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문제 정의
- 대표적인 약리작용으로는 해독, 이담, 항궤양, 항염증, 진경, 진해, 간보호 등이 있어 한방에서 널리 이용되고 있다(16). 따라서 본 연구에서는 지방세포와 조골세포에서 감초의 생리활성을 확인하고자 다분화능 세포 C3H10T1/2와 지방전구세포 3T3-L1, 조골전구세포 MC3T3-E1에서 창과감초를 이용한 감초추출물(GBE, Glycyrrhiza inflata Batal extracts)의 분화촉진여부를 조사하였다.
- 창과감초(Glycyrrhiza inflata Batal)는 한약재의 조화를 돕고 해독, 항염증, 항궤양 등의 약리작용으로 한방에서 널리 이용되는 약용식물이다. 본 연구에서는 지방세포와 조골세포에서 감초의 생리활성을 확인하고자 감초에탄올추출물(GBE)을 이용하여 세포분화 촉진여부를 조사하였다. GBE 의 세포독성여부를 통해 안전하다고 확인된 1~30 μg/mL의 농도 내에서 실험이 진행되었고 지방세포 분화조건에서 다분화능 세포 C3H10T1/2과 지방전구세포 3T3-L1의 Oil Red O 염색을 통해 GBE의 지방세포분화 촉진효과를 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 조골세포는 10 mM β-glycerophosphate(Sigma-Aldrich)와 50 μg/mL ascorbic acid(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 분화를 유도하였다.
- GBE의 세포독성여부를 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich)를 이용하여 간접적으로 생존세포수를 확인하였다. 24 well plate에서 세포가 confluent한 상태가 되었을 때 GBE를 농도별로 처리한 후 24, 48, 72시간째에 각각 5 mg/mL MTT 시약을 첨가하였다.
- GBE의 세포독성여부를 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich)를 이용하여 간접적으로 생존세포수를 확인하였다. 24 well plate에서 세포가 confluent한 상태가 되었을 때 GBE를 농도별로 처리한 후 24, 48, 72시간째에 각각 5 mg/mL MTT 시약을 첨가하였다. 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 DMSO에 녹여서 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 0.5 μg RNA를 AMV Reverse Transcription System kit(Promega Co., Madison, WI, USA)와 random primer를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
- 따라서 GBE는 비교적 독성이 낮은 것으로 사료되며 이후 모든 실험에서는 1~30 μg/mL의 범위 내에서 실험을 진행하였다.
- 상대적인 발현수준은 2-ΔCT으로 계산하였다.
- Thermal Cycler Dice(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 Power SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 primer가 포함된 증폭 혼합물 25 μL와 cDNA를 polymerase chain reation(PCR) 증폭회로를 40회 돌렸다.
- Thermal Cycler Dice(Takara, Shiga, Japan)를 이용하여 Power SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 primer가 포함된 증폭 혼합물 25 μL와 cDNA를 polymerase chain reation(PCR) 증폭회로를 40회 돌렸다. 발현량은 36B4에 의해 정규화 되었고 모든 real-time PCR은 최소 2회 수행하였다. PCR에 사용된 oligonucleotide primer(Integrated DNA Technologies, San Diego, CA, USA) 서열은 Table 1에 명시하였다.
- MTT 시험법을 이용하여 C3H10T1/2 세포에서 GBE의 독성여부를 확인하였다(Fig. 1). DMSO를 처리한 대조군을 포함하여 1, 10, 20, 30 μg/mL의 농도에서 세포독성여부를 조사해본 결과 GBE는 24, 48, 72시간에서 모두 세포의 생장에 영향을 주지 않았다(Fig.
- 감초가 지방세포분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 다분화능 세포인 C3H10T1/2에서 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 GBE를 처리하여 지방세포로 분화시켰다(Fig. 2A).
- 먼저 다분 화능 세포인 C3H10T1/2에서 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 GBE를 처리하여 골세포로 분화시킨 후 ALP 염색을 통해 시각적으로 골세포분화 정도를 조사하였다(Fig. 3A).
- 감초가 뼈와 근육을 튼튼하게 한다는 동의보감 기록을 참고하여 GBE의 골세포 분화효과를 확인해보았다. 먼저 다분 화능 세포인 C3H10T1/2에서 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 GBE를 처리하여 골세포로 분화시킨 후 ALP 염색을 통해 시각적으로 골세포분화 정도를 조사하였다(Fig.
- 지방세포형성 표지유전자 발현량 차이를 통해 GBE의 지방세포 분화효과를 재확인하고자 지방세포분화의 핵심 전사조절자 PPARγ와 그의 표지유전자인 adipocyte Protein 2(aP2), adiponectin(AdipoQ)의 발현량 차이를 측정하였다(Fig. 4A).
- 골형성 표지유전자 발현량 차이를 통해 GBE의 골세포 분화효과를 재확인하기 위해 조골세포분화의 핵심 전사인자인 runt-related transcription factor 2(RUNX2)를 포함 하여 골형성 표지유전자인 osterix와 collagen의 발현량 차이를 측정하였다(Fig. 5A). RUNX2와 osterix는 대조군에 비해 GBE를 처리한 실험군에서 발현량이 높은 것을 볼 수있었다.
- GBE의 어떤 성분이 지방세포와 조골세포의 분화촉진효과를 매개하는지 확인하기 위해 HPLC를 통해 GBE의 구성성분을 조사하였다. 그 결과 건물 중 2.
- GBE의 어떤 성분이 지방세포와 조골세포의 분화촉진효과를 매개하는지 확인하기 위해 HPLC를 통해 GBE의 구성성분을 조사하였다. 그 결과 건물 중 2.6%를 차지하며 감초의 주요 활성성분으로 알려져 있는 트리테르페노이드(triterpenoid)계 사포닌(saponin)인 GA(Fig. 6A)와 0.6%를 차지하는 플라보노이드(flavonoid)인 LA(Fig. 6B)의 세포 분화여부를 조사하였다. 다분화능 세포 C3H10T1/2에서 동일한 농도로 처리하여 지방세포와 조골세포로 분화시켜 보았을 때, 먼저 지방세포 분화조건에서 GA는 10, 20 μM 두 농도에서 모두 대조군과 비슷한 분화결과를 가져왔고(Fig.
- 또한 지방세포의 핵심전사조절인자인 PPARγ와 그의 표지유전자 aP2, AdipoQ, C/EBPα의 발현량 증가를 통해 GBE의 지방세포분화 촉진효과를 재확인하였다.
대상 데이터
- 감초추출물은 중국 신강지역에서 채취한 창과감초(Glycyrrhiza inflata Batal)를 이용한 95% 에탄올추출물로서 (주)애드바이오텍(강원도)에서 제공받아 실험에 사용하였고 glycyrrhizic acid(glycyrrhizic acid ammonium salt, GA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서, licochalcone A(LA)는 Calbiochem(Darmstadt, Germany)에서 구매하여 사용하였다.
- 배양중인 지방세포의 분화정도를 시각화하기 위해 분화가 완료된 세포의 지방구에 특이적으로 반응하는 Oil Red O(Sigma-Aldrich)를 사용하여 염색하였다. 분화가 완료된 세포들은 phosphate buffer saline(PBS)으로 1회 세척한후, 4% formaldehyde solution으로 1시간 동안 고정시켰다.
- 분석조건은 Agilent Technology의 HPLC(1200 series, Palo Alto, CA, USA)를 이용하였으며 칼럼은 Kromasil C18(100-5-C18 4.6×250 nm, Eka Shemicals, Bohus, Sweden), 이동상으로는 물 : 아세토나이트릴 : 초산(61:31:2)을 사용하였고 UV detector의 측정 파장은 GA는 254 nm, LA는 370 nm에서 측정하였으며 sample injection volume은 10 μL, flow rate는 0.7 mL/ min이었다.
- TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 C3H10T1/2 세포로부터 총 RNA를 추출 및 분리하였다. 0.
- 지방전구세포 3T3-L1(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)의 유지 시에는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)(Hyclone, Logan, UT, USA)과 calf serum(CS)(Hyclone), 1% penicillin-streptomycin(Hyclone)을 혼합하여 사용하였고 그 외에 3T3- L1의 분화와 C3H10T1/2(American Type Culture Collection)의 세포배양과 분화를 위해 DMEM과 10% fetal bovine serum(FBS)(Hyclone), 1% penicillin-streptomycin을 혼합하여 사용하였다.
- 분화유도를 위해서는 1 μM dexamethasone(DMS)(Sigma-Aldrich), 0.5 mM isobutyl1-methylxanthine(IBMX)(Sigma-Aldrich), 5 μg/mL insulin(Sigma-Aldrich), GW7845(kindly provided by Tontonoz Lab., Los Angeles, CA, USA)를 혼합하여 사용하였다.
- 조골세포에 있어서 C3H10T1/2 세포의 배양과 분화를 위해 사용한 배지는 DMEM과 5%의 fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin을 혼합하여 사용하였고 MC3T3-E1(American Type Culture Collection) 세포의 배양과 분화를 위해 사용한 배지는 MEM alpha modification(Hyclone)과 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 혼합하여 사용하였다. 조골세포는 10 mM β-glycerophosphate(Sigma-Aldrich)와 50 μg/mL ascorbic acid(Sigma-Aldrich)를 첨가하여 분화를 유도하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균±표준오차(mean±SEM) 또는 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고 집단 간 평균치 차이는 two-tailed unpaired Student's t-test를 이용하여 P<0.05 수준에서 검증하였다.
이론/모형
- GBE 내의 GA와 LA의 성분 분석은 Kim 등(17)의 방법에 따라 분석하였다. 에탄올로 추출된 감초분말 0.
성능/효과
- DMSO를 처리한 대조군을 포함하여 1, 10, 20, 30 μg/mL의 농도에서 세포독성여부를 조사해본 결과 GBE는 24, 48, 72시간에서 모두 세포의 생장에 영향을 주지 않았다(Fig. 1A~1C).
- 이 외에 지방전구세포인 3T3-L1에서도 위와 동일하게 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 GBE를 처리하여 지방세포로 분화시킨 후 지방세포분화 정도를 확인한 결과 농도 의존적으로 지방세포분화를 촉진하는 것을 확인하였다(Fig. 2B).
- 2A). Oil Red O 염색을 통해 지방세포분화 정도를 확인한 결과 대조군 DM에 비해 지방세포 분화에 필요한 DMS, IBMX, insulin, GW7845를 첨가하지 않은 GM은 분화가 거의 되지 않았다는 것을 통해 실험이 올바르게 진행되고 있음을 확인하였다. GBE를 처리한 실험군에서는 Oil Red O 염색이 진해짐에 따라 농도 의존적으로 지방세포분화가 촉진되는 것을 볼 수 있었다.
- 보편적인 골형성 표지인자 ALP는 10, 20, 30 μg/mL의 농도에서 유전자 발현량을 측정한 결과 농도 의존적으로 ALP 발현량이 증가하였다(Fig. 5B).
- PPARγ와 aP2, AdipoQ 모두 대조군에 비해 높은 발현량을 나타내며 유의적인 차이를 보였다.
- 대조군인 DM에 비해 골세포 분화에 필요한 β-glycerophosphate와 ascorbic acid가 첨가되지 않은 GM은 분화가 거의 되지 않았다는 것을 통해 실험이 올바르게 진행되고 있음을 확인하였다. GBE를 처리한 실험군에서는 ALP 염색이 진해짐에 따라 농도 의존적으로 골세포분화가 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 이 외에 조골세포인 MC3T3-E1에서도 위와 동일하게 1, 5, 10 μg/mL의 농도로 GBE를 처리하여 골세포로 분화시킨 후 골세포분화 정도를 확인한 결과 농도 의존적으로 골세포분화를 촉진하는 것을 확인하였다(Fig.
- 다분화능 세포 C3H10T1/2에서 동일한 농도로 처리하여 지방세포와 조골세포로 분화시켜 보았을 때, 먼저 지방세포 분화조건에서 GA는 10, 20 μM 두 농도에서 모두 대조군과 비슷한 분화결과를 가져왔고(Fig. 7A) 반면에 LA는 농도 의존적으로 지방세포분화를 촉진한 다는 것을 알 수 있었다(Fig. 7B).
- GBE 의 세포독성여부를 통해 안전하다고 확인된 1~30 μg/mL의 농도 내에서 실험이 진행되었고 지방세포 분화조건에서 다분화능 세포 C3H10T1/2과 지방전구세포 3T3-L1의 Oil Red O 염색을 통해 GBE의 지방세포분화 촉진효과를 확인할 수 있었다.
- 마찬가지로 조골세포 분화조건에서도 GA는 두 농도에서 조골세포 분화효과가 미미한 것을 알 수 있었고(Fig. 7C) 반면에 LA는 20 μM에서 조골세포분화를 촉진한다는 것을 알 수 있었다(Fig. 7D).
- 이렇게 GBE의 지방세포와 조골세포에 대한 분화효과를 매개하는 물질을 규명하기 위해 창과감초(Glycyrrhiza inflata Batal)의 구성성분 중에서 GA와 LA의 분화효과를 조사해본 결과, GA는 세포분화에 영향을 주지 않았으나 LA가 GBE와 유사한 지방세포와 조골세포의 분화촉진 기능을 나타내었다. 그러나 감초 중 LA가 차지하는 0.
- 또한 지방세포의 핵심전사조절인자인 PPARγ와 그의 표지유전자 aP2, AdipoQ, C/EBPα의 발현량 증가를 통해 GBE의 지방세포분화 촉진효과를 재확인하였다. 이와 일관된 결과로서 조골세포 분화조건에서 다분화능 세포 C3H10T1/2과 조골전구세포 MC3T3-E1의 ALP 염색을 통해 GBE의 조골세포분화 촉진효과를 확인하였고 조골세포 표지유전자인 ALP, RUNX2, osterix, collagen의 발현량 증가를 통해 GBE의 조골세포분화 촉진효과를 재확인하였다. 이에 따라 본 연구에서는 GBE의 지방세포와 조골세포 분화효과를 매개하는 감초의 구성성분을 조사하기 위해 GA(glycyrrhizic acid)와 LA(licochalcone A)의 분화촉진 여부를 확인한 결과, GA는 영향을 주지 않으나 LA가 GBE 의 세포분화효과를 매개한다고 사료된다.
- 이와 일관된 결과로서 조골세포 분화조건에서 다분화능 세포 C3H10T1/2과 조골전구세포 MC3T3-E1의 ALP 염색을 통해 GBE의 조골세포분화 촉진효과를 확인하였고 조골세포 표지유전자인 ALP, RUNX2, osterix, collagen의 발현량 증가를 통해 GBE의 조골세포분화 촉진효과를 재확인하였다. 이에 따라 본 연구에서는 GBE의 지방세포와 조골세포 분화효과를 매개하는 감초의 구성성분을 조사하기 위해 GA(glycyrrhizic acid)와 LA(licochalcone A)의 분화촉진 여부를 확인한 결과, GA는 영향을 주지 않으나 LA가 GBE 의 세포분화효과를 매개한다고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 제2형 당뇨와 그에 수반되는 골질환과 골다공증에 대한 치료 소재로서 GBE와 그의 생리활성을 매개할 수 있는 LA의 가능성을 보았으며 GBE에서 분리되는 다양한 화합물의 동정 및 생리활성 효과, LA와의 상승효과 등의 추후 연구가 기대된다.
- 대조군인 DM에 비해 골세포 분화에 필요한 β-glycerophosphate와 ascorbic acid가 첨가되지 않은 GM은 분화가 거의 되지 않았다는 것을 통해 실험이 올바르게 진행되고 있음을 확인하였다.
후속연구
- 대신에 GBE에 함유된 다른 화합물 혹은 LA와 이들과의 상승효과로 설명이 가능할 수 있다. 따라서 지방세포와 조골 세포에 대하여 GBE에서 분리되는 다양한 화합물의 동정 및 생리활성 효과, LA와의 상승효과 등의 추후 연구가 기대된다.
- 이에 따라 본 연구에서는 GBE의 지방세포와 조골세포 분화효과를 매개하는 감초의 구성성분을 조사하기 위해 GA(glycyrrhizic acid)와 LA(licochalcone A)의 분화촉진 여부를 확인한 결과, GA는 영향을 주지 않으나 LA가 GBE 의 세포분화효과를 매개한다고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 제2형 당뇨와 그에 수반되는 골질환과 골다공증에 대한 치료 소재로서 GBE와 그의 생리활성을 매개할 수 있는 LA의 가능성을 보았으며 GBE에서 분리되는 다양한 화합물의 동정 및 생리활성 효과, LA와의 상승효과 등의 추후 연구가 기대된다.
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