[논문]B16F10 멜라노마세포에서 과기음가미방의 멜라닌 생성 촉진 효과

문나랑; 김세윤; 이진혁; 이정복; 박선민

doi:10.6116/kjh.2013.28.3.69.

B16F10 멜라노마세포에서 과기음가미방의 멜라닌 생성 촉진 효과
Stimulating effect of modified Goa-Gi-Um herbal remedy on melanogenesis in B16F10 melanoma cells 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.28 no.3, 2013년, pp.69 - 74

문나랑 (호서대학교 식품영양학과) , 김세윤 (우보한의원) , 이진혁 (우보한의원) , 이정복 (소니메디) , 박선민 (호서대학교 식품영양학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Since hypopigmentation is known to increase the risk of skin cancer, melanogenesis in the skin needs to be regulated. Here, we evaluated the melanogenesis stimulatory effects of a modified Goagium herbal remedy (HR) and HR+ox bile (Bos taurus domesticus) extract (OBE) to address hypopigmentation disorders. Methods : B16F10 melanoma cells were treated with different dosages of HR and HR+OBE for 24 to 48 h after 1 h of 10 nM ${\alpha}$-melanocyte stimulating hormone (${\alpha}$-MSH). After the treatment, cell viability, tyrosinase activity, melanin synthesis and the expression of genes related to melanin synthesis were measured and the regulation of the ${\alpha}$-MSH signalling through cAMP responding element binding protein (CREB) was determined. Results : HR and HR+OBE with the ranges of $15{\sim}100{\mu}g/mL$ did not affect cell viability in melanoma cells. The 1 h treatment of HR+OBE (50 and $100{\mu}g/mL$) potentiated the phosphorylation of CREB by enhancing ${\alpha}$-MSH signaling and its 24 h treatment increased CREB expression. Consistent with CREB potentiation, their treatment for 24 h, the expression of microphthalmia-associated transcription factor (MIFT), tyrosinase, tyrosinase related protein (TRP)-1 and TRP-2 were increased in realtime PCR. Ultimately, the 48 h treatment of HR+OBE (50 and $100{\mu}g/mL$) increased tyrosniase activity and melanin contents in the melanoma cells in comparison to the control. Conclusions : HR+OBE (50 and $100{\mu}g/mL$) increases melanin synthesis in B16F10 melanoma cells via the stimulation of tyrosinase activity and expression of MIFT, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2. HR+OBE can be used as the a possible treatment for hypopigmentation of the skin.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그런데 이 두 가지 경로 중 특히 α-MSH --> cAMP --> PKA 과정이 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는데, cAMP의 증가는 cAMP-responsive element binding protein (CREB) 인산화를 촉진시키고 이것이 전사인자인 MITF의 발현을 증가시키고, 이것은 tyrosinase의 활성을 향상시키고, tyrosinase mRNA 발현을 증가시킨다는 보고들이 있다⁹⁾. 그러므로 본 연구에서는 임상적으로 백반증 환자들에서 멜라닌 생성을 증가시켰던 한약재의 효과와 그 기전을 조사하기 위해서 B16F10 melanoma cell에 그 한약재를 처리하였을 때 멜라닌 생성 정도와 그 기전을 조사하였다.
그러나 아직까지 멜라닌 합성을 촉진시키는 것에 대한 연구가 충분히 수행되지 않았다. 본 연구는 임상적으로 백반증을 가진 환자에서 멜라닌 합성이 촉진시키는 결과를 나타낸 HR과 HR+OBE를 멜라노마세포에 처리하였을 때 멜라닌 생성에 대한 효과와 그 기전을 연구하였다. 멜라노마세포에서 HR+OBE을 처리하였을 때 tyrosinase의 활성을 증가시켜 멜라닌 합성을 증가시켰으며 그 기전은 TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가시켜 tyrosinase을 활성을 증가시킨 것과 관련이 있었다.
본 연구에서는 임상적으로 백반증에 효과가 있는 것으로 보여 준 한약처방을 B16F10 melanoma cell에 처리하였을 때 α-MSH를 활성화시켜 멜라닌 생성을 촉진시키는 효과와 그 기전을 규명하였으며 다음과 같은 결론을 확인하였다.

제안 방법

24 시간이 지난 뒤 10 % FBS가 첨가되지 않고 5 % BSA가 첨가된 low free serum media에 α-MSH를 10 nM이 되도록 1 시간 동안 처리한 뒤 약물을 농도를 비타민 C는 50 ppm, HR와 HR+OBE를 각각 15, 50, 100 µg/mL로 분주해 1과 24 시간 동안 배양하였다.
24 시간이 지난 뒤 10 % FBS가 첨가되지 않고 5 % BSA가 첨가된 low glucose free-serum DMEM (Invitrogen)에 α-MSH를 최종 농도가 10 nM이 되도록 1 시간 동안 처리한 뒤 약물을 농도를 비타민 C는 50 ppm, HR와HR+OBE를 각각 15, 50, 100 µg/mL로 분주해 48 시간 동안 배양하였다.
24 시간이 지난 뒤 10 % FBS가 첨가되지 않고 5 % bovine serum albumin (Sigma, St Louis, USA)가 첨가된 low glucose free-serum media에 10 nM α-MSH (Sigma)를 1 시간 동안 처리한 뒤 비타민 C는 50 ppm, HR와HR+OBE를 각각 15, 50, 100 µg/mL로 처리하여 24 시간동안 배양하였다.
24 시간이 지난 뒤 5 % BSA가 첨가된 low glucose free-serum DMEM에 α-MSH를 10 nM이 되도록 1 시간 동안 처리한 뒤 약물을 농도를 비타민 C는 50 ppm, HR와 HR+OBE를 각각15, 50, 100 µg/mL으로 분주해 24 시간 동안 배양하였다.
washing buffer로 세척한 후 phospho-CREB과 CREB의 1 차 항체를 처리하여 4 ℃에서 overnight 반응시켜준 뒤 TBST로 washing하고 2차 항체를 처리하여 실온에서 1시간동안 반응시켜주었다. washing buffer로 세척한 후 immum-star^TM WesternC^TM Kit (Bio-Rad)을 이용하여 발광시켜 X-ray film을 통해 발광정도를 측정하였다.
과기음처방을 바탕으로 임상연구에서 백반증 완화에 효과가 있는 한약재를 가미하여 과기음가미방 (HR)을 조제하였으며 Table 1에 보여 준 것과 같다. HR에 포함되는 한약재들을 (광명당제약, 울산, 한국) Table 1에 주어진 비율로 1 kg을 혼합하여 초음파병합추출기 (SM35EP, 소니메디, 원주, 한국)에 넣고 5 L의 물을 넣은 후, 70 ^oC에서 2시간 추출하고 추출액을 Whatman No.
그러므로 본 연구에서는 멜라노마세포의 멜라닌 생성을 증가시키는 지 여부를 조사할 때 HR와 HR+OBE를 독성을 나타내지 않는 농도인 15, 50, 100 µg/mL로 사용하였다.
멜라노마세포에 10 nM α-MSH를 1 시간 동안 미리 처리하고, 15, 50 그리고 100 µg/mL의 HR와 HR+OBE를 24와 48 시간 동안 처리하여 배양하였을 때 멜라닌 생성에 관여하는 유전자인 tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 발현을 조사하였다.
멜라노마세포에서 1 시간 동안 α-MSH를 처리하고 50 µg/mL의 HR와 HR+OBE를 1 시간 동안 처리한 후와 24시간 동안 처리한 후에 CREB의 발현과 인산화를 조사하였다.
건조 후 pellet을 RNA free water (Invitrogen)를 넣어 55 ℃에 5 분 동안 incubation하고 -70 ℃에 보관하였다. 얻어진 total RNA는 100 배 희석하여 흡광도 260 nm와 280 nm에서 측정하여 순도와 양을 확인하였다. total RNA로부터 cDNA synthesis는 SuperScript^TMⅢ First-Strand (Invitrogen)을 이용하여 합성하였다.
2 %)을 얻어 시료로 사용하였다. 연구진들의 예비 임상연구에서 과기음가미방 자체도 효과가 있지만 HR와 OBE를 10:1로 혼합하였을 때 멜라닌 생성이 효과적이어서 이 연구에서는 두 가지 시료인 HR와 HR+OBE (10:1)의 멜라닌 생성에 대한 효과를 조사하였다.

대상 데이터

B16F10 멜라노마세포 (melanoma cellline)은 10 % fetal bovine serum (FBS, Invitrogen, Grand Island, USA)와 1 % penicillin (Invitrogen), 0.5 % glutamax (Invitrogen)가 첨가된 Dulbecco`s Modified Eagle Medium High Glucose (High DMEM, Invitrogen)을 배양액으로 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 메디아는 2~3 일에 한 번씩 바꾸었다.
과기음처방을 바탕으로 임상연구에서 백반증 완화에 효과가 있는 한약재를 가미하여 과기음가미방 (HR)을 조제하였으며 Table 1에 보여 준 것과 같다. HR에 포함되는 한약재들을 (광명당제약, 울산, 한국) Table 1에 주어진 비율로 1 kg을 혼합하여 초음파병합추출기 (SM35EP, 소니메디, 원주, 한국)에 넣고 5 L의 물을 넣은 후, 70 ^oC에서 2시간 추출하고 추출액을 Whatman No. 2 여지로 여과하고 동결 건조하여 120 g (수율: 12 %)을 얻어 시료로 사용하였다. 또한, 동물성 한약재인 우담즙 (ox bile extract; Bovis Fel Sucus, OBE; 광명당제약) 5 kg을 초음파병합추출기 (SM35EP, 소니메디)에 넣고 2 시간 추출한 추출액을 Whatman No.
2 여지로 여과하고 동결 건조하여 120 g (수율: 12 %)을 얻어 시료로 사용하였다. 또한, 동물성 한약재인 우담즙 (ox bile extract; Bovis Fel Sucus, OBE; 광명당제약) 5 kg을 초음파병합추출기 (SM35EP, 소니메디)에 넣고 2 시간 추출한 추출액을 Whatman No. 2 여지로 여과하고 동결 건조하여 310 g (수율: 6.2 %)을 얻어 시료로 사용하였다. 연구진들의 예비 임상연구에서 과기음가미방 자체도 효과가 있지만 HR와 OBE를 10:1로 혼합하였을 때 멜라닌 생성이 효과적이어서 이 연구에서는 두 가지 시료인 HR와 HR+OBE (10:1)의 멜라닌 생성에 대한 효과를 조사하였다.

이론/모형

Cells were treated with 0, 15, 50, and 100 µg/mL of HR and HR+OBE and ascorbic acid for 28 and 48 h. Cell viability was measured by MTT assay. Values were represented as the percentage of cell viability in the control group (vehicle treatment).
HR와 HR+OBE이 세포 독성을 일으키는 지를 MTT 방법으로 조사하였다. 멜라노마세포에 HR와 HR+OBE를 15, 50, 100 µg/mL의 농도로 24 h과 48 h 동안 처리하였을 때 대조군에 비해 세포 독성을 일으키지 않았다 (Fig.

성능/효과

1. B16F10 멜라노마세포에서 HR+OBE (50과 100 µg/mL)는 α-MSH의 작용을 향상시켜 CREB의 인산화를 증가시키고 이것이 MIFT의 발현을 증가시켜 tyrosinase의 발현을 증가시켰을 뿐 아니라 tyrosinase의 활성을 향상시켜 멜라닌 합성을 증가시켰다.
100 µg/mL HR+OBE을 처리하였을 때는 tyrosinase활성이 오히려 감소하는 경향을 나타내었는데 이것은 tyrosinase의 함량이 증가하여 시간이 지나면서 활성은 감소한 것으로 사료된다.
HR와 HR+OBE를 24 시간 처리하였을 때는 대조군에 비해 HR와 HR+OBE가 농도 의존적으로 tyrosinase, TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가하였다.
멜라노마세포에서 HR+OBE을 처리하였을 때 tyrosinase의 활성을 증가시켜 멜라닌 합성을 증가시켰으며 그 기전은 TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가시켜 tyrosinase을 활성을 증가시킨 것과 관련이 있었다. 결과적으로 HR+OBE은 멜라닌 합성을 증가시키는 한약처방으로 사용할 수 있겠다.
일부 연구에서는 멜라닌 합성 정도는 tyrosinase의 발현과 활성에 의해서 조절되지만, TRP-1과 TRP-2의 발현과는 관련이 없다는 보고도 있지만^11,19), 본 연구처럼 멜라닌의 합성은 TRP-1과 TRP-2의 발현과 관련이 있다는 연구도 있다²⁰⁾. 그러므로 tyrosinase의 발현이나 활성이 높더라도 TRP-1이나 TRP-2가 없으면 멜라노마세포에 존재하는 tyrosinase가 불안정하고 세포 성장이 감소할 수 있다는 것을 보여주었다. 본 연구에서 멜라노마세포에서 HR+OBE의 처리는 tyrosinase의 발현을 증가시켰을 뿐 아니라 TRP-1의 발현을 증가시켰고 이것이 멜라닌 합성에 영향을 준 것으로 보여진다.
멜라노마세포에 10 nM α-MSH를 1시간 동안 미리 처리하고, 15, 50 그리고 100 µg/mL의 HR와 HR+OBE를 48시간 동안 처리하여 배양하였을 때 tyrosinase 활성은 비타민 C (50 ppm)는 대조군에 비해 약 17 % 정도 감소하였다(Fig. 2A).
본 연구는 임상적으로 백반증을 가진 환자에서 멜라닌 합성이 촉진시키는 결과를 나타낸 HR과 HR+OBE를 멜라노마세포에 처리하였을 때 멜라닌 생성에 대한 효과와 그 기전을 연구하였다. 멜라노마세포에서 HR+OBE을 처리하였을 때 tyrosinase의 활성을 증가시켜 멜라닌 합성을 증가시켰으며 그 기전은 TRP-1과 TRP-2의 발현을 증가시켜 tyrosinase을 활성을 증가시킨 것과 관련이 있었다. 결과적으로 HR+OBE은 멜라닌 합성을 증가시키는 한약처방으로 사용할 수 있겠다.
반면에 본 연구에서는 α-MSH를 처리한 후 24 시간 동안 HR+OBE를 처리하였을 때 CREB 인산화를 향상시키고 MIFT의 발현이 현저하게 증가하였고, 이것이 tyrosinase 발현을 증가시켰다.
그러므로 tyrosinase의 발현이나 활성이 높더라도 TRP-1이나 TRP-2가 없으면 멜라노마세포에 존재하는 tyrosinase가 불안정하고 세포 성장이 감소할 수 있다는 것을 보여주었다. 본 연구에서 멜라노마세포에서 HR+OBE의 처리는 tyrosinase의 발현을 증가시켰을 뿐 아니라 TRP-1의 발현을 증가시켰고 이것이 멜라닌 합성에 영향을 준 것으로 보여진다.
3). 이것은 궁극적으로 HR+OBE이 CREB을 활성화시킴으로 멜라노마 세포에서 멜라닌 합성을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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