[논문]알츠하이머질환 모델동물인 Tg2576마우스의 행동, Aβ-42 침적, 신경성장인자 대사에 미치는 reserpine의 영향

고준; 최선일; 김지은; 이영주; 곽문화; 고은경; 송성화; 성지은; 황대연

doi:10.5352/jls.2013.23.6.812

[국내논문] 알츠하이머질환 모델동물인 Tg2576마우스의 행동, Aβ-42 침적, 신경성장인자 대사에 미치는 reserpine의 영향
Effect of Reserpine on the Behavioral Defects, Aβ-42 Deposition and NGF Metabolism in Tg2576 Transgenic Mouse Model for Alzheimer's Disease 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.23 no.6 = no.158, 2013년, pp.812 - 824

초록
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Reserpine은 항고혈압제로서 알츠하이머질병의 증상을 나타내는 Caenorhabditis elegans에서 세포독성을 감소시켜 마비를 억제하고 수명을 연장시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 이러한 reserpine의 효능을 포유동물에서 확인하기 위하여, 알츠하이머질병의 병리적 특성과 연관된 주요인자의 변화를 30일 동안 reserpine을 투여한 Tg2576 마우스에서 관찰하였다. 그 결과, 공격행동(aggressive behavior)은 vehicle 투여 그룹에 비하여 reserpine 투여 그룹에서 유의적으로 감소하였으나 사회적 접촉(social contact)은 유의적인 변화가 없었다. 뇌의 해마부분에서 알츠하이머질병의 원인 중 하나인 $A{\beta}$-42의 축적은 reserpine 투여 그룹에서 유의적으로 감소하였고, $A{\beta}$-42의 농도도 대조군에 비하여 reserpine 투여 그룹에서 감소하였다. 더불어, ${\gamma}$-secretase의 구성단백질 중에서 PS-2, Pen-2, APH-1의 발현은 대조군에 비하여 reserpine 투여군에서 유의적으로 감소하였으나 NCT 발현은 변화가 없었다. 혈청에서 NGF의 농도는 Tg2576 마우스에서 감소하였다가 reserpine 투여한 그룹에서 유의적으로 증가하였으며, high affinity receptor의 신호전달과정에 포함된 단백질 중에서 reserpine 투여 그룹은 TrkA의 인산화가 증가하고 ERK 인산화는 감소되었다. 한편 low affinity receptor의 신호전달과정에서, $p75^{NTR}$과 Bcl-2의 발현은 vehicle 그룹에 비하여 reserpine 투여 그룹에서 유의적으로 발현이 증가하였으나 RhoA의 발현은 reserpine 투여 그룹에서 감소하였다. 따라서 이러한 결과는 reserpine은 포유동물 치매모델인 Tg2576 마우스에서 행동학적 변화, $A{\beta}$-42의 축적, NGF의 농도, NGF신호전달의 변화 등을 유도하며, 향후 치매치료제로서 가능성을 제시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Reserpine, an anti-hypertensive drug, is able to positively modulate several phenotypes associated with $A{\beta}$ toxicity in a Caenorhabditis elegans model of Alzheimer's disease (AD). We investigated into the therapeutic effects of reserpine on mammalian neurodegenerative disorders, and found that significant alteration of the key factors influencing AD was detected in Tg2576 mice after reserpine treatment for 30 days. The aggressive behavior of Tg2576 mice was significantly improved upon reserpine treatment, whereas their social contact was consistently maintained. Furthermore, the levels of $A{\beta}$-42 peptide in the hippocampus of the brain and blood serum were lower in the reserpine-treated group than in the vehicle-treated group. Among g-secretase components, the expression levels of PS-2, Pen-2, and APH-1 were slightly lower in reserpine-treated Tg2576 mice, although a significant change in nicastrin (NCT) expression was not detected. Furthermore, the serum level of nerve growth factor (NGF) increased in reserpine-treated Tg2576 mice compared with vehicle-treated mice. Among down-stream effectors of the NGF receptor TrkA signaling pathway, reserpine treatment induced elevation of TrkA phosphorylation and reduction of ERK phosphorylation. In addition, in the NGF receptor $p75^{NTR}$ signaling pathway, the expression levels of $p75^{NTR}$ and Bcl-2 were enhanced in reserpine-treated Tg2576 mice compared with vehicle-treated mice, whereas the expression level of RhoA declined. Overall, these results suggest that reserpine can help relieve AD pathogenesis in Tg2576 mice through downregulation of $A{\beta}$-42 deposition, alteration of ${\gamma}$-secretase components, and regulation of NGF metabolism.

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AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 reserpine이 γ-secretase 복합체 구성단백질에 미치는 영향을 평가하기 위하여 Tg2576 마우스의 뇌조직을 이용하여 western blot을 실시하였다.
이러한 마우스는 soluble Aβ-40와 Aβ-42가 6-8개월령에서 급격히 증가하고, Aβ peptide가 침적된 신경반이 10-16개월령에 신피질과 해마에서 형성된다[16, 24, 42]. 본 연구에서는 비록 완전한 치매증상이 나타나는 6개월령 이상의 모델마우스를 사용하여 효능을 평가하진 못했지만 reserpine이 포유동물에서 효과적으로 작용 가능함을 제시하는 최초 연구로 의미가 매우 크다고 사료된다. 더불어 추가적인 연구에서는 6개월 이상의 모델동물을 이용함으로써 인간과 유사한 치매증상을 나타내는 모델동물에서 구체적인 효능과 기전에 대한 연구가 수행될 필요가 있다.
BFCNs의 기능과 형태는 대뇌 피질과 해마로부터 공급되는 NGF에 의존하는데 BFCNs 세포체에 NGF 공급이 줄어들면 축삭, 수상돌기와 같은 신경세포 표지물(neuronal marker)이 감소하게 되어 뇌수축이 유도된다[45]. 따라서 이러한 치매와 NGF의 상관관계에 기반하여 본 연구에서는 reserpine이 뇌조직에 미치는 영향을 NGF의 분비와 신호전달과정의 측면에서 관찰하였다. 이전에 보고된 일부 실험은 본 실험결과와 매우 유사하다.

제안 방법

따라서 본 연구에서는 30일 동안 reserpine을 치매모델동물로서 잘 알려진 Tg2576 마우스에 투여한 후 행동학적 변화, Aβ-42 peptide의 변화, NGF의 변화, NGF receptor 신호전달의 변화 등을 관찰하였다.
고정된 뇌는 탈수과정을 거친 뒤 파라핀을 이용하여 포매한 후 Leica microtome (Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA)를 이용하여 10 μm의 두께로 박절하였다.
먼저, 2마리의 마우스를 자유롭게 돌아다닐 수 있는 52×52×25 cm 크기의 상자에 넣고, 30분간 적응시킨 후 마우스를 실험 상자의 양 끝에 두고 20분간 행동을 관찰하였다.
PCR반응은 genomic DNA를 주형으로 95℃ (30 sec), 62℃ (30 sec), 72℃ (45 sec) 25 cycle로 APP 특이적인 primer (sense: 5’-CTG ACC ACT CGA CCA GGT TCT GGT T-3’, anti-sense: 5’-GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC CA-3’)을 이용하여 PCR 장치(Thermal Cycler T100, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, California, USA)에서 실시하였다.
본 실험에 사용된 Tg2576 마우스와 Non-Tg 마우스(B6SJLF1/J, 11주령, 20±5 g)는 샘타코바이오코리아(Osan, Korea)로부터 구매하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~ 20:00)로 SPF 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 22±2℃, 상대습도 50±10%)에서 사육하였다. 모든 마우스는 방사선 조사된 사료(Purina Mills Inc., Seongnam, Korea)를 자유급식 하도록 하였다. 또한 본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-IACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호:PNU-2011-000220)을 받아 수행되었다.
또한 본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-IACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인(승인번호:PNU-2011-000220)을 받아 수행되었다. 동물실험설계를 위해, 실험동물은 3개 그룹(Non-Tg 그룹, vehicle 투여 Tg2576 그룹, reserpine 투여 Tg2576 그룹)으로 분류하였고, Non-Tg 마우스는 그룹 당 5마리, Tg2576 마우스는 그룹당 4마리씩 배정하였다. Vehicle 투여 Tg2576 그룹이 증류수(0.
동물실험설계를 위해, 실험동물은 3개 그룹(Non-Tg 그룹, vehicle 투여 Tg2576 그룹, reserpine 투여 Tg2576 그룹)으로 분류하였고, Non-Tg 마우스는 그룹 당 5마리, Tg2576 마우스는 그룹당 4마리씩 배정하였다. Vehicle 투여 Tg2576 그룹이 증류수(0.3 ml)을 투여하는 동안, reserpine 투여 Tg2576 그룹은 reserpine (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 2 mg/kg으로 30일 동안(1회/3일) 복강투여 하였고, Non-Tg 그룹은 어떠한 처치도 하지 않았다. 투여가 완료된 후 모든 마우스는 Zoletil (VirBac, Carros, France)을 이용해서 마취하고, 혈액과 뇌조직을 적출하여 분석에 사용하였다.
Louis, MO, USA)을 2 mg/kg으로 30일 동안(1회/3일) 복강투여 하였고, Non-Tg 그룹은 어떠한 처치도 하지 않았다. 투여가 완료된 후 모든 마우스는 Zoletil (VirBac, Carros, France)을 이용해서 마취하고, 혈액과 뇌조직을 적출하여 분석에 사용하였다.
Tg2576 마우스와 Non-Tg 마우스를 확인하기 위해, PCR 증폭유전자산물은 마우스 꼬리로부터 얻은 genomic DNA를 주형으로 APP유전자 특이적인 primer를 이용하여 PCR을 통해 얻은 뒤 전기영동하여 확인하였다. 먼저, 마우스 꼬리를 1 cm정도 절단한 뒤 tail mix 용액(100 mM NaCl, 50 mM Tris, 2 mM EDTA, and 0.
5% SDS)과 proteinase K (20 mg/ml)를 첨가하여 56℃ 항온수조에서 밤새 처리하였다. 배양액으로부터 8 M KAc 용액과 chloroform 용액을 이용하여 단백질은 제거한 후 genomic DNA를 분리하였다. PCR반응은 genomic DNA를 주형으로 95℃ (30 sec), 62℃ (30 sec), 72℃ (45 sec) 25 cycle로 APP 특이적인 primer (sense: 5’-CTG ACC ACT CGA CCA GGT TCT GGT T-3’, anti-sense: 5’-GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGC CTA GAC CA-3’)을 이용하여 PCR 장치(Thermal Cycler T100, Bio-Rad Laboratories Inc.
, Hercules, California, USA)에서 실시하였다. 증폭된 PCR산물은 1% 아가로스겔에서 전기영동하고, UV-transilluminator에서 사이즈를 관찰하였다.
먼저, 2마리의 마우스를 자유롭게 돌아다닐 수 있는 52×52×25 cm 크기의 상자에 넣고, 30분간 적응시킨 후 마우스를 실험 상자의 양 끝에 두고 20분간 행동을 관찰하였다. 이때, 마우스가 보이는 행동 중 냄새맡기, 따라다니기, 기어다니기, 수동적 접촉 등은 사회적 상호작용으로 기록하고, 물기, 뛰기, 차기, 피하기/쫓기, 싸우기 등은 공격적 행동으로 기록하여 그 빈도를 합산하여 계산하였다.
마우스 뇌에 대한 면역조직화학염색은 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다[25, 41]. 먼저, 마우스를 CO₂가스로 마취한 후 PBS와 헤파린 혼합 용액으로 심장을 통해 관류시켜 전체조직의 혈액을 제거하였다. 혈액이 제거된 마우스의 뇌는 두개골을 분리시켜 채취하고, 포름알데히드에 48시간 동안 고정시켰다.
고정된 뇌는 탈수과정을 거친 뒤 파라핀을 이용하여 포매한 후 Leica microtome (Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA)를 이용하여 10 μm의 두께로 박절하였다. 박절된 조직의 면역염색을 실시하기 위하여 xylene과 ethanol에서 탈수과정을 거친 뒤, 3% H₂O₂에 10분간 배양하고 PBS로 세척한 후 10% BSA를 이용하여 blocking을 실시하였다. 여기에 anti-Aβ-42 antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 1% BSA를 1:100 농도로 희석한 용액을 첨가하여 밤새 처리 한 후에 이차 항체(biotinylated goat anti-rabbit IgG)와 HRP streptavidin (Histostain-Plus Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA)를 순차적으로 결합시켰다.
최종적으로 Aβ-42 peptide의 양은 stable 3,3’-diaminobenzidine (DAB, Invitrogen)을 이용하여 발색 반응을 유도한 후, BX50F-3 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
Tg2576 마우스에 Aβ-42 peptide의 침적양을 조사하기 위하여, slot blot analysis를 실시하였다.
Tg2576 마우스에 Aβ-42 peptide의 침적양을 조사하기 위하여, slot blot analysis를 실시하였다. 먼저, Tg2576 마우스와 Non-Tg 마우스의 뇌조직 100 mg을 PRO-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)에 첨가하여 glass homogenizer (Wheaton Industries, Millville, NJ, USA)를 이용하여 분쇄한 후, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량하였으며, 5 μg의 단백질을 slot blot에 사용하였다.
05% Tween-20)를 이용하여 제거하였다. 그리고 이차 항체인 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (GenTest, Woburn, MA, USA)를 실온에서 1시간 처리한 후 ECL Kit (Amersham Life Science)를 이용하여 발현양을 측정하였다.
분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량하였으며, 30-60 μg의 단백질을 western blot에 사용하였다. 먼저, 6-14% SDS-PAGE gel에 단백질을 전기영동 한 후 Enhanced Chemiluminescence (ECL) 막(Amersham Life Science)에 전이하고, 5% skim milk에서 1시간 동안 blocking을 실시하였다. 단백질이 전이된 막은 anti-beta actin antibody (Sigma-Aldrich), anti-presenilin-2 (PS-2) antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-anterior pharynx defective 1 (APH-1) antibody (Sigma-Aldrich), anti-nicastrin (NCT) antibody (Cell signaling Technology), anti-presenilin enhancer-2 (Pen-2) antibody (Santacruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) antibody (abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bcl-2-associated X (Bax) antibody (abcam), anti-tyrosine kinase receptor type 1 (TrkA) antibody (Cell Signaling Technology), anti-phospho-TrkA (pTrkA) antibody (Cell Signaling Technology), anti-RhoA antibody (Cell Signaling Technology), anti-p75 neurotrophin receptor (p75^NTR) antibody (Cell Signaling Technology), anti-serine/threonine protein kinase (Akt) antibody (Cell Signaling Technology), anti-phospho-Akt (pAkt) antibody (Cell signaling Technology), anti-extracellular signal-regulated kinase (ERK) antibody (Santacruz Biotechnology), anti-phospho ERK (pERK) antibody (Santacruz Biotechnology) 등의 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양한 후, HRP-conjugated된 secondary antibody를 첨가하고 ECL Kit를 이용하여 발현을 확인하였다.
Reserpine이 Aβ-42 peptide 형성을 촉진하는 γ-seceretase 구성단백질(PS-2, Pen-2, APH-1, NCT)에 미치는 영향을 알아보기 위해, 4가지 단백질의 발현 변화를 Tg2576 마우스의 뇌조직에서 Western Blot Analysis를 이용하여 분석하였다.
Reserpine이 뇌조직의 Aβ-42 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, Aβ-42 peptide의 양을 reserpine을 투여한 Tg2576 마우스의 뇌조직에서 면역조직화학염색, Dot Blot Analysis, ELISA를 이용하여 측정하였다.
Tg2576 치매모델동물에서, reserpine이 행동학적 변화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 마우스를 대상으로 사회적 상호작용시험을 실시하였다. 그 결과, 사회적 상호작용은 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹과 reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 유의적으로 크게 감소하였으나, 두 그룹 간의 차이는 없었다(Fig.
또한 reserpine 투여는 Aβ-42 형성 과정에 관여하는 γ-secretase components 중에 full length PS-2 단백질의 감소와, Pen-2와 APH-1 단백질의 회복을 유도하였다.
여기에 anti-Aβ-42 antibody (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 1% BSA를 1:100 농도로 희석한 용액을 첨가하여 밤새 처리 한 후에 이차 항체(biotinylated goat anti-rabbit IgG)와 HRP streptavidin (Histostain-Plus Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA)를 순차적으로 결합시켰다.
단백질이 전이된 막은 anti-beta actin antibody (Sigma-Aldrich), anti-presenilin-2 (PS-2) antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), anti-anterior pharynx defective 1 (APH-1) antibody (Sigma-Aldrich), anti-nicastrin (NCT) antibody (Cell signaling Technology), anti-presenilin enhancer-2 (Pen-2) antibody (Santacruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) antibody (abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Bcl-2-associated X (Bax) antibody (abcam), anti-tyrosine kinase receptor type 1 (TrkA) antibody (Cell Signaling Technology), anti-phospho-TrkA (pTrkA) antibody (Cell Signaling Technology), anti-RhoA antibody (Cell Signaling Technology), anti-p75 neurotrophin receptor (p75NTR) antibody (Cell Signaling Technology), anti-serine/threonine protein kinase (Akt) antibody (Cell Signaling Technology), anti-phospho-Akt (pAkt) antibody (Cell signaling Technology), anti-extracellular signal-regulated kinase (ERK) antibody (Santacruz Biotechnology), anti-phospho ERK (pERK) antibody (Santacruz Biotechnology) 등의 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양한 후, HRP-conjugated된 secondary antibody를 첨가하고 ECL Kit를 이용하여 발현을 확인하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 Tg2576 마우스와 Non-Tg 마우스(B6SJLF1/J, 11주령, 20±5 g)는 샘타코바이오코리아(Osan, Korea)로부터 구매하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~ 20:00)로 SPF 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 22±2℃, 상대습도 50±10%)에서 사육하였다.

데이터처리

모든 결과에서, p<0.05를 유의성이 있는 값으로 인정하였으며, 실험 결과는 means±SD로 제시하였고, 그래프의 값은 Non-Tg 그룹을 1로 설정하고 다른 그룹의 값을 상대적으로 비교하여 제시하였다.
Non-Tg 그룹과 Tg2576 그룹간에 유의성은 One way ANOVA (SPSS for Windows, Release 10.10, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였고, vehicle 투여 Tg2576 그룹과 reserpine 투여 Tg2576 그룹의 유의성은 post hoc test (SPSS for Windows, Release 10.10, Standard Version)를 이용하여 분석하였다. 모든 결과에서, p<0.
NGF 분비능과 신호전달과정에 미치는 reserpine의 영향을 평가하기 위하여, 마우스의 혈청에서 NGF 농도를 ELISA를 이용하여 측정하였고, 뇌조직에서 TrkA 신호전달과정과 p75^NTR 신호전달과정에 포함된 단백질의 변화를 Western Blot Analysis로 확인하였다. 그 결과, 혈청 내 NGF 농도는 Non-Tg 마우스와 비교하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 감소하였고, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 다시 증가하였다(Fig.

이론/모형

Tg2576 마우스의 활동성과 공격행동을 측정하기 위해 수행된 사회적 상호작용시험은 이전에 보고된 방법에 따라 실시하였다[18]. 먼저, 2마리의 마우스를 자유롭게 돌아다닐 수 있는 52×52×25 cm 크기의 상자에 넣고, 30분간 적응시킨 후 마우스를 실험 상자의 양 끝에 두고 20분간 행동을 관찰하였다.
마우스 뇌에 대한 면역조직화학염색은 이전에 보고된 방법에 따라 수행하였다[25, 41]. 먼저, 마우스를 CO₂가스로 마취한 후 PBS와 헤파린 혼합 용액으로 심장을 통해 관류시켜 전체조직의 혈액을 제거하였다.
분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량하였으며, 30-60 μg의 단백질을 western blot에 사용하였다.
마우스 뇌에서 Aβ-42의 농도는 Human Aβ-42 ELISA Kit (Invitrogen)를 이용하여 권장법에 따라 측정하였다.
분리된 단백질의 농도는 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON Biotechnology)을 이용하여 정량하였으며, 5 μg의 단백질을 slot blot에 사용하였다.
마우스 혈청에서 NGF의 농도는 ChemiKine Nerve Growth Factor, Sandwich ELISA Kit (Millipore, Bedford, MA, USA)를 구입하여 권장법에 따라 측정하였다. 먼저, ELISA Kit의 각 well에 각 마우스에서 추출한 혈청과 표준용액을 첨가하여 12시간 이상 배양하였다.
The concentration of Aβ-42 peptides in brain homogenate were measured with Dot blot assay (B) and Aβ-42 ELISA assay (D).

성능/효과

따라서, 이러한 결과는 reserpine이 γ-secretase의 구성단백질 발현양의 변화를 유도함으로써 Aβ-42 peptide의 생성에 영향을 미칠 수 있음을 제시하고 있다.
비록 두 가지 분석법에서 변화의 비율은 차이가 있었지만, Aβ-42 peptide 양은 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 유의적으로 증가하였고, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서는 감소되었다(Fig. 3).
먼저, 면역조직화학염색에서 Aβ-42 peptide는 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹의 해마부분(CA1-3, DG)에서 유의적으로 증가하였지만, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서는 다시 감소되었다(Fig. 2).
Tg2576 치매모델동물에서, reserpine이 행동학적 변화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 마우스를 대상으로 사회적 상호작용시험을 실시하였다. 그 결과, 사회적 상호작용은 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹과 reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 유의적으로 크게 감소하였으나, 두 그룹 간의 차이는 없었다(Fig. 1A). 한편, 공격적 행동은 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 유의적으로 2배정도 증가하였으나, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서는 Non-Tg 그룹 수준으로 감소하였다(Fig.
Reserpine이 Aβ-42 peptide 형성을 촉진하는 γ-seceretase 구성단백질(PS-2, Pen-2, APH-1, NCT)에 미치는 영향을 알아보기 위해, 4가지 단백질의 발현 변화를 Tg2576 마우스의 뇌조직에서 Western Blot Analysis를 이용하여 분석하였다. 그 결과, full length PS-2의 발현은 Non-Tg 그룹에 비하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 감소하였으며, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 더욱 감소하였다. 그러나 C-말단절편의 발현양은 reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 오히려 증가하였다.
신호전달과정에 포함된 단백질의 변화를 Western Blot Analysis로 확인하였다. 그 결과, 혈청 내 NGF 농도는 Non-Tg 마우스와 비교하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 감소하였고, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 다시 증가하였다(Fig. 5B). 또한, high affinity NGF receptor 신호전달과정에서, TrkA의 인산화는 Non-Tg 마우스와 비교하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 증가하였고, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 더욱 증가하였다(Fig.
또한, high affinity NGF receptor 신호전달과정에서, TrkA의 인산화는 Non-Tg 마우스와 비교하여 vehicle 투여 Tg2576 그룹에서 증가하였고, reserpine 투여 Tg2576 그룹에서 더욱 증가하였다(Fig. 5D).
앞선 결과와는 다르게 본 실험에서는 마우스에 reserpine을 투여한 결과 Aβ-42 peptide의 농도 및 해마에서의 축적이 감소되었다.
따라서, 본 연구에서는 reserpine이 γ-secretase 복합체 구성단백질에 미치는 영향을 평가하기 위하여 Tg2576 마우스의 뇌조직을 이용하여 western blot을 실시하였다. 결과에서 보여주는 것처럼, reserpine은 Tg2576 마우스에서 증가된 Pen-2와 APH-1 단백질의 발현을 회복시켜주는 효과가 있었다. 이러한 결과는 비록 reserpine은 다른 γ-secretase 구성 단백질의 발현에도 영향을 주지만, 특히 Pen-2의 발현조절을 통해 γ-secretase의 활성을 조절할 가능성이 있음을 시사하고 있다.
하지만 NGF mRNA와 NGF 단백질은 각각 24시간, 36시간 후에 정상 수준으로 돌아왔다. 본 실험에서는 30일 동안 지속적으로 Tg2576 마우스에 reserpine을 투여하였고, 그 결과 NGF 단백질의 양이 Non-Tg 수준으로 회복되었다.
특히, TrkA의 intracellular domain은 APP C-terminal과 상호작용을 통해 세포 내 신호전달과정을 조절한다[21]. 본 연구에서 TrkA는 reserpine 투여 후 정상 대조군에 비해 약 2배 증가하였으며, 이러한 신호는 Akt로 전달되어 세포생존을 증가시켰다. 한편, 낮은 친화력을 갖는 low affinity receptor는 p75^NTR로서 G-protein receptor 그룹에 속하며, 세포질부위에 chopper domain과 death domain을 갖고 있으며, RhoA를 거쳐 Bcl-2/Bax의 발현을 조절한다[12, 17].
또한, p75^NTR은 γ-secretase와 β-secretase에 의해 절단되어 세포질에 RhoA의 증가를 유도한다[21]. 본 연구에서 reserpine 투여로 인해 p75^NTR 발현이 증가하였으며, 이러한 신호는 Bcl-2로 전달되어 최종적으로 anti-apoptosis 효과를 나타내었다.

후속연구

본 연구에서는 비록 완전한 치매증상이 나타나는 6개월령 이상의 모델마우스를 사용하여 효능을 평가하진 못했지만 reserpine이 포유동물에서 효과적으로 작용 가능함을 제시하는 최초 연구로 의미가 매우 크다고 사료된다. 더불어 추가적인 연구에서는 6개월 이상의 모델동물을 이용함으로써 인간과 유사한 치매증상을 나타내는 모델동물에서 구체적인 효능과 기전에 대한 연구가 수행될 필요가 있다.
이상의 결과에서 살펴본 바와 같이, 본 연구는 reserpine이 Tg2576 마우스 모델에서 행동학적 변화, Aβ-42 축적감소, NGF 분비증가, NGF 신호전달변화 등 치매질환의 개선 효과를 제시하고 있어 향후 알츠하이머를 치료할 수 있는 효과적인 치료제로서의 가능성을 보여주고 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Alzheimer’s Disease란?	Alzheimer’s Disease (AD)는 인지기능의 저하와 행동장애 등의 임상적 특징을 나타내는 신경퇴행성 질환이다[19]. AD 환자의 뇌에는 비정상 단백질의 축적이 발견되어, 주로 학습이나 기억 능력과 관계있는 해마 부위에서 노인성 반점 (senile plaques)과 tau 단백질의 과인산화된 응집체 (hyperphosphorylated aggregates) 형태로 존재한다[2, 5, 52, 55].
	amyloid beta (Aβ) peptide는 어떻게 만들어 집니까?	AD 환자의 뇌에는 비정상 단백질의 축적이 발견되어, 주로 학습이나 기억 능력과 관계있는 해마 부위에서 노인성 반점 (senile plaques)과 tau 단백질의 과인산화된 응집체 (hyperphosphorylated aggregates) 형태로 존재한다[2, 5, 52, 55]. 이러한 질병의 원인이 되는 amyloid beta (Aβ) peptide는 amyloid precursor protein (APP)이 β-secretase와 γ-secretase의 연속적인 절단에 의해 Aβ-40와 Aβ-42로 생성된다[9]. 정상 뉴런에서는 APP가 α-secretase에 의해 절단되며, 생성된 Aβ는 뉴런이 과도하게 전기적으로 흥분되었을 때, 억제적 되먹임(negative feedback)을 통하여 시냅스의 기능이 항상성을 유지하도록 작용하지만[27], AD가 진행되는 과정에서는 항상성이 유지되지 못하고, Aβ-42 peptide가 비정상적으로 과생산되어 반점(plaque)을 형성하여 조직에 축적된다[11].
	Alzheimer’s Disease의 원인이 되는 펩타이드는 무엇입니까?	AD 환자의 뇌에는 비정상 단백질의 축적이 발견되어, 주로 학습이나 기억 능력과 관계있는 해마 부위에서 노인성 반점 (senile plaques)과 tau 단백질의 과인산화된 응집체 (hyperphosphorylated aggregates) 형태로 존재한다[2, 5, 52, 55]. 이러한 질병의 원인이 되는 amyloid beta (Aβ) peptide는 amyloid precursor protein (APP)이 β-secretase와 γ-secretase의 연속적인 절단에 의해 Aβ-40와 Aβ-42로 생성된다[9]. 정상 뉴런에서는 APP가 α-secretase에 의해 절단되며, 생성된 Aβ는 뉴런이 과도하게 전기적으로 흥분되었을 때, 억제적 되먹임(negative feedback)을 통하여 시냅스의 기능이 항상성을 유지하도록 작용하지만[27], AD가 진행되는 과정에서는 항상성이 유지되지 못하고, Aβ-42 peptide가 비정상적으로 과생산되어 반점(plaque)을 형성하여 조직에 축적된다[11].

참고문헌 (58)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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