조군에 대한 시료 처리군의 흡광도 비로 antioxidnat protection factor(PF) 값을 측정하였다.
- DPPH radical에 대한 소거활성은 Blois의 방법[5]을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1 ml에 60 μM DPPH 3 ml를 넣고 vortex한 후 15분 동안 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 추출은 열수 및 에탄올 추출을 하였다. 열수 추출물의 경우 시료 100 g에 증류수 10배 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우 70% 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 시료의 추출은 열수 및 에탄올 추출을 하였다. 열수 추출물의 경우 시료 100 g에 증류수 10배 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우 70% 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉동실에 보관하면서 본 실험의 시료에 사용하였다.
- 원심분리 한 액을 실온에서 10분간 방치 한 후 상등액을 취해 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS값은 (흡광도 수치×0.0154)로 1 ml 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxy propane (TEP)의 μM 로 표시하였다.
- 이때 생성된 ρ-nitrophenol (PNP)은 400 nm에서 spectro- photometer를 이용하여 측정하였으며, 그 양은 표준물질 ρ-nitrophenol로부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다.
- 유리 라디칼은 생물학적 손상의 주요 요인으로 잘 알려져 있는데 phenol성 화합물이 단백질, 효소 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 가져, 유리 라디칼의 생성을 억제하는 항산화 활성 등을 나타낸다고 한다[5]. 진범 추출물에 함유된 phenol성 화합물의 전자공여 작용능력을 측정 하였다. 그 결과 Fig.
이론/모형
- α-amylase 저해 활성 측정은 agar diffusion 방법[15]를 이용하여 측정하였다.
- α-glucosidase 저해 활성을 측정하기 위하여 Tibbot 등의 방법[24]에 따라 반응 혼합액은 50 mM sodium succinate buffer (pH 4.2)에 ρ-nitrophenol-α-D-glucopyranoside (PNPG)를 용해시켜 1 mg/ml의 농도로 기질을 만들었다.
- ABTS [2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical cation decolorization의 측정은 Pellegrini 등[21]의 방법에 의해 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS 5 ml와 140 mM K2S2O8 88 μl를 섞어 어두운 곳에 14∼16시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 약 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 대조군의 흡광도 값이 0.
- Kim의 방법[17]에 따라 2 mg의 β-carotene을 10 ml의 chloroform에 녹인 용액에 linoleic acid 0.357 ml 및 tween 40 2.143 ml를 첨가한 후 40℃에서 감압 농축하여 chloroform을 증류시킨 후 3차 증류수 75 ml를 첨가하여 진탕한 emulsion 용액 2.5 ml에 추출물 0.3 ml를 가하여 혼합하고 55℃에서 105분간 암실에서 반응시킨 다음 492 nm에서 흡광도를 측정하여 다음의 식으로 PF (antioxidant protection factor) 값을 계산하였다.
- TBARS는 Burge와 Aust의 방법[6]에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.
성능/효과
- 진범 추출물에 함유된 phenol성 화합물의 전자공여 작용능력을 측정 하였다. 그 결과 Fig. 1과 같이 진범 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 상대적으로 높은 전자공여능을 나타내었으며, 전자공여능은 진범 추출물의 처리 농도에 따라 농도 의존적으로 높은 항산화력을 나타내었다. 물 추출물에서는 100 μg/ml, 에탄올 추출물에서는 50 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 50% 이상의 전자공여능을 나타내어 큰방가지똥 메탄올 추출물의 전자공여능이 405.
- 그 결과 Fig. 3과 같이 물과 에탄올 추출물 모두 5∼100 μg/ml 첨가군에서는 대조군의 흡광도와 큰 차이가 없는 1.0 PF값을 나타내었으나, 500 μg/ml 이상의 농도로 첨가하였을 때 물 추출물에서 1.27 PF, 1.33 PF값을, 에탄올 추출물에서는 1.40 PF, 1.49 PF로 첨가 농도에 따라 PF값이 증가하는 것으로 나타났다.
- 그 결과 Fig. 6과 같이 진범 물 추출물에서는 1,000 μg/ml로 처리하였을 때 61.2%를 나타내었으며, 에탄올 추출물에서는 100∼1,000 μg/ml의 농도에서 62.3%, 90.6%, 93.7%의 α-glucosidase 저해 활성을 나타내었다.
- 이와 같은 ABTS+ 라디칼 탈색반응에 따른 흡광도 값으로 항산화력을 알 수 있으며, 이 반응은 단시간에 일어나 실험시간이 짧고 소수성과 친수성 모두에 적용 가능하여 DPPH와 달리 pH 변화에 민감하게 작용하지 않는 장점을 가지고 있어 항산화 활성 측정에 많이 이용된다[21]. 진범 추출물의 ABTS free radical 소거활성 역시 전자공여능 측정 결과와 같이 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 높은 항산화력을 나타내었고, 모든 추출물에서 농도 의존적으로 높은 항산화 활성을 나타내었다(Fig. 2). 대봉감 연시 과즙과 와인의 ABTS+˙ 라디칼 소거활성이 처리 농도(10, 20, 40, 100 및 1,000 μg/ml)가 증가함에 따라 이에 상응하여 활성 역시 증가한다고 보고한 Joo [13] 등의 결과와 유사하였다.
- 진범 추출물의 MA생성 억제활성을 알아본 결과 Fig. 4와 같이 대조군 0.48 μM에 비해 추출물 첨가농도 50 μg/ml 까지는 비슷한 TBARs값을 나타내었으나, 100 μg/ml 농도 처리군부터 농도 의존적으로 대조군에 비해 2배 이상 낮은 TBARs값을 나타내었으며, 물 추출물 보다 에탄올 추출물에서 더 낮은 TBARs값을 나타내었다.
- 진범 추출물이 가지는 α-amylase 저해 활성을 측정한 결과 Fig. 5와 같이 물 추출물에서는 500 μg/ml 이상의 농도로 처리 하였을 때 60% 이상의 저해 활성을 나타내었으며, 물 추출물 1,000 μg/ml, 에탄올 추출물 100∼1,000 μg/ml로 처리 하였을 때 90% 이상의 높은 저해 활성을 나타내었다.
후속연구
- Phenol 계통 물질이 α-amylase와 α-glucosidase의 활성을 저해한다는 Lee [18] 등의 보고와 같이 진범 추출물 내의 phenol성 물질들 또한 위와 같은 저해 활성을 나타낸 것으로 판단되며 진범 추출물을 이용하여 항산화 제제 및 α-amylase와 α-glucosidase 억제제를 개발 한다면 시판되고 있는 acarbose와 같은 α-glucosidase 저해제가 가지는 부작용을 해결 할 수 있을 것으로 생각된다.
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