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문제 정의
- 본 연구에서는 유용 미생물의 한방제제로서의 활용가능성을 알아보고자 전통 발효식품인 젓갈로부터 미생물의 분리 및 동정을 시도하였다. 분리된 미생물의 장내 생존성 등 프로바이오틱스 로서의 사용 가능성을 조사하였으며, 활용방안의 일환으로 상기 세균이 포함된 생균 白朮散加味方을 제조하여 그 특성을 규명하였다.
- 0 이상으로 보고되어 있다12). 따라서본 연구에서 분리한 균주는 높은 내산성을 나타내 위에서 생존하여 소장으로 이동할 수 있다는 가능성을 제시하였다. 정장작용 등 여러 가지 기능을 지닌 생균으로서 정상적인 기능을 수행하기 위해서는 췌장에서 분비되는 담즙에 내성을 지녀 생존한 상태로 장관에 도달하여야 한다.
- 본 연구에서 제조한 생균 한방소화제의 효능을 검증하기 위하여 시판 중인 한방소화제와 비교하여 소화효소의 활성, 소화제에 존재하는 생균의 수를 조사하였다. 생균 한방소화제와 일반 한방소화제 1 g을 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한후 상등액을 얻어 0.
제안 방법
- ZYM kit에 현탁액을 65 μl씩 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후에 색깔의 변화를 관찰함으로써 효소의 활성도를 조사한다.
- 본 연구에서는 유용 미생물의 한방제제로서의 활용가능성을 알아보고자 전통 발효식품인 젓갈로부터 미생물의 분리 및 동정을 시도하였다. 분리된 미생물의 장내 생존성 등 프로바이오틱스 로서의 사용 가능성을 조사하였으며, 활용방안의 일환으로 상기 세균이 포함된 생균 白朮散加味方을 제조하여 그 특성을 규명하였다.
- 1차적으로 무작위 선발법을 이용하여 미생물을 분리한 후에, 내생포자를 형성하는 미생물을 최종적으로 선발하였다. 분리한 균주를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자서열과 형태학적, 생화학적 특성 등을 조사하였다. 분리한 균주의 형태학적인 특징은 그람염색을 하여 현미경으로 관찰하며, 생화학적 특성은 API50CHL kit (BioMerieux) 등을 사용하여 조사하였다.
- 분리한 균주를 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자서열과 형태학적, 생화학적 특성 등을 조사하였다. 분리한 균주의 형태학적인 특징은 그람염색을 하여 현미경으로 관찰하며, 생화학적 특성은 API50CHL kit (BioMerieux) 등을 사용하여 조사하였다. Genomic DNA extraction kit (Qiagen)을 이용하여 분리한 균주의 genomic DNA를 추출한 후 16S rDNA 증폭을 위한 universal primer (27F/1492R)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
- 분리한 균주의 형태학적인 특징은 그람염색을 하여 현미경으로 관찰하며, 생화학적 특성은 API50CHL kit (BioMerieux) 등을 사용하여 조사하였다. Genomic DNA extraction kit (Qiagen)을 이용하여 분리한 균주의 genomic DNA를 추출한 후 16S rDNA 증폭을 위한 universal primer (27F/1492R)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제한 후, ㈜ 솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석한다.
- Genomic DNA extraction kit (Qiagen)을 이용하여 분리한 균주의 genomic DNA를 추출한 후 16S rDNA 증폭을 위한 universal primer (27F/1492R)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제한 후, ㈜ 솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석한다. 분석한 염기서열을 NCBI database에 수록된 진정세균의 염기서열과 유사도를 비교하였다.
- PCR 산물을 정제한 후, ㈜ 솔젠트에 의뢰하여 염기서열을 분석한다. 분석한 염기서열을 NCBI database에 수록된 진정세균의 염기서열과 유사도를 비교하였다.
- 배양된 균체는 원심분리하여 회수한 후, 인공위액을 동량으로 첨가하여 30 ℃에서 3시간 배양하였다. 배양 후 생균수를 측정하여 인공위액에 대한 저항성을 조사하였다.
- 인공 담즙액11)은 MRS 액체배지에 1% pancreatin을 첨가하여 멸균한 후 여과 멸균된 10% oxgall 용액을 배지의 1% 농도로 첨가하여 pH를 6.8로 조정하여 사용하였다. 분리된 균주를 인공 위액에서 3시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다.
- 8로 조정하여 사용하였다. 분리된 균주를 인공 위액에서 3시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 인공 담즙액을 동량으로 첨가하여 30℃에서 24시간 배양하면서 일정시간 간격으로 생균수를 측정하였다.
- 분리된 균주를 인공 위액에서 3시간 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하였다. 인공 담즙액을 동량으로 첨가하여 30℃에서 24시간 배양하면서 일정시간 간격으로 생균수를 측정하였다.
- 일정량의 肉桂, 甘草, 乾薑, 麥芽(炒), 白荳蔲, 白茯苓, 白朮, 砂仁(炒), 山楂肉, 神麴, 龍腦, 枳實, 草果, 香附子, 丁香, 禕撥, 白檀香, 陳皮, 薄荷腦의 한약재를 미세 분말화한 후 분리한 균주 배양액 (108 CFU/ml)을 10% 첨가하여 제환기를 이용하여 소화제를 제조하였다. 분리한 균주를 NB 배지에 접종한 후 250rpm, 37℃의 배양조건으로 16시간 배양하여 배양액으로 사용하였다.
- 본 연구에서 제조된 생균 한방소화제와 일반 한방소화제 1 g 을 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한 후 상등액을 얻어 0.5% NaCl, 0.3% peptone, 0.3% skim milk가 첨가된 Nutrient Agar 배지에 0.1 ml씩 접종하여 형성되는 clear zone의 유무 및 크기를 관찰하여 단백질 분해 효소의 활성을 측정하였다. 탄수화물 분해 효소의 활성은 동일한 방법으로 얻은 상등액을 0.
- 1 ml씩 접종하여 형성되는 clear zone의 유무 및 크기를 관찰하여 단백질 분해 효소의 활성을 측정하였다. 탄수화물 분해 효소의 활성은 동일한 방법으로 얻은 상등액을 0.5% NaCl, 1.0% peptone, 0.3% soluble starch가 첨가된 Nutrient Agar 배지에 접종하여 배양한 후 그람 요오드 용액을 첨가하여 형성되는 clear zone의 유무 및 크기를 관찰하여 탄수화물 분해효소의 활성을 측정하였다. 소화제에 존재하는 생균수는 각각의 한방소화제 1 g을 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한 후 상등액을 취해 연속 희석한 후 0.
- 1 ml씩 취하여 Nutrient Agar 배지에 도말하여 배양하였다. 배양 후 나타나는 세균의 군집을 계수하여 생균수를 측정하였다.
- 세균 균집을 선택하여 희석 평판도말법을 사용하여 순수분리한 후 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다.
- 세균 균집을 선택하여 희석 평판도말법을 사용하여 순수분리한 후 그람염색을 행하여 세균의 형태적 특징과 그람반응을 관찰하였다. 동시에 PCR 방법을 사용하여 16S rDNA 유전자를 증폭한 후 염기서열을 분석하여 최종 동정을 하였다. 순수 분리된 세균은 1 종으로 그람양성이었으며, 간균(bacillus)이었다.
- 정장작용 등 여러 가지 기능을 지닌 생균으로서 정상적인 기능을 수행하기 위해서는 췌장에서 분비되는 담즙에 내성을 지녀 생존한 상태로 장관에 도달하여야 한다. 담즙에 대한 내성을 조사하기 위해 실제 장내의 담즙의 농도인 0.6 g/L 보다 높은 농도의 oxgall을 처리하여 생존율을 조사하였다. 분리된 균주를 인공위액에서 3시간 배양한 후 1.
- 프로바이오틱스로서의 사용 가능성을 알아보고자 젓갈로부터 한 종의 세균을 분리하여 각종 형태학적 및 생화학적 방법을 사용하여 일차 동정하였으며 최종적으로 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Bacillus megaterium KS12 (유사도 99%)로 동정하였다. 분리한 균주는 인공위액에서 3시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기 세균 수의 14.
대상 데이터
- 본 실험의 시료인 白朮散加味方은 오래동안 전래되어 내려온 경험방인 까닭에 문헌적 출처를 찾기는 어려우나 현재 여러 한의원에서 공동으로 활용하고 있는 한방 소화제이다. 강제적으로 위장운동을 강화시키거나 단순한 분해 효소로 제조된 양방 소화제와는 달리 위 기능을 근본적으로 활성화시킴으로써 소화기능을 회복시키는 임상 활용방으로 19종의 한약으로 구성되어 있다.
이론/모형
- 인공위액은 Kobayashi 등10)의 방법에 따라 1N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체배지에 pepsin 1,000 unit/ml 를 첨가하여 사용하였다. 분리된 균주를 NB 배지에 접종한 후 250rpm, 37℃의 배양조건으로 16시간 배양하였다.
성능/효과
- 진정세균 영역 (Eubacteria domain)에 속하는 세균 16S rDNA의 공통적인 서열을 인지하는 프라이머인 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3')을 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 후 DNA의 염기서열을 결정한 결과, Bacillus megaterium의 16S ribosomal RNA 염기서열과 99% 유사도 (1431/1432 bp)를 보였으며 이를 근거로 분리된 세균을 B. megaterium KS12로 동정하였다(Fig. 1).
- API ZYM kit를 사용하여 각종 효소의 활성도를 조사한 결과 (Table 3), 본 균주는 탄소수가 8개인 지방산을 분해하는 esterase 활성을 지니고 있었으며 단백질 분해 효소의 일종인 α-chymotrypsin 활성을 지니고 있었다.
- 분리 동정된 B. megaterium의 각종 탄수화물 분해능을 조사한 결과 glycerol과 단당류인 glucose 및 fructose, 이당류인 cellobiose, maltose, saccharose, trehalose의 분해능이 우수하였다. 중합체 중에서는 starch에서만 분해능이 나타났다(Table 2).
- 미생물이 소화 및 정장작용을 수행하기 위해서는 우선 소화 관내에서 생존하여야 하며 섭취된 미생물이 장에 도달하기 위해서는 강산성인 위액과 십이지장에서 분비되는 담즙에 대한 내성을 지니고 있어야 한다. 분리한 균주는 인공위액에서 3시간이 지난 후 (0.36 X 108 CFU/ml)에도 사멸하지 않고 초기 세균 수 (2.5 X 108 CFU/ml)의 14.4 %를 유지하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 순수한 위액의 pH는 2.
- 6 g/L 보다 높은 농도의 oxgall을 처리하여 생존율을 조사하였다. 분리된 균주를 인공위액에서 3시간 배양한 후 1.0%의 oxgall이 함유된 인공담즙을 처리하였을 때 24시간 후에도 초기 세균 수의 약 14 % (0.35 X 108 CFU/ml)에 해당하는 세균이 생존하여 높은 담즙액 내성을 나타내었다 (Fig. 3). 기존에 프로바이오틱스로 연구된 Lactobacillus sp.
- 기존에 프로바이오틱스로 연구된 Lactobacillus sp. FF-313), Leuconostoc kimchii GJ2, L. citreum C3 및 L. mesenteroides C11 등의 균주가 인공담즙액에서의 생존율이 10% 내외13-15)인 점을 고려한다면 본 연구에서 분리한 세균이 내산성과 담즙액에 대한 내성을 동시에 나타내어 프로바이오틱스로서의 기능을 고루 갖춘 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 제조한 생균 한방소화제의 효능을 검증하기 위하여 시판 중인 한방소화제와 비교하여 소화효소의 활성, 소화제에 존재하는 생균의 수를 조사하였다. 생균 한방소화제와 일반 한방소화제 1 g을 PBS 완충용액 10 ml에 녹여 원심분리한후 상등액을 얻어 0.1 ml씩 접종한 결과, 두 소화제에서 모두 clear zone이 형성되어 단백질 분해효소의 활성이 있음을 알 수 있었다 (Fig. 4). 그러나 생균 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기가 기존 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기에 비해 6배 이상 크게 나타나 단백질 분해능이 매우 우월한 것으로 판단된다.
- 4). 그러나 생균 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기가 기존 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기에 비해 6배 이상 크게 나타나 단백질 분해능이 매우 우월한 것으로 판단된다. 탄수화물 분해능 또한 기존 한방소화제에는 활성이 거의 없는 것에 비해 생균 한방소화제에는 높은 활성이 나타나(Fig.
- 그러나 생균 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기가 기존 한방소화제 상등액 처리구에서 형성된 clear zone의 크기에 비해 6배 이상 크게 나타나 단백질 분해능이 매우 우월한 것으로 판단된다. 탄수화물 분해능 또한 기존 한방소화제에는 활성이 거의 없는 것에 비해 생균 한방소화제에는 높은 활성이 나타나(Fig. 5) 생균 한방소화제가 일반 한방소화제에 비해 더 우수한 소화 작용을 할 가능성이 높을 것으로 판단된다.
- 두 한방소화제에 존재하는 생균수를 조사한 결과 기존 한방 소화제에서는 거의 존재하지 않는 것으로 (4.5 CFU/g) 나타났으며 생균 한방소화제에는 3.2 X 107 CFU/g의 생균이 존재하는 것으로 나타나 생균 한방소화제에 매우 많은 생균이 존재하여 정장작용에 매우 유리할 것으로 판단되었다(Fig. 6).
- 프로바이오틱스로서의 사용 가능성을 알아보고자 젓갈로부터 한 종의 세균을 분리하여 각종 형태학적 및 생화학적 방법을 사용하여 일차 동정하였으며 최종적으로 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Bacillus megaterium KS12 (유사도 99%)로 동정하였다. 분리한 균주는 인공위액에서 3시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기 세균 수의 14.4%를 유지하는 것으로 나타났으며, 인공담즙을 처리하였을 때 24시간 경과 후 약 14%에 해당하는 세균이 생존하여 높은 담즙액 내성을 나타내었다. 상기 균주를 첨가하여 제조한 생균 한방소화제와 일반 한방소화제에 비해 단백질 분해능은 6배 이상 높게 나타났으며 탄수화물 분해능도 매우 높은 것으로 나타났다.
- 4%를 유지하는 것으로 나타났으며, 인공담즙을 처리하였을 때 24시간 경과 후 약 14%에 해당하는 세균이 생존하여 높은 담즙액 내성을 나타내었다. 상기 균주를 첨가하여 제조한 생균 한방소화제와 일반 한방소화제에 비해 단백질 분해능은 6배 이상 높게 나타났으며 탄수화물 분해능도 매우 높은 것으로 나타났다. 또한 기존 한방소화제에 비해 생균 한방소화제에 많은 생균이 존재하는 것으로 나타났다.
- 상기 균주를 첨가하여 제조한 생균 한방소화제와 일반 한방소화제에 비해 단백질 분해능은 6배 이상 높게 나타났으며 탄수화물 분해능도 매우 높은 것으로 나타났다. 또한 기존 한방소화제에 비해 생균 한방소화제에 많은 생균이 존재하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과 기존 한방 제제에 프로바이오틱스가 첨가될 경우 한방제제의 효과가 개선될 가능성이 있음을 알 수 있었으며, 전통 발효식품에 존재하는 프로바이오틱스에 대한 심도 깊은 연구가 이루어질 경우 이를 사용한 기능성 한방제제의 개발 및 한방제제의 효과 상승 등 활용가능성이 매우 높을 것으로 판단된다.
- 또한 기존 한방소화제에 비해 생균 한방소화제에 많은 생균이 존재하는 것으로 나타났다. 본 연구 결과 기존 한방 제제에 프로바이오틱스가 첨가될 경우 한방제제의 효과가 개선될 가능성이 있음을 알 수 있었으며, 전통 발효식품에 존재하는 프로바이오틱스에 대한 심도 깊은 연구가 이루어질 경우 이를 사용한 기능성 한방제제의 개발 및 한방제제의 효과 상승 등 활용가능성이 매우 높을 것으로 판단된다.
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