[논문]카드뮴과 구리에 노출된 Rhizophora stylosa 의 phytochelatin synthase 1 유전자 클로닝 및 발현

이건섭; 황진익; 박미례; 정영재; 이택견

doi:10.5762/kais.2013.14.6.3114

카드뮴과 구리에 노출된 Rhizophora stylosa 의 phytochelatin synthase 1 유전자 클로닝 및 발현
Cloning and Expression of Phytochelatin Synthase 1 Gene from Rhizophora stylosa Exposed to Cadmium and Copper 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.14 no.6, 2013년, pp.3114 - 3119

이건섭 (한국해양과학기술원 남해특성연구부) , 황진익 (한국해양과학기술원 남해특성연구부) , 박미례 (한국해양과학기술원 남해특성연구부) , 정영재 (신경대학교 생명공학과) , 이택견 (한국해양과학기술원 남해특성연구부)

초록
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망그로브 생태계는 수생태계로 유입되는 중금속을 받아들이는 기능을 가지고 있다. 중금속에 오염된 퇴적물에 노출됨에도 불구하고 망그로브는 중금속에 내성을 가지고 있다. 이 연구에서 우리는 망그로브로부터 중금속 저항성 관련 유전자를 클로닝하고, 중금속 노출에 유전자 발현 변화를 분석하였다. 미크로네시아 축라군의 웨노섬에서 채취한 Rhizophora stylosa의 잎과 뿌리조직으로부터 CTAB 방법을 이용하여 RNA를 분리하였고, gene specific primers를 이용하여 phytochelatin synthase 1(PCS1) 유전자를 클로닝하였다. R. stylosa 태생종자를 100 ppb의 Cd과 10 ppb의 Cu에 노출하였을 때 각각 1.91배 및 2.72배 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 PCS1 유전자의 발현분석이 망그로브 생태계의 건강성을 평가하기 위한 좋은 도구가 될 수 있음을 나타낸다.

Abstract ▼ AI-Helper

The mangrove ecosystems have the capacity to act as a sink of heavy metals entering aquatic ecosystems. Despite their potential exposure to metal contaminated sediments, mangroves appear to be highly tolerant to heavy metals. In this study, we cloned metal tolerance gene from mangrove plant. Using CTAB method, RNA were isolated from leaves and root tissue of Rhizophora stylosa habitated at Weno island in Micronesia Chuuk lagoon using CTAB method and phytochelatin synthase 1 (PCS1) gene was cloned using gene specific primers. Expression of PCS1 gene was increased 1.91 fold and 2.72 fold in mangrove propagules exposed to 100 ppb Cd and 10 ppb Cu, respectively. These results indicate that expression of PCS1 gene are promising tools for health assessment of mangrove ecosystem.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 여러 세포기관에서의 필수 금속이온의 농도를 유지하고 불필요한 금속이온에 대한 손상을 최소화하기 위한 분자 기작은 아직까지 잘 이해되지 않고 있다. 본 연구에서는 미크로네시아 축주의 웨노섬에 서식하고 있는 Rhizophora stylosa로부터 중금속 관련 유전자인 PCS1 유전자를 클로닝하였으며, 카드뮴과 구리에 노출된 R. stylosa의 PCS 유전자 발현 변화를 분석하였다. PCS 발현의 변화는 망그로브의 건강성 평가를 위한 분자바이오마커로써 적용될 수 있을 것이다.
생리적으로 요구되는 농도 이내로 필수 금속의 농도를 유지하고 불필요한 금속의 악영향을 최소화시키기 위하여 식물은 복잡한 항상성 기작을 개발하였다. 이러한 기작에는 수송, chelation, 구획화, 배출 및 격리 배출 등이 있으며[6], 이들을 통해 금속이온의 흡수, 축적, 이동 및 해독작용을 조절하게 된다.
이제까지 망그로브 유래 중금속 관련 유전자 발현 분석연구가 주로 A. germinans를 중심으로 연구되어 왔던 것과는 달리 본 연구에서는 미크로네시아 축 라군의 웨노섬에 서식하고 있는 R. stylosa의 중금속에 대한 건강성 평가를 목적으로 중금속 관련 유전자 바이오마커를 개발하고자 하였다. 본 연구를 통하여 망그로브 조직으로부터 RNA와 PCR을 위한 조건을 정립하였으며, GSP primer를 이용하여 R.

제안 방법

Preliminary 실험을 통해서 Cd 100 ppb 및 Cu 10 ppb를 중금속 노출시간에 따른 PCS1 유전자 발현실험의 농도로 결정하였다. 6, 12, 24, 48시간 동안 100 ppb 농도의 카드늄과 10 ppb 농도의 구리에 노출된 R. stylosa 뿌리 조직에서 total RNA를 추출한 후, GSP primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 카드늄과 구리에 노출된 R.
PCR은 DNA thermocycler PT-100 (MJ Research)를 사용하였으며, 94°C에서 5분간 반응시킨 후 94°C 45초, 60°C 45초, 72°C 90초를 40회 반복하고 72°C에서 10분간 반응시키는 조건으로 PCR한 후, TA 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.
PCS1 유전자의 클로닝을 위해 Oligo-dT primer와 gene specific primer(GSP)를 이용하였다. PCS1 유전자의 GSP primer는 Avicennia germinans PCS1 유전자 클로닝에 사용된 GSP primer[13]를 사용하였다.
PCS1에 대하여 고안된 GSP primer (forward 5‘-GCCTTGGAGATGGTTTGATG-3’ 및 reverse 5‘-GCCACCAATAGGTGAAAAATG-3’)를 사용하여 유전자를 클로닝하였다.
Preliminary 실험을 통해서 Cd 100 ppb 및 Cu 10 ppb를 중금속 노출시간에 따른 PCS1 유전자 발현실험의 농도로 결정하였다. 6, 12, 24, 48시간 동안 100 ppb 농도의 카드늄과 10 ppb 농도의 구리에 노출된 R.
R. stylosa 태생종자를 항온실험실에서 배양한 소식물체에 100 ppb 농도의 카드늄과 10 ppb 농도의 구리를 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 후 total RNA를 추출하여 카드늄과 구리 처리 시간에 따른 PCS1 유전자 발현정도를 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 비교하였다.
stylosa의 total RNA를 추출하였다. Total RNA 추출을 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여 다양한 농도의 CTAB 용액을 이용하여 R. stylosa 잎과 뿌리 조직으로부터 total RNA을 추출하였다. 추출조건을 정립하기 위한 실험 결과, 2-4% CTAB 농도에서 잎보다는 뿌리조직을 사용하였을 때 최적의 total RNA가 추출되었다[Fig.
미크로네시아 축 라군[Fig. 1]에 서식하고 있는 R. stylosa의 태생종자를 채집하여 항온 실험실(25 °C)에서 해수를 이용하여 뿌리가 내릴 때까지 8주 동안 배양한 후 중금속 노출 실험을 수행하였다.
stylosa의 중금속에 대한 건강성 평가를 목적으로 중금속 관련 유전자 바이오마커를 개발하고자 하였다. 본 연구를 통하여 망그로브 조직으로부터 RNA와 PCR을 위한 조건을 정립하였으며, GSP primer를 이용하여 R. stylosa의 PCS1 유전자를 클로닝하였다. 카드뮴과 구리에 노출된 망그로브 소식물체에서 클로닝된 PCS1 유전자의 발현이 변화하였다.
stylosa 잎과 뿌리조직으로부터 추출하였다. 첫 번째 cDNA 사슬은 1.5 pM의 oligo(dT) primers와 5 mg의 total RNA와 SuperScript^TM II reverse transcriptase(Invitrogen)를 사용하여 합성하였다. PCS1에 대하여 고안된 GSP primer (forward 5‘-GCCTTGGAGATGGTTTGATG-3’ 및 reverse 5‘-GCCACCAATAGGTGAAAAATG-3’)를 사용하여 유전자를 클로닝하였다.

대상 데이터

PCS1 유전자의 클로닝을 위해 Oligo-dT primer와 gene specific primer(GSP)를 이용하였다. PCS1 유전자의 GSP primer는 Avicennia germinans PCS1 유전자 클로닝에 사용된 GSP primer[13]를 사용하였다. 연구 결과 Oligo-dT로 RT-PCR을 수행하였을 때 PCS1 유전자의 PCR 산물을 확인할 수 없었지만, GSP primer를 이용한 경우 270 bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있었다[Fig.

데이터처리

데이터의 normality와 homogeneity는 ANOVA로 확인하였고, 실험구 간의 차이는 one-way ANOVA와 Duncan’'s multiple range test로 평가하였다.
통계분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 데이터의 normality와 homogeneity는 ANOVA로 확인하였고, 실험구 간의 차이는 one-way ANOVA와 Duncan’'s multiple range test로 평가하였다.

이론/모형

Total RNA는 CTAB을 사용한 Pine Tree 법을 사용하여 R. stylosa 잎과 뿌리조직으로부터 추출하였다. 첫 번째 cDNA 사슬은 1.
여러 가지 상품화된 RNA 분리 방법이 있지만 CTAB 방법이 가장 바람직 한 것으로 보고되고 있다[11]. 본 연구에서도 CTAB 방법을 사용하여 R. stylosa의 total RNA를 추출하였다. Total RNA 추출을 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여 다양한 농도의 CTAB 용액을 이용하여 R.

성능/효과

PCS1 PCR 산물을 TA 벡터에 클로닝하여 유전자 염기서열을 분석한 후, 아미노산 서열을 Avicennia germinans, Arabidopsis thalian, Brassica juncea, Lactuca sativa, Allium sativum, Solanum tuberosum과 비교 분석해본 결과, 보고되어 있는 각 종의 PCS1 아미노산 서열과 97%의 높은 상동성이 있음을 확인하였다[Fig. 4].
PCS1 유전자의 GSP primer는 Avicennia germinans PCS1 유전자 클로닝에 사용된 GSP primer[13]를 사용하였다. 연구 결과 Oligo-dT로 RT-PCR을 수행하였을 때 PCS1 유전자의 PCR 산물을 확인할 수 없었지만, GSP primer를 이용한 경우 270 bp 크기의 PCR 산물을 얻을 수 있었다[Fig. 3].
stylosa 잎과 뿌리 조직으로부터 total RNA을 추출하였다. 추출조건을 정립하기 위한 실험 결과, 2-4% CTAB 농도에서 잎보다는 뿌리조직을 사용하였을 때 최적의 total RNA가 추출되었다[Fig. 2].
카드늄과 구리에 노출된 R. stylosa의 PCS1 유전자 발현을 분석해 본 결과, 100 ppb 농도의 카드늄에 노출된 경우 24시간 후 PCS1 유전자의 발현이 대조군에 비해 1.91배 증가했으며, 10 ppb 농도의 구리에 노출된 경우 48시간 후 PCS1 유전자의 발현이 2.72배 증가하였다(p<0.05).

후속연구

stylosa의 PCS 유전자 발현 변화를 분석하였다. PCS 발현의 변화는 망그로브의 건강성 평가를 위한 분자바이오마커로써 적용될 수 있을 것이다.
카드뮴과 구리에 노출된 망그로브 소식물체에서 클로닝된 PCS1 유전자의 발현이 변화하였다. 본 연구의 결과로 개발된 분자바이오마커는 향 후 축라군의 망그로브의 건강성 평가를 위한 좋은 연구방법을 제공하게 될 것이며, 망그로브 보존 및 관리를 위한 정책적 자료의 축적을 위한 기반자료로 사용될 수 있을 것이다

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	망그로브 생태계는 어떤 기능을 가지고 있는가?	망그로브 생태계는 수생태계로 유입되는 중금속을 받아들이는 기능을 가지고 있다. 중금속에 오염된 퇴적물에 노출됨에도 불구하고 망그로브는 중금속에 내성을 가지고 있다.
	Phytochelatin synthase는 어떤 기능으로 알려져있는가?	PCs는 (-Glu-Cys)n-Gly 구조(n=2-11)를 가진 폴리펩티드이며, phytochelatin synthase 유전자(PCS)에 의해 glutathione(GSH)으로부터 합성된다. PCs는 카드뮴, 구리, 아연 등 중금속을 킬레이트시키는 것으로 알려져 있으며, 식물 뿐만 아니라 일부 미생물에서도 존재가 확인되었다[8,9]. 또한 PCs는 중금속을 액포로 이동시킴으로써 중금속 해독작용을 하는 것으로 알려져 있다[9].
	카드뮴과 구리같은 중금속은 무엇을 유도하는가?	카드뮴과 구리같은 중금속은 막투과성, 광합성 관련 효소 저해작용 등을 통해 세포수준에서 독성영향 및 항산화 과정을 유도한다[10]. 그러나 여러 세포기관에서의 필수 금속이온의 농도를 유지하고 불필요한 금속이온에 대한 손상을 최소화하기 위한 분자 기작은 아직까지 잘 이해되지 않고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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