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문제 정의
- 1). 본 연구진은 엉겅퀴 지상부 중 꽃 추출물과 지하부인 뿌리 추출물을 비교 분석 하여 보고한 바 있다.11) 잎 추출물에서 꽃 추출물보다 총 polyphenol과 총 flavonoid 함량이 보다 높게 함유되어 있는 것으로 나타났다.
가설 설정
- Chemical structures of silymarins and flavonoids. A: Structure of silymarin compounds. B: Structures of flavonoid compounds.
- A: Structure of silymarin compounds. B: Structures of flavonoid compounds.
제안 방법
- 21) LX-2 cells에 각 엉겅퀴 추출물을 농도 의존적으로 전처리한 뒤 TGF-β1을 24시간 동안 처리하여 간성상세포의 활성에 주요한 지표인 α-SMA (smooth muscle actin)과 세포외기질 관련 유전자인 type I collagen (Col-α1(I))의 mRNA 발현을 관찰하였다.
- Flavonoid 계 화합물 함량 − 상기 결과를 바탕으로 silymarin계 화합물과 polyphenol/flavonoids 화합물을 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
- 5×105/ well) 24시간 후 엉겅퀴 각 추출물을 농도별로 처리하고, 3시간 뒤 TGF-β1 (10 ng/mL)을 24시간 동안 처리하였다. RNA의 분리는 TRIZOL reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다.
- RT-PCR − LX-2 cells을 6-well plate에 분주하고(2.5×105/ well) 24시간 후 엉겅퀴 각 추출물을 농도별로 처리하고, 3시간 뒤 TGF-β1 (10 ng/mL)을 24시간 동안 처리하였다.
- Real-time PCR − 각 처리 조건별로 얻어진 RNA (1 µg) 는 ImProm-II TM Reverse Transcription System (Promega, USA)를 이용하여 cDNA 용액을 합성하고, 합성된 cDNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다.
- 간 성상세포를 100 mm 배양접시(Falcon, Becton Dickinson, Fanklin Lakes, NJ, USA)에서 배양하였으며, 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS, Invitrogen, USA)와 항생제(Invitrogen)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's, Invitrogen)을 사용하였다.
- 본 연구는 엉겅퀴 지상부중 잎과 지하부인 뿌리를 알코올 추출물들의 polyphenol, flavonoids, flavanolignans의 성분 함량과 TGF-β1에 의한 간 성상 세포 활성 억제 효능을 비교하였다.
- 본 연구에서는 엉겅퀴 잎과 뿌리 추출물에서 polyphenol 과 flavonoid 함량 비교 및flavanolignan인 silymarin계 각 화합물을 HPLC로 비교 분석하였다. Polyphenol 및 flavonoids 함량은 엉겅퀴 잎 추출물은 뿌리 추출물 보다 높은 것으로 확인 되었고, flavonoid 화합물은 뿌리 추출물과 동등하거나 많은 양이 함유된 것으로 나타났다.
- RNA의 분리는 TRIZOL reagent (MRC, Cincinnati, OH, USA)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다. 분리된 RNA (1 µg)는 cDNA 합성을 위해 ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였다.
- 세포 배양 − 인간 간 성상세포(LX-2 cells, obtained from Dr. Fridemann, Columbia University, New York, USA)의 배양은 37℃ 대기와 5% CO2 조건에서 시행하였다.
- ussuriense)는 2012년 전라북도농업기술원 특화작목연구소에서 재배한 것을 우석대학교 한의과대학 본초방제학 교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(JBMI-012)은 전주생물소재연구소 식의약소재사업단에 보관하고 있다. 시료를 추출하기 위해 수세, 음건 한 잎과, 뿌리를 적당한 크기로 마쇄한 후 시료 50 g에 대해 10배의 MeOH를 넣어 60℃에서 4시간동안 2회 온침 추출하였다. 추출된 시료는 여과 후 수욕상에서 감압농축하여 완전 건고시킨 다음 시료로 사용하였다.
- 총플라보노이드 함량(Total Flavonoid Content, TFC) 측정 − Moreno등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 표준물질로 gallic acid (SigmaAldrich)를 0~500 µg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물 함량을 mg/g gallic acid로 나타내었다.
- Real-time PCR − 각 처리 조건별로 얻어진 RNA (1 µg) 는 ImProm-II TM Reverse Transcription System (Promega, USA)를 이용하여 cDNA 용액을 합성하고, 합성된 cDNA는 나노분광광도계(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 정량하였다. 합성된 cDNA (200 ng)는 SYBR green master mix kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 RG-6000 Real-Time PCR system (Corbett Life Sciences, Sydney, NSW, Australia)으로 실시하였다.
- 합성된 cDNA는 α-smooth muscle actin (SMA)와 collagenα1(I)의 primer를 사용하여 PCR을 수행하고 생성된 product는 1% agarose gel로 전기 영동하여 ethidium bromide와 결합, 가시화하여 결과를 확인하였다.
대상 데이터
- 분리된 RNA (1 µg)는 cDNA 합성을 위해 ImProm-IITM Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하였다.
- v/v)로 희석하였다. 분석을 위해 Gemini-NX C18 (Phenomenex Inc., USA) 및 Zorbax SB C18 (Agilent Technologies Inc., USA) 컬럼과 MWD (Multiwavelength detector)를 장착한 HPLC (Agilent 1200 series)를 사용하였다. 각 화합물에 대한 분석조건은 Table I에 나타내었다.
- 시료의 추출 − 본 실험에 사용한 엉겅퀴(Cirsium japonicumvar. ussuriense)는 2012년 전라북도농업기술원 특화작목연구소에서 재배한 것을 우석대학교 한의과대학 본초방제학 교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(JBMI-012)은 전주생물소재연구소 식의약소재사업단에 보관하고 있다.
- 3B, C). 엉겅퀴 잎과 뿌리 추출물 중 flavonoid 화합물의 정량을 위해 rutin, luteolin, quercetin, apigenin, kaempferol과 페놀성 물질 중 엉겅퀴에서 분리정제 된 바 있는 syringin을18) 표준물질로 사용하였다(Fig. 4A, Fig 5A). Syringin을 제외한 flavonoids 화합물의 분석은 동일한 조건에서 수행하였다.
데이터처리
- 통계적 분석은 Student's t-test를 사용하였으며 P <0.05일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
- 통계처리 − RT-PCR의 발현치는 GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)와의 상대적인 발현량을 정량화 하였고, 각 실험 결과를 종합하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Silymarin 에는 silybin, isosilybin, silychiristin 및 4가지 이성체가 존재는 것으로 알려져 있다.8,9,15,16) Silymarin 정량은 Liu등에17)의해 보고된 방법을 참고 하였으며, 표준물질에서 9개의 peak를 확인하였다(Fig. 3A). 엉겅퀴 잎과 줄기 추출물에서 정량 결과 silymarin계 화합물의 함량은 뿌리보다 잎 추출
- 총페놀(Total Phenolic Content, TPC) 측정 − 총 페놀의 함량은 Folin-Denis법12)을 이용하여 엉겅퀴 잎과 뿌리 추출물의 TPC 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 연령별 3대사인 중 간질환이 사회활동이 왕성한 40대에서 암, 자살 다음으로 주요 사망원인으로 보고되었다.1) 간섬유화는 바이러스나 알코올 등과 같은 원인으로 만성적인 간손상에 따른 창상 치유의 과정으로서 초기단계는 가역적이지만 이 과정이 지속되면 비가역적으로 세포외기질에 교원질 침착 및 정상 간조직의 변형이 일어나며 궁극적으로 간경변증을 초래한다.2,3)
- 본 연구진은 엉겅퀴 지상부 중 꽃 추출물과 지하부인 뿌리 추출물을 비교 분석 하여 보고한 바 있다.11) 잎 추출물에서 꽃 추출물보다 총 polyphenol과 총 flavonoid 함량이 보다 높게 함유되어 있는 것으로 나타났다.
- 14,15) 엉겅퀴잎 및 뿌리의 MeOH 추출물의 총 polyphenol과 flavonoid 함량 측정 결과 잎 추출물이 뿌리 추출물에 비해 총 flavonoid의 경우 약 6배 이상, polyphenol은 3배 이상 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 본 연구진은 엉겅퀴 지상부 중 꽃 추출물과 지하부인 뿌리 추출물을 비교 분석 하여 보고한 바 있다.
- 본 연구에서는 엉겅퀴 잎과 뿌리 추출물에서 polyphenol 과 flavonoid 함량 비교 및flavanolignan인 silymarin계 각 화합물을 HPLC로 비교 분석하였다. Polyphenol 및 flavonoids 함량은 엉겅퀴 잎 추출물은 뿌리 추출물 보다 높은 것으로 확인 되었고, flavonoid 화합물은 뿌리 추출물과 동등하거나 많은 양이 함유된 것으로 나타났다. 또한, silymarin계 화합물의 경우에서도 잎 추출물에서 다량 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
- TGF-β1에 의한 간성상세포의 활성과 세포외기질 유전자인 Col-α1(I)의 발현을 뿌리 추출물 보다 잎추출물에서 보다 우수한 효능을 보였다.
- TGF-β1을 처리한 군에서는 α-SMA와 Col-α1(I)의 발현이 증가하는 반면 엉겅퀴 잎과 뿌리 추출물을 처리한 실험군에서는 각 유전자의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
- Polyphenol 및 flavonoids 함량은 엉겅퀴 잎 추출물은 뿌리 추출물 보다 높은 것으로 확인 되었고, flavonoid 화합물은 뿌리 추출물과 동등하거나 많은 양이 함유된 것으로 나타났다. 또한, silymarin계 화합물의 경우에서도 잎 추출물에서 다량 함유되어 있는 것으로 확인되었다. TGF-β1에 의한 간성상세포의 활성과 세포외기질 유전자인 Col-α1(I)의 발현을 뿌리 추출물 보다 잎추출물에서 보다 우수한 효능을 보였다.
- 잎과 뿌리 추출물 모두 α-SMA와 Col-α1(I) 의 발현을 유의하게 억제하였지만 뿌리 추출물은 50 µg/mL 이상에서 효능을 보인 반면 잎 추출물은 1 µg/mL 농도부터 유의한 효능을 보였다(Fig. 6, 7).
- Syringin을 제외한 flavonoids 화합물의 분석은 동일한 조건에서 수행하였다. 정량분석 결과 rutin과 luteolin의 함량은 잎과 뿌리에서 비슷한 수준으로 존재하는 반면 quercetin, apigenin, kaempferol 의 함량은 잎 추출물에서 상대적으로 다량 함유되어 있는 것으로 분석되었다(Fig. 4B). Syringin은 잎과 뿌리 추출물 모두에서 mg 수준으로 존재하였으며 잎 추출물에서 1.
후속연구
- 결론적으로 향후 간섬유화 모델에서 엉겅퀴 지상부의 효능 기전 규명과 동물모델에서의 효과 입증을 통해 엉겅퀴의 지상부가 지하부에 비해 간질환 관련 치료제 및 보조제 개발을 위해 보다 유용할 것으로 사료된다.
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