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문제 정의
- 이에 저자는 和胃, 消積, 淸熱, 安神의 효능이 있는 溫膽湯에 胸腹의 氣滯를 疏暢시키는 烏藥3)을 가미한 溫膽湯加味方이 우울증의 중요한 신경전달물질인 serotonin의 대사과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 P815 세포내의 serotonine 함량 및 5-HTT, TPH-1, mRNA의 활성 변화 및 항산화 효능을 측정한 바 약간의 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 저자는 溫膽湯加味方이 우울증 활용 가능성을 실험적으로 규명하고자 P815 세포에서 Ez-cytox 분석법을 이용한 세포 생존, DPPH free radical 소거 작용, superoxide dismutase (SOD) 활성 및 세포내 5-HT, Tryptophan hydroxylase 1 (TPH-1) 등의 함량 및 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 발현에 미치는 영향을 측정ㆍ관찰하였다.
제안 방법
- 1. 溫膽湯加味方은 DPPH radical 소거능과 SOD 활성도를 유의성 있게 증가시켰다.
- 溫膽湯加味方의 항산화 능력을 알아보기 위하여 DPPH free radical 소거작용과 SOD 활성을 측정하였다. DPPH free radical의 안정성, 높은 민감도 및 검사의 편의성 등으로 인해 DPPH free radical 소거법은 항산화 작용 평가에 흔히 사용되는 검사법이다30).
- 溫膽湯加味方의 항산화 효능과 P815세포 내에서 serotonin 대사과정에 미치는 영향을 알아보기 위하여 SOD 소거능, serotonin 농도, 5-HTT, TPH-1의 mRNA 활성 변화를 관찰한 결과, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 각 sample의 추출된 RNA에 2X SYBR green master mix (Bio‐Rad) 25μl와 각각의 유전자들과 10 pM forward and reverse primers를 1μl씩 첨가하여 각각 50μl 반응이 이루어졌으며 95℃에서10분 후 30초간 40 cycle을 돌린 다음 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응을 일으켰다.
- 517 nm에서 분광광도계를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 각 시료의 농도 별 free radical scavenging activity 곡선을 그린 뒤, 50%의 DPPH free radical scavenging activity (DPPH IC50)를 나타내는 값을 구하였다.
- 대조 유전자로 β actin mRNA을 control로 이용하여 target mRNA를 정량하고 유전자 발현을 비교하였다(Table 2).
- 분리한 RNA에 해당 유전자들의 oligo dT primer와 DEPC water를 넣고 65℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 실온에서 3분 동안 방치한 다음 10×buffer, 10 mM dNTP, AMV reverse transcriptase, 50 mM MgCl2 및 DEPC treated water를 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 reverse transcriptase (RT) product를 만든다. 만들어진 RT product (template cDNA)를 사용하여 real-time PCR (Bio Rad)를 사용하여 측정한다.
- , 60 mm culture dish)를 배양한 다음, 이 세포에 溫膽湯加味方 처방을 50μg/ml, 100μg/ml 가한 다음 48시간 배양하였다. 배양 후 cell line을 ice‐cold phosphate buffered saoine (PBS) 용액으로 harvest하여 원심분리하고 pellet을 얻은 후, pellet은 -70℃ freezer에 보관하면서 serotonin 함량 측정시료로 사용하였다.
- 상층액을 Millex-GV (0.22μm)로 여과한 후 HPLC에 주입하여 serotonin 함량을 측정하였다.
- 세포 내부의 serotonin 농도를 분석하기 위하여, 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한 후, 1×PBS pH 7.2의 완충액을 이용하여 세포를 2번 세척하였다.
- 시료의 free radical 소거 활성은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로, 농축한 시료를 각각 ethanol로 희석하여 IC50 값을 나타낼 수 있는 농도가 포함되도록 농도 별로 제조하였다. 여기에 2,2'-diphenyl-2-picrylhydrazyl을 methanol에 녹여 0.
- 열탕추출기(대웅, Korea), Rotary vaccum evaporator (Büchi B-480, Switzerland), Freeze dryer (EYELA FDU‐540, Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co., USA), Clean bench (Vision scientific Co., Korea), Aut℃lave (Sanyo, Japan), Micro-pipet (Gilson, France), Water bath (Vision scientific Co., Korea), Vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), Spectrophotometer (Shimazue, Japan), Centrifuge (Sigma, USA), Deep freezer (Sanyo, Japan), Therm℃ycler system (MWG Biotech., Germany), Ice maker (Vision scientific Co., Korea), Homogenizer (OMNI, USA), Plate shaker (Lab‐Line, USA) 및 ELISA reader (Molecular Devices, USA), C18역상 HPLC columne (Hypersil, USA), HPLC (Shimazu, Japan)의 기기를 사용하였다.
대상 데이터
- , Korea), 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다. Berberine hydr℃hloride, Palmatine hydr℃hloride, Coralyne hydr℃hloride, L-tryptophan, 5-hydroxytryptophan, Catalase, DL-6-methyl-5,6,7,8-tetrahydropterin (4H-PT), Serotonin (5-HT), 5-hydroxytryptamine transporter (5-HTT), dithiothreitol 및 5-hydroxyindoleacetic acid (HIAA) (sigma, USA), 세포배양용 fetal calf serum 및 penicillin/streptomycin, DMEM 배지(Gibco, USA)를 구입하였다. Ez-cytox assay kit (Itsbio, Korea), SOD assay kit (Dojindo, Japan)를 사용하였으며, 그 밖의 시약은 특급 및 1급을 사용하였다.
- Cell culture는 FBS (Gibco-BRL, USA), DMEM (Gibco-BRL, USA), 10 mm HEPES, 2 mm L-glutamine, 1 mm sodium pyruvate, 100 U/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 50μM 2-mercaptoethanol, D-PBS dulbecco's phosphate buffered saline (Gibco-BRL, USA), Potassium phosphate dibasic, potassium phosphate monobasic, Trypsin-EDTA (Gibco-BRL, USA), Isopropanol, NaOH, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhy-drazyl) (Sigma, USA)을 사용하였고, Trizol (Life Technologies, Gaithersburg), Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies, Gaithersburg), IQ SYBR green supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA), ethanol, methalnol (Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Korea), 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- P815 세포는 동아대학교 의과대학에서 분양 받았으며, 배양은 10% fetal calf serum, 100 unit/ml penicillin과 100μg/ml streptomycin을 포함한 DMEM 배지, 10 mm HEPES, 2 mm L-glutamine, 1 mm sodium pyruvate를 사용하여, cell culture용 dish에서 37℃, 5% CO2 상에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 溫膽湯加味方 (OnDam-tang-Kami-bang, ODK)은 ≪東醫寶鑑·夢≫2)의 溫膽湯에 烏藥을 4.0 g 가미한 것으로, 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다.
- 본 실험에서는 P815라는 세포주를 이용하였는데 이 세포는 TPH를 비교적 많이 발현하는 세포로서 TPH 연구에 많이 이용된다. P815 세포는 F1 hybrid mice의 ascitic tumour에서 유래한 것으로 serotonin을 생합성, 저장 및 분비하며, TPH 및 AADC를 발현하고 histamine을 생합성, 저장 및 분비하며, histamine 생합성 효소인 histidine decarboxylase를 발현 한다32).
- 여기에 2,2'-diphenyl-2-picrylhydrazyl을 methanol에 녹여 0.1 mM DPPH 용액을 제조하였다.
데이터처리
- 실험결과는 mean±standard error로 기록하였다.
- 유의성 검증은 Student's t-test를 이용하여 분석하였으며 p＜0.05에서 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- Serotonin 함량은 HPLC‐형광광도계법으로 측정하였다. 세포 내부의 serotonin 농도를 분석하기 위하여, 약물을 처리한 세포의 배지를 제거한 후, 1×PBS pH 7.
- 溫膽湯加味方의 세포독성 여부를 판단하기 위하여 Ez-cytox 분석법을 시행하였다. 50μg/ml, 100μg/ml, 200μg/ml, 400μg/ml 농도로 처리한 후 세포 생존을 측정한 결과 모두 80% 이상의 생존율을 보여, 溫膽湯加味方은 400μg/ml 이하 농도에서는 안전한 약물이라고 판단하였다(Fig.
- 각 유전자 발현 정도를 real-time PCR을 이용해 측정하였다. 각 sample의 추출된 RNA에 2X SYBR green master mix (Bio‐Rad) 25μl와 각각의 유전자들과 10 pM forward and reverse primers를 1μl씩 첨가하여 각각 50μl 반응이 이루어졌으며 95℃에서10분 후 30초간 40 cycle을 돌린 다음 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응을 일으켰다.
- 각각의 시료중의 단백질 함량을 측정하여 보정하였으며, 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 하고 Bradford's method21)를 이용하여 측정하였다.
- 이후 세포 생존을 Ez-cytox 분석법에 의해서 분석하였다. Ez-cytox 분석법은 배양이 완료된 세포에 50μg/ml Ez-cytox (Itsbio)를 희석 처리하여 반응시킨 다음 microplate reader로 570 nm에서 측정하였다.
성능/효과
- 2. 溫膽湯加味方은 50, 100μg/ml 실험군에서 serotonin 농도를 유의하게 감소시켰다.
- 3. 溫膽湯加味方은 100μg/ml 실험군에서 5-HTT, TPH-1 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다.
- 5-HTT, TPH-1의 mRNA 발현을 측정한 결과 溫膽湯加味方 100μg/ml에서 5-HTT는 0.722±0.036 (%), TPH-1은 0.766±0.067 (%)로 5-HTT, TPH-1의 mRNA 값이 유의하게 감소하였다(Table 5, 6, Fig. 5, 6).
- 50μg/ml, 100μg/ml, 200μg/ml, 400μg/ml 농도로 처리한 후 세포 생존을 측정한 결과 모두 80% 이상의 생존율을 보여, 溫膽湯加味方은 400μg/ml 이하 농도에서는 안전한 약물이라고 판단하였다(Fig. 1).
- DPPH를 이용한 free radical 소거 반응으로 溫膽湯加味方의 항산화 작용을 측정한 결과, 400μg/ml에서 30.8±1.65 (%), 200μg/ml에서 30.4±0.88 (%), 100μg/ml일 때 15.6±1.04 (%), 10μg/ml 일 때 8.7±0.52 (%)의 소거작용을 나타났다(Table 3, Fig. 2).
- P815 세포주에 溫膽湯加味方을 50μg/ml, 100μg/ml, 200μg/ml, 400μg/ml 농도로 처리하여 세포 생존을 측정한 결과, 溫膽湯加味方 50μg/ml에서 94.3±2.24 (%), 100μg/ml에서 89.1±4.43 (%), 200μg/ml에서는 88.1±2.94 (%), 400μg/ml에서는 85.2±3.20 (%)으로 세포 생존에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- Serotonin의 합성 속도를 조절하는 5-HTT의 mRNA와 TPH의 mRNA는 溫膽湯加味方 100μg/ml을 처리한 세포의 발현 측정 결과, 5-HTT는 0.722±0.036, TPH-1은 0.766±0.067로 유의하게 감소하였다(Fig. 5, 6).
- 溫膽湯加味方은 100μg/ml에서는 84.6±12.7 U/ml, 50μg/ml에서는 75.1±10.3 U/ml로 SOD 활성이 증가하여 50μg/ml, 100μg/ml 모두 유의한 결과를 얻었다(Fig. 3).
- 溫膽湯加味方의 SOD 활성을 측정한 결과, 溫膽湯加味方 100μg/ml에서는 84.6±12.7 U/ml, 50μg/ml에서는 75.1±10.3 U/ml로 농도에 따라 SOD 활성이 증가하여 50μg/ml, 100μg/ml에서 유의한 항산화작용을 보였다(Fig. 3).
- 溫膽湯加味方이 P815 세포 내부의 serotonin 농도에 미치는 영향을 분석한 결과 溫膽湯加味方 50μg/ml에서 91.6±10.2 ng/ml protein (87.4%), 100μg/ml에서 81.9±1.4 ng/ml protein (63.6%)로 유의하게 감소하였다(Table 4, Fig. 4).
- 溫膽湯加味方이 serotonin 합성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 P815 배양 세포에 溫膽湯加味方을 처리한 후 HPLC-형광광도계법으로 세포 내부의 serotonin 농도를 분석한 결과, 50μg/ml에서 108.7±14.1 ng/ml protein (87.4%), 100μg/ml에서 79.1±5.0 ng/ml protein (63.6%)로, 대조군에 비하여 溫膽湯加味方 100μg/ml에서 seronin 함량이 유의하게 감소하였다(Fig. 4).
- 농도별 溫膽湯加味方 추출물 처리 후 DPPH free radical 소거능은 농도 의존적으로 증가하여, 400μg/ml일 때는 30.8±1.65, 200μg/ml 일 때 30.4±0.88, 100μg/ml 일 때 15.6±1.04, 10μg/ml 일 때 8.7±0.52의 소거능을 나타내었다(Fig. 2).
- 상기 연구로 볼 때 溫膽湯加味方이 항산화효과가 있었고 P815 세포에서의 serotonin 함량감소를 보여 세로토닌을 조절하는 기능이 있는 것으로 판단된다. 상기의 베르베린, 에타베린의 연구결과로 미루어 볼 때 溫膽湯加味方 역시 항우울효과가 있을 가능성이 있으며 향후 溫膽湯加味方의 동물실험 연구 등을 통해 항우울효과에 대한 확인이 필요하리라 사료된다.
- 위의 두 실험 결과에서 溫膽湯加味方은 P815 세포내 serotonin 함량과 5-HTT, TPH-1의 mRNA 발현을 모두 유의하게 감소시켜 溫膽湯加味方이 특정세포내의 serotonin 함량을 조절하는 효과를 보였다고 할 수 있다.
후속연구
- 상기 연구로 볼 때 溫膽湯加味方이 항산화효과가 있었고 P815 세포에서의 serotonin 함량감소를 보여 세로토닌을 조절하는 기능이 있는 것으로 판단된다. 상기의 베르베린, 에타베린의 연구결과로 미루어 볼 때 溫膽湯加味方 역시 항우울효과가 있을 가능성이 있으며 향후 溫膽湯加味方의 동물실험 연구 등을 통해 항우울효과에 대한 확인이 필요하리라 사료된다.
- 위의 두 실험의 결과에 의거하여 溫膽湯加味方은 항산화효능이 있을 것으로 추측하며, free radical 산화 작용과 관련된 신경정신과 질환에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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