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문제 정의
- 본 연구에서는 상품가치가 없어 약용으로 쓰이지 않는 더덕하품인 초리를 사용하여 향장 활성의 증진에 대한 연구를 하였다. 더덕의 향장 활성 물질의 용출을 증가시키기 위한 방법으로 초고압, 증숙, 발효 등이 알려져 있다 (Park et al.
- 증숙 가공 공정 및 초고압 공증은 구근류와 같이 단단한 천연물의 추출 시, 활성성분의 추출 수율을 극대화시키고자 많이 사용되는 방법으로, 인삼 및 다양한 천연물의 전처리 및 추출공정으로 많이 이용되고 있다. 그러나 더덕에 적용한 경우는 미미하므로 이러한 공정을 통하여 향장활성의 증진을 확인하고, 향후 화장품용 소재로서의 사용가능성을 확인하고자 본 실험을 실시하였다.
- 피부에서 일어나는 멜라닌 색소의 분비는 피부 층에 활성산소가 다량 존재 시, 자외선으로 인해 발생하는 활성산소의 생성의 예방하기 위하여 일어나기도 한다(Park, 1997). 본 연구진은 이러한 기존 연구결과를 통하여 항산화활성의 증진이 피부 미백에 상당한 영향을 미칠 것이라 사료되어 다음 실험을 진행하여 각 공정별 더덕추출물의 미백활성을 측정함으로서 더덕의 또 다른 향장활성 증진을 확인하고자 하였다.
- , 2006). 이러한 멜라닌 생성단계의 필수 효소인 tyrosinase의 저해 증진을 통해 초고압 및 증숙더덕 추출물의 미백활성 증진을 확인하였으며, 이에 대한 추가적 실험을 위해 멜라닌 합성 저해 활성을 통한 미백활성 증가에 대해 확인해 보았다.
제안 방법
- CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1.5 × 10⁴cells/well 농도로 접종한 후, 80% 정도의 배양시점에서 각 well에 200 ㎕씩 시료를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖의 농도로 투여하고 CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- 사용된 더덕은 상품가치가 없는 초리 (저가 더덕)를 사용하였으며, 깨끗하게 세정한후 실온 건조된 더덕을 세절하여 시료를 제조하였다. 마하스팀기 (Daechang stainless. Seoul, Korea)를 사용하여 50, 60, 90℃로 2시간씩 단계별 증숙가공을 실시하고, 추가로 100℃로 3시간 증숙가공하였다. 증숙가공을 거친 더덕은 다시 12시간 건조 시킨 후 위와 같은 증숙가공 공정을 5번 반복 실시하였다.
- 초고압 공정은 더덕 100 g을 비닐 팩에 70% 에탄올 200 ㎖와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출장치 (Ilshin Autoclave, Korea)를 이용하여 3,000 bar 압력으로 25℃에서 30분간 초고압 추출을 실행하였다.
- 수직 환류냉각기가 부착된 추출 flask를 사용하여 일반 생더덕과 증숙 더덕, 초고압 미증숙 더덕, 초고압 증숙 더덕을 100 g씩 10배수 70% 에탄올 용매를 사용하여 각각 80℃에서 24시간 추출하였으며, 감압여과기를 이용하여 여과하였다. 불순물이 제거된 여액을 회전식 진공농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 3-(4,5-dimethythiazo-2-yl)-2,5-dipheny-tetrazoliumbromide (MTT)를 사용하여 Mosmann방법 을 변형시켜 세포 생존율을 측정하였다 (Mosmann, 1983). CCD-986sk 세포를 96 well plate에 1.
- 0 ㎎/㎖의 농도로 투여하고 CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 5 ㎍/㎖ 농도의 MTT 용액을 100 ㎕씩 각 well에 첨가하고 4시간 후 상층액을 제거한 다음, 10 ㎕의 acidisopropanol (0.04N HCl in isopropanol)을 첨가한 후 microplate reader (Tecan, USA)로 565 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- , 1959). Caffeic acid를 0 ~ 100 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다 (Singleton and Rossi, 1966).
- 각 공정별 더덕 추출물의 gallic acid의 함량변화를 알아보기 위하여 HPLC를 이용해 각 시료를 분석하였다. 시료를 분석용 ethanol에 녹여 0.
- Dopachrome법을 이용하여 tyrosinase 억제 효과를 측정하였다 (Pomerantz, 1963). Mushroom tyrosinase-150 unit 150 ㎕ 와 2.5 mM L-tyrosine 225 ㎕, 0.4 M hepes buffer (pH 6.8) 225 ㎕, ethanol 용액 또는 1 ㎎/㎖농도의 시료 300 ㎕를 혼합한 후 배양 전, 15분간 배양 후의 각각의 흡광도를 475 ㎚의 파장에서 측정하였다.
- Melanin을 생성하는 쥐 유래 melanocyte인 Clone-M3를 이용하여 melanin 생성저해율을 측정하여 각 시료의 미백활성을 측정하였다. Clone-M3를 96well에 접종하고 24시간 후에 3일간 각 시료를 처리하였다.
- 3일 후에 각 well의 배지를 제거한 후에 PBS로 세척하고, 각 well 당 1 ㎖의 1 N NaOH를 가한 다음 교반시켜 melanin 성분이 용출되도록 하였다. 용출된 melanin의 함량을 측정하기 위하여 microplate reader를 이용하여 400 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 ascorbic acid를 사용하였으며 추출물과 동일 농도로 처리하여 측정하였다 (Kim et al.
- 용출된 melanin의 함량을 측정하기 위하여 microplate reader를 이용하여 400 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 ascorbic acid를 사용하였으며 추출물과 동일 농도로 처리하여 측정하였다 (Kim et al., 2008).
- 5 × 105 cells/㎖의 농도로 35 ㎜ dish에 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 배양하였다. UV 조사 전에 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거한 다음, LUX meter (DM-28, Takemura, Japan)을 이용하여 6.3 J/cm2으로 맞추어 조사하였다. UV A 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 분자량별로 모아진 분획물을 1 ㎎/㎖의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
- 3 J/cm2으로 맞추어 조사하였다. UV A 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 분자량별로 모아진 분획물을 1 ㎎/㎖의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
- 4). 더덕에 함유되어 있는 폴리페놀 중 gallic acid를 표준물질로 하여 각 공정별 더덕 추출물의 폴리페놀 함량의 변화를 관찰하였다. 앞서 관찰한 DPPH free radical 소거활성 결과와 비슷하게 초고압 및 증숙가공 복합처리 더덕 추출물에 gallic acid 함량이 가장 많은 것으로 나타났으며, 일반 더덕 추출물이 네가지 실험군 중 가장 낮은 함량을 나타내었다.
- , 2000). 이러한 UV A에 의해 발현이 증가되는 MMP-1에 미치는 더덕 추출물의 영향을 알아보고자 HDFs에 UV A를 조사하고 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 MMP-1 발현 저해 효과를 ELISA로 측정하여 Fig. 7에 나타내었다. 모든 시료군에서 농도 의존적으로 저해율이 증가하였으며, 최고농도 1.
대상 데이터
- 시료는 강원도 횡성지역에서 2012년 8월에 채취한 것을 사용하였다. 사용된 더덕은 상품가치가 없는 초리 (저가 더덕)를 사용하였으며, 깨끗하게 세정한후 실온 건조된 더덕을 세절하여 시료를 제조하였다.
- 시료는 강원도 횡성지역에서 2012년 8월에 채취한 것을 사용하였다. 사용된 더덕은 상품가치가 없는 초리 (저가 더덕)를 사용하였으며, 깨끗하게 세정한후 실온 건조된 더덕을 세절하여 시료를 제조하였다. 마하스팀기 (Daechang stainless.
- 수직 환류냉각기가 부착된 추출 flask를 사용하여 일반 생더덕과 증숙 더덕, 초고압 미증숙 더덕, 초고압 증숙 더덕을 100 g씩 10배수 70% 에탄올 용매를 사용하여 각각 80℃에서 24시간 추출하였으며, 감압여과기를 이용하여 여과하였다. 불순물이 제거된 여액을 회전식 진공농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Japan)를 이용하여 농축한 후 동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSIN, Korea)를 사용하여 분말 상태로 만들어 실험에 사용하였다.
- Human fibroblasts CCD-986sk, melanocyte Clone-M3 는 한국세포주은행으로부터 동결세포주로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk와 Clone-M3를 각각 DMEM과 RPMI1640 배지에 fetal bovine serum (FBS, Hyclone) 10%와 1%의 penicillinstreptomycin을 첨가하여 CO₂5%, 37℃의 조건하에서 배양한후 사용하였다.
- Human fibroblasts CCD-986sk, melanocyte Clone-M3 는 한국세포주은행으로부터 동결세포주로 구입하였다. 구입한 CCD-986sk와 Clone-M3를 각각 DMEM과 RPMI1640 배지에 fetal bovine serum (FBS, Hyclone) 10%와 1%의 penicillinstreptomycin을 첨가하여 CO₂5%, 37℃의 조건하에서 배양한후 사용하였다. 그 외 실험에 사용한 모든 시약들은 Sigma사에서 구입하였다.
- 구입한 CCD-986sk와 Clone-M3를 각각 DMEM과 RPMI1640 배지에 fetal bovine serum (FBS, Hyclone) 10%와 1%의 penicillinstreptomycin을 첨가하여 CO₂5%, 37℃의 조건하에서 배양한후 사용하였다. 그 외 실험에 사용한 모든 시약들은 Sigma사에서 구입하였다.
- HPLC 기기는 Aglient 1260 series를 사용하였으며, column은 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)를 이용하였다.
- 더덕 추출물의 멜라닌 합성 저해능을 측정하기 위해 melanoma cell인 B16F10을 이용하였다(Fig. 6). Positive control로 hydroquinone을 사용하였으며, 0.
데이터처리
- 또한 각 활성 실험 등에 대한 각 실험결과는 triplicate determinations에 의한 Mean ± standard deviation (SD)로 표시했으며, 평균값의 차이는 P < 0.05의 조건에서 유의한 것으로 간주하였다.
- SAS (Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하여 평균과 표준편차를 구하여 처리하였다. 또한 각 활성 실험 등에 대한 각 실험결과는 triplicate determinations에 의한 Mean ± standard deviation (SD)로 표시했으며, 평균값의 차이는 P < 0.
이론/모형
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 추출물 1 ㎖ 에 Folin-Ciocalteau 시약 및 10% Na2OH3 용액을 각 1 ㎖씩 차례로 가한 다음 실온에서 1시간 정치한 후 UV-vis spectrophotometer (852A Diode Array Spectrophotometer, Hewlett Packard)를 이용하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 (Swain et al., 1959). Caffeic acid를 0 ~ 100 ㎍/㎖ 의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 측정하였다 (Singleton and Rossi, 1966).
- Dopachrome법을 이용하여 tyrosinase 억제 효과를 측정하였다 (Pomerantz, 1963). Mushroom tyrosinase-150 unit 150 ㎕ 와 2.
- UV A 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은 Dunsmore 등 (1998)의 방법에 의하여 UV A를 조사 후 시료를 처리하여 24시간 배양한 배지를 96 well plate에 분주하여 4℃에서 24시간 동안 coating하였다. TBS (phosphate buffered saline + 0.
성능/효과
- 1에 나타내었다. 각 공정별 더덕추출물은 모두 농도 의존적으로 세포독성이 증가하는 경향을 보였으며, 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 모든 추출물이 20% 이하의 세포독성을 보였다. 1.
- 0 ㎎/㎖의 농도에서 모든 추출물이 20% 이하의 세포독성을 보였다. 1.0 ㎎/㎖의 농도에서 일반 미증숙 더덕 추출물 (FC)은 18.12%의 가장 높은 세포독성을 나타내었으며, 초고압 처리 증숙가공 더덕 추출물 (SHC)의 경우 15.82%의 수치를 나타내 가장 낮은 세포독성을 보였다. 초고압처리 미증숙 추출물 (HC)과 증숙가공 추출물 (SC)도 각각 16.
- 82%의 수치를 나타내 가장 낮은 세포독성을 보였다. 초고압처리 미증숙 추출물 (HC)과 증숙가공 추출물 (SC)도 각각 16.89%, 16.04%의 세포독성을 보여, 일반 미증숙 더덕 추출물 (FC)보다는 낮은 세포독성을 나타내었다. 이 결과로 각 공정처리에 따른 세포독성의 감소를 확인하였으며, 또한 농도가 증가함에 따라서 급격한 독성의 증가없이 완만한 상승패턴을 보여줌에 따라 향후 기능성 소재로서 사용 시 더덕 추출물의 고농도 첨가를 가능하게 해, 효과적인 활성을 나타낼 수 있을 것이라 사료된다.
- 더덕 추출물들의 DPPH free radical 소거능을 측정한 결과 1.0 ㎎/㎖ 의 농도에서 일반 미증숙 더덕추출물 (FC)은 19.22%, 증숙가공 더덕 (SC)은 50.22%, 초고압처리더덕 (HC)는 29.66%, 초고압 처리 증숙가공 더덕 (SHC)의 경우 52.18%의 자유라디칼 소거능을 나타내었다. 일반 더덕과 증숙 가공 더덕의 자유라디칼 소거능은 대략 30% 이상의 차이를 보였으며, 초고압처리 미증숙 더덕의 경우에도 일반 미증숙 더덕 추출물에 비해 10%가량 높은 소거능을 확인 할 수 있었다.
- 18%의 자유라디칼 소거능을 나타내었다. 일반 더덕과 증숙 가공 더덕의 자유라디칼 소거능은 대략 30% 이상의 차이를 보였으며, 초고압처리 미증숙 더덕의 경우에도 일반 미증숙 더덕 추출물에 비해 10%가량 높은 소거능을 확인 할 수 있었다. 초고압 전처리와 증숙가공을 동시에 처리한 더덕 추출물이 52.
- 일반 더덕과 증숙 가공 더덕의 자유라디칼 소거능은 대략 30% 이상의 차이를 보였으며, 초고압처리 미증숙 더덕의 경우에도 일반 미증숙 더덕 추출물에 비해 10%가량 높은 소거능을 확인 할 수 있었다. 초고압 전처리와 증숙가공을 동시에 처리한 더덕 추출물이 52.182%의 가장 높은 자유라디칼 소거능을 보였다. 일반 미증숙 더덕 추출물의 자유리다칼 소거능은 녹차 (64.
- 182%의 가장 높은 자유라디칼 소거능을 보였다. 일반 미증숙 더덕 추출물의 자유리다칼 소거능은 녹차 (64.3%), 작약 (57.1%), 생강 (48.3%) (Jung et al., 2004)보다 낮은 수치를 나타내었으나 증숙가공으로 인한 항산화능의 증가가 뚜렷해진 것으로 확인하였다. 이는 증숙과정 간에 증숙의 영향으로 세포벽의 조직이 확장과 수축을 반복하고 그 결과 느슨해진 세포벽으로 유용 물질이 많이 용출된 후에도 더덕 내에 남아있는 잔류 유용성분이 초고압 증숙 복합 공정을 통해 추가적으로 용출이 된 것으로 사료된다.
- 3에 나타내었다. 추출물들의 총 페놀 함량은 초고압 및 증숙가공 복합처리 된 더덕 추출물에서 14.22 ㎍/㎖로 가장 높은 함량을 나타내었고, 초고압 추출물에서 9.41 ㎍/㎖의 함량을 나타내었다. 이는 더덕 추출물에 페놀성 화합물이 함유되어 있으며, 증숙가공 처리에 의하여 더덕의 유용활성물질이 더 효과적으로 용출되는 것을 알 수 있었다.
- 41 ㎍/㎖의 함량을 나타내었다. 이는 더덕 추출물에 페놀성 화합물이 함유되어 있으며, 증숙가공 처리에 의하여 더덕의 유용활성물질이 더 효과적으로 용출되는 것을 알 수 있었다. 이러한 페놀성 화합물은 가용성 식물에 널리 분포하여 항산화능을 포함해 다양한 생물학적 효능을 나타내는데, 이들의 효능은 주로 산화환원력에 의한 것이라고 발혀져 있다 (Osawa, 1994).
- 더덕에 함유되어 있는 폴리페놀 중 gallic acid를 표준물질로 하여 각 공정별 더덕 추출물의 폴리페놀 함량의 변화를 관찰하였다. 앞서 관찰한 DPPH free radical 소거활성 결과와 비슷하게 초고압 및 증숙가공 복합처리 더덕 추출물에 gallic acid 함량이 가장 많은 것으로 나타났으며, 일반 더덕 추출물이 네가지 실험군 중 가장 낮은 함량을 나타내었다. Gallic acid 함량의 차이는 증숙가공 여부에 따라 그 수치가 현저하게 차이가 나는 것을 확인 할 수 있으며, 이것으로 증숙가공 처리를 거치면서 섬유질로 이루어진 더덕의 질긴 세포벽이 손상되어, 더덕에 함유되어 있는 폴리페놀물질의 용출이 증가된 것으로 보인다.
- 앞서 관찰한 DPPH free radical 소거활성 결과와 비슷하게 초고압 및 증숙가공 복합처리 더덕 추출물에 gallic acid 함량이 가장 많은 것으로 나타났으며, 일반 더덕 추출물이 네가지 실험군 중 가장 낮은 함량을 나타내었다. Gallic acid 함량의 차이는 증숙가공 여부에 따라 그 수치가 현저하게 차이가 나는 것을 확인 할 수 있으며, 이것으로 증숙가공 처리를 거치면서 섬유질로 이루어진 더덕의 질긴 세포벽이 손상되어, 더덕에 함유되어 있는 폴리페놀물질의 용출이 증가된 것으로 보인다.
- 7에 나타내었다. 모든 시료군에서 농도 의존적으로 저해율이 증가하였으며, 최고농도 1.0 ㎎/㎖에서 증숙더덕 추출물이 39.08%의 저해율을 나타내어 가장 높은 활성을 나타내었고 초고압 처리 미증숙 더덕 추출물과 일반 미증숙 더덕 추출물의 경우 25.21%, 25.39%의 저해율을 기록하였다. 증숙공정에 의한 MMP-1의 저해율이 증가함을 확인하였다.
- 39%의 저해율을 기록하였다. 증숙공정에 의한 MMP-1의 저해율이 증가함을 확인하였다. 이는 UV A 조사 시 발생한 자유 라디칼의 제거와 관계가 있다고 생각되며, 증숙 공정을 통해 항산화 활성이 증가되어 MMP-1의 발현에 영향을 준 것으로 보인다.
- 5에 나타내었다. 0.21.0 ㎎/㎖의 농도에서 일반 더덕 추출물의 경우 1.4110.21%의 낮은 tyrosinase 저해활성을 나타냈으며 초고압 더덕의 경우 같은 농도 범위에서 3.2012.22%, 증숙가공 더덕의 경우 5.2827.32%, 초고압 처리 증숙가공 추출물의 경우 5.4428.61%의 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 것을 확인하였다. 미백 활성으로 잘 알려진 가래나무 추출물 (300 ㎍/㎖ 농도 대비 60%) (Lee et al.
- 61%의 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 것을 확인하였다. 미백 활성으로 잘 알려진 가래나무 추출물 (300 ㎍/㎖ 농도 대비 60%) (Lee et al., 2010)보다 미미한 활성이지만 증숙 및 초고압 복합공정으로 인해 tyrosinase 저해 활성이 22.5배 상승하여 미백 활성에 대한 가능성을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 측정한 더덕의 항산화 활성물질의 용출로 인하여 활성산소의 생성을 차단되어 멜라닌 생성 효소의 활성이 억제된 것으로 보인다.
- 25%로 측정되었다. 1.0 ㎎/㎖의 추출물을 처리하였을 때, 멜라닌 합성 저해율을 보면 일반 더덕 추출물의 경우 18.45%, 증숙가공 추출물 28.49%, 초고압 공정 추출물 20.47%, 초고압 전처리 증숙가공 추출물 27.46%이었다. 앞서 실시한 tyrosinase 저해 활성 실험과 비슷한 양상의 결과를 나타내었으며, positive control인 hydroquinone에 비해 낮은 활성을 나타내었지만, 증숙가공을 통하여 미백활성이 증진되는 결과를 확인할 수 있었다.
- 46%이었다. 앞서 실시한 tyrosinase 저해 활성 실험과 비슷한 양상의 결과를 나타내었으며, positive control인 hydroquinone에 비해 낮은 활성을 나타내었지만, 증숙가공을 통하여 미백활성이 증진되는 결과를 확인할 수 있었다. 더덕의 항산화물질이 피부의 활성산소의 생성을 차단하여 자외선의 피부손상의 위험이 줄어들었기 때문에, 앞의 tyrosinase 저해 활성과 함께 melanogenesis 저해활성이 높아진 것으로 생각된다.
후속연구
- 04%의 세포독성을 보여, 일반 미증숙 더덕 추출물 (FC)보다는 낮은 세포독성을 나타내었다. 이 결과로 각 공정처리에 따른 세포독성의 감소를 확인하였으며, 또한 농도가 증가함에 따라서 급격한 독성의 증가없이 완만한 상승패턴을 보여줌에 따라 향후 기능성 소재로서 사용 시 더덕 추출물의 고농도 첨가를 가능하게 해, 효과적인 활성을 나타낼 수 있을 것이라 사료된다.
- 이는 증숙과정 간에 증숙의 영향으로 세포벽의 조직이 확장과 수축을 반복하고 그 결과 느슨해진 세포벽으로 유용 물질이 많이 용출된 후에도 더덕 내에 남아있는 잔류 유용성분이 초고압 증숙 복합 공정을 통해 추가적으로 용출이 된 것으로 사료된다. 초고압 공정 추출물에 비해서 증숙가공 추출물의 활성이 높게 측정되고, 초고압과 증숙가공 공정을 복합처리한 추출물의 경우, 증숙가공 추출물보다는 소폭 증진된 활성을 보였으나, 공정상 드는 에너지와 비용을 계산한다면, 증숙가공을 단독으로 처리하는 것이 환경과 경제적인 면에서 더 나은 결과를 도출할 수 있을 것이라 생각된다.
- 이는 UV A 조사 시 발생한 자유 라디칼의 제거와 관계가 있다고 생각되며, 증숙 공정을 통해 항산화 활성이 증가되어 MMP-1의 발현에 영향을 준 것으로 보인다. 이러한 결과는 더덕추출물이 외부 스트레스인 UV에 의해 발생된 교원질 파괴를 담당하는 유해인자를 효과적으로 제거함으로써 MMP-1발현을 효과적으로 조절한 것이라 생각되며, 향후 피부의 교원질층의 파괴로 인한 주름살을 개선하는 향장소 재개발에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다.
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