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문제 정의
- 본 연구는 식물 병원성 진균에 항균 활성을 나타내는 Bacillus 속을 야생멧돼지에서 분리·동정하고 식물병원균에 대한 생물농약으로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 96 well microtiter plate에 미네랄오일을 100 μl를 넣은 다음 시료10 μl를 처리하고 2분 후 해부 현미경에서 증류수 처리한 것과 drop의 크기를 비교하여 생물계면활성제 양성으로 판별하였다.
- B. atrophaeus MPL-01을 TSB에 1% (v/v)가 되도록 접종하고 30℃에서 3일간 진탕 배양한 뒤, 원심분리(6,000 × g, 20분) 후 상층을 회수하였다.
- PDA 한천배지(potato dextrose agar, Difco)에 3일간 배양된 식물 병원균 한천 블록(0.5 cm × 0.5 cm)을 올려 놓은 다음, B. atrophaeus MPL-01를 TSB (tryptic soy broth, Merck) 배지에서 30℃ 72시간 배양 후 배양액 40 μl를 직경 6 mm의 여과지 위에 점적, 25℃ 6일간 배양하여 형성된 생장억제환을 기준으로 항진균 활성을 측정하였다.
- , 2010). 그리고 추출액의 생물계면활성를 확인하기 위하여 oil drop collapse 방법을 변형하여 시행하였다(Bodour and Miller-Maier, 1998; Kermanshahi and Peymanfar, 2012). 96 well microtiter plate에 미네랄오일을 100 μl를 넣은 다음 시료10 μl를 처리하고 2분 후 해부 현미경에서 증류수 처리한 것과 drop의 크기를 비교하여 생물계면활성제 양성으로 판별하였다.
- 본 연구는 식물 병원성 진균에 항균 활성을 나타내는 Bacillus 속을 야생멧돼지에서 분리·동정하고 식물병원균에 대한 생물농약으로서의 가능성을 알아보고자 하였다. 먼저 야생멧돼지 장내에서 세균을 순수 분리한 후, 여러 식물 병원성 진균을 대상으로 길항력을 확인하였다. 주사전자현미경(Hitachi S4300 FESEM, Japan)으로 분리균의 형태와 크기를 관찰하였고 16S rRNA 염기서열을 분석하였다.
- 멧돼지 대장에서 MPL-01 균주를 분리하여 균주의 형태학적, 생리·생화적 특성 및 지방산 조성을 분석하여 Bacillus임을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과 MPL-01 균주는 Bacillus atrophaeus와 거의 일치하므로(99.
- MPL-01 균주는 고추 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutatum에 대하여 가장 강한 항진균 활성을 나타내었다. 배양액의 ethyl acetate 추출액에서 항진균 활성은 물론이고 계면활성도 확인하였다. 그러므로 B.
- 이러한 생리, 화학적 분류와 함께 계통분류를 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 분리균의 genomic DNA 추출은 DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, USA)를 사용하여 수행되었다. 16S rRNA 유전자는 universal primer로써 27F (5′-AGAG TTTGATCCTG GCTCAG)와, 1492R (5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′)를 사용한 PCR을 통하여 증폭하여 1,448 bp 산물을 얻었다.
- 1). 분리균의 균체 지방산 조성 분석을 위하여 비교균주인 B. atrophaeus KCCM 11495와 함께 TSA 배지에서 30℃, 48시간 배양한 대수기의 균체를 회수하여 비누화 과정과 메틸화 시킨 후 추출하여 기체크로마토그라피(Agilent technologies 5890, USA), Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Inc., USA)을 이용하여 분석하였다. 지방산 분석결과 15:0 iso는 18.
- gloeosporiodes가 풋고추와 홍고추에 직접적으로 피해를 주는 것으로 알려져 있다. 이들을 대상으로 항진균 활성을 측정하고자 배양액으로부터 항생물질을 부분 정제하였다. B.
- subtilis에 속하는 것으로 분류되었다(99%)(Table 2). 이러한 생리, 화학적 분류와 함께 계통분류를 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 분리균의 genomic DNA 추출은 DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, USA)를 사용하여 수행되었다.
- 이어서 분리균주 MPL-01의 항균활성을 측정하였다. PDA 한천배지(potato dextrose agar, Difco)에 3일간 배양된 식물 병원균 한천 블록(0.
- 주사전자현미경(Hitachi S4300 FESEM, Japan)으로 분리균의 형태와 크기를 관찰하였고 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 이와 함께 균체의 지방산분석 및 생리화학적 분석을 통하여 균을 동정하였으며, 여러 식물병원 진균 중에서 특히 고추 탄저균에 대한 뛰어난 길항력을 확인하였고, 이와 관련된 물질 중의 하나인 생물계면활성제 생산을 확인하였다.
- 이와 함께 분리균주를 TSA에 배양·희석 후 API 50CH와 API 20E 검사키트를 이용하여 생화학적 동정을 완료하였다.
- 먼저 야생멧돼지 장내에서 세균을 순수 분리한 후, 여러 식물 병원성 진균을 대상으로 길항력을 확인하였다. 주사전자현미경(Hitachi S4300 FESEM, Japan)으로 분리균의 형태와 크기를 관찰하였고 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 이와 함께 균체의 지방산분석 및 생리화학적 분석을 통하여 균을 동정하였으며, 여러 식물병원 진균 중에서 특히 고추 탄저균에 대한 뛰어난 길항력을 확인하였고, 이와 관련된 물질 중의 하나인 생물계면활성제 생산을 확인하였다.
- 특히 질소원을 함유하는 배지에서 배양 2–5일에 검정색소를 생성하는 B. atrophaeus 특유의 특성을 나타내었다(자료 미제시).
대상 데이터
- 2008년 12월 경남 거창의 야산에서 포획된 수컷의 대장 내부에서 채취된 시료를 생리식염수(0.85%)에 희석한 다음 80℃ 항 온기에서 10분간 중탕 한 후 희석하여 nutrient agar (NA)에 도말, 30℃에서 24시간 배양 후 자란 단일 집락에서 식물병원성 진균에 대해 길항력을 보이는 균을 분리하였다. 분리균의 형태와 크기를 조사하기 위해 주사전자현미경 관찰 결과, 균은 전형적인 간균이었으며 그 크기는 0.
성능/효과
- 멧돼지 대장에서 MPL-01 균주를 분리하여 균주의 형태학적, 생리·생화적 특성 및 지방산 조성을 분석하여 Bacillus임을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과 MPL-01 균주는 Bacillus atrophaeus와 거의 일치하므로(99.99%) B. atrophaeus MPL-01로 명명하였다. MPL-01 균주는 고추 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutatum에 대하여 가장 강한 항진균 활성을 나타내었다.
- , 1990), 분리균주 MPL-01의 생물계면활성제 생산 여부를 확인하였다. 5% (v/v)의 양적혈구가 첨가된 blood agar에 접종 후 30℃, 24시간 배양한 다음 분리균 집락 주변에 투명환이 형성됨을 확인하였다(Fig. 4). 이것은 생물계면활성제에 의한 적혈구 용혈활성 (hemolytic activity)으로 이전의 결과들과 일치한다(Zaragoza et al.
- 회수된 상층 배양액을 같은 양의 ethyl acetate와 혼합하여 항진균 물질을 추출한 다음 감압 농축하여 methanol에 녹여서 실험에 사용하였다. Ethyl acetate 추출물에 의해서 C. acutatum과 C. gloeosporiodes의 생장이 억제된 것을 확인하였다(Fig. 3).
- 96 well microtiter plate에 미네랄오일을 100 μl를 넣은 다음 시료10 μl를 처리하고 2분 후 해부 현미경에서 증류수 처리한 것과 drop의 크기를 비교하여 생물계면활성제 양성으로 판별하였다. Ethyl acetate 추출원액은 오일전체에 유화되었으며 1000배 희석한 시료에서도 대조군인 물보다 drop 크기가 커져있어 많이 유화되었음을 보였다(Fig. 5). 이것은 이전에 보고된 유산균 배양액의 계면활성 보다 높은 것으로서 분리균주 MPL-01은 우수한 계면활성제 생산균으로 여겨진다(Kermanshahi and Peymanfar, 2012).
- 16S rRNA 유전자는 universal primer로써 27F (5′-AGAG TTTGATCCTG GCTCAG)와, 1492R (5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′)를 사용한 PCR을 통하여 증폭하여 1,448 bp 산물을 얻었다. Genotech (Korea)에 의뢰하여 이에 대한 염기서열을 결정하고 GenBank BlastN 결과 분리균주 MPL-01은 B. atrophaeus KCCM 11495와 99.99%의 상동성을 보였다. 또한 neighbor-joining method에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과 B.
- atrophaeus MPL-01로 명명하였다. MPL-01 균주는 고추 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutatum에 대하여 가장 강한 항진균 활성을 나타내었다. 배양액의 ethyl acetate 추출액에서 항진균 활성은 물론이고 계면활성도 확인하였다.
- atrophaeus MPL-01를 TSB (tryptic soy broth, Merck) 배지에서 30℃ 72시간 배양 후 배양액 40 μl를 직경 6 mm의 여과지 위에 점적, 25℃ 6일간 배양하여 형성된 생장억제환을 기준으로 항진균 활성을 측정하였다. 고추 탄저병(Colletotrichum acutatum)에 대하여 15 mm의 가장 높은 항진균 활성을 보였고, 벼 도열병(Magnaporthe grisea), 배추 시들음병(Fusarium oxysporum), 밤나무 검은무늬병(Alternaria alternate), 딸기 잿빛곰팡이병(Botris cinerea) 순으로 항진균 활성을 나타내었다(Table 3).
- 이와 함께 분리균주를 TSA에 배양·희석 후 API 50CH와 API 20E 검사키트를 이용하여 생화학적 동정을 완료하였다. 그 결과 분리균주 MPL-01은 B. subtilis로 분류되었고(99.9%), 비교 균주인 B. atrophaeus KCCM 11495 역시 B. subtilis에 속하는 것으로 분류되었다(99%)(Table 2). 이러한 생리, 화학적 분류와 함께 계통분류를 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
- 99%의 상동성을 보였다. 또한 neighbor-joining method에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과 B. subtilis과는 분리된 독립적인 B. atrophaeus taxon에 속하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 따라서 분리균주 MPL-01를 B.
- 본 실험에서도 생리·생화학적 분류방법에 따르면 B. atrophaeus MPL-01와 B. atrophaeus KCCM 11495 모두 B. subtilis로 분류되었으나 16S rRNA 유전자 서열과 특유의 검정색소 생산을 고려하면 B. atrophaeus로 명명하는 것이 적절하다고 생각된다.
- 분리균의 형태와 크기를 조사하기 위해 주사전자현미경 관찰 결과, 균은 전형적인 간균이었으며 그 크기는 0.8 µm × 3.2 µm로 확인되었다(Fig. 1).
- , USA)을 이용하여 분석하였다. 지방산 분석결과 15:0 iso는 18.0%, 15:0 anteiso는 45.72%, 16:0 iso는 3.76%, 17:0 iso는 7.83% 그리고 17:0 anteiso는 14.68%로 구성되어 표준 균주인 B. atrophaeus KCCM 11495와 유사한 양상을 나타내었다(Table 1). 이와 함께 분리균주를 TSA에 배양·희석 후 API 50CH와 API 20E 검사키트를 이용하여 생화학적 동정을 완료하였다.
후속연구
- 배양액의 ethyl acetate 추출액에서 항진균 활성은 물론이고 계면활성도 확인하였다. 그러므로 B. atrophaeus MPL-01은 농작물 병원성 곰팡이 제어를 위한 bio-control 개발에서 유용하게 사용될 것이다.
- 그러므로 본 실험에서 분리된 B. atrophaeus MPL-01는 고추탄저병 진균을 비롯한 여러 식물병원균에 대하여 항진균 활성을 나타내며 동시에 생물계면활성제를 생산하므로 친환경적 미생물 농약으로 개발될 가능성이 크다고 할 수 있다. 앞으로 이 균주가 생산하는 항진균 물질을 분리 정제하고, 구조 분석 등의 추가적인 연구를 수행하며, 항진균 물질과 계면활성제가 동일 물질임을 밝혀야 할 것이다.
- atrophaeus MPL-01는 고추탄저병 진균을 비롯한 여러 식물병원균에 대하여 항진균 활성을 나타내며 동시에 생물계면활성제를 생산하므로 친환경적 미생물 농약으로 개발될 가능성이 크다고 할 수 있다. 앞으로 이 균주가 생산하는 항진균 물질을 분리 정제하고, 구조 분석 등의 추가적인 연구를 수행하며, 항진균 물질과 계면활성제가 동일 물질임을 밝혀야 할 것이다.
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