[국내논문]Hydrogen peroxide로 산화적 스트레스가 유도된 HaCaT keratinocyte에서 금은화의 세포 보호 효과 Protectvie effects of Lonicerae Japonicae Flos against hydrogen peroxidase-induced oxidative stress on Human keratinocyte, HaCaT cells원문보기
Objectives : Lonicerae Japonicae Flos (LJF) has been shown anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-viral, anti-rheumatoid properties. However, it is still largely unknown whether LJF inhibits skin injury against oxidative stress in human keratinocyte, HaCaT cells. The purpose of this study was to eval...
Objectives : Lonicerae Japonicae Flos (LJF) has been shown anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-viral, anti-rheumatoid properties. However, it is still largely unknown whether LJF inhibits skin injury against oxidative stress in human keratinocyte, HaCaT cells. The purpose of this study was to evaluate the protective effects of LJF against hydrogen peroxide($H_2O_2$)-induced oxidative stress in human keratinocytes, HaCaT cells. Methods : To evaluate out the protective effects of LJF on oxidative injury in HaCaT cells, an oxidative stress model of HaCaT cells was established under a suitable concentration (500 ${\mu}M$) hydrogen peroxide. HaCaT keratinocyte cells were pre-treated with LJF (0.1, 0.25 or 0.5 mg/ml), and then stimulated with $H_2O_2$. Then, the cells were harvested to measure the cell viability, DNA damage, and release of reactive oxygen species (ROS). Results : LJF (0.1, 0.25 or 0.5 mg/ml) itself did not show any significant toxicity in HaCaT cells. The treatment of $H_2O_2$ caused the oxidative stress, leading to the cell death, and DNA injury. However, pretreatment with LJF reduced cell death, and DNA injury. The stimulation of $H_2O_2$ on HaCaT cells resulted in excessive release of ROS, which is the main factor of oxidative stress. The excessive release of ROS was inhibited by LJF treatment significantly. Conclusions : These results could suggest that LJF exhibited the protective effects of HaCaT cells against $H_2O_2$-induced oxidative stress by inhibiting ROS release. It could be explained that LJF inhibit skin damages against oxidative stress. Thus, LJF would be useful for the development of drug or cosmetics treating skin troubles.
Objectives : Lonicerae Japonicae Flos (LJF) has been shown anti-oxidant, anti-inflammatory, anti-viral, anti-rheumatoid properties. However, it is still largely unknown whether LJF inhibits skin injury against oxidative stress in human keratinocyte, HaCaT cells. The purpose of this study was to evaluate the protective effects of LJF against hydrogen peroxide($H_2O_2$)-induced oxidative stress in human keratinocytes, HaCaT cells. Methods : To evaluate out the protective effects of LJF on oxidative injury in HaCaT cells, an oxidative stress model of HaCaT cells was established under a suitable concentration (500 ${\mu}M$) hydrogen peroxide. HaCaT keratinocyte cells were pre-treated with LJF (0.1, 0.25 or 0.5 mg/ml), and then stimulated with $H_2O_2$. Then, the cells were harvested to measure the cell viability, DNA damage, and release of reactive oxygen species (ROS). Results : LJF (0.1, 0.25 or 0.5 mg/ml) itself did not show any significant toxicity in HaCaT cells. The treatment of $H_2O_2$ caused the oxidative stress, leading to the cell death, and DNA injury. However, pretreatment with LJF reduced cell death, and DNA injury. The stimulation of $H_2O_2$ on HaCaT cells resulted in excessive release of ROS, which is the main factor of oxidative stress. The excessive release of ROS was inhibited by LJF treatment significantly. Conclusions : These results could suggest that LJF exhibited the protective effects of HaCaT cells against $H_2O_2$-induced oxidative stress by inhibiting ROS release. It could be explained that LJF inhibit skin damages against oxidative stress. Thus, LJF would be useful for the development of drug or cosmetics treating skin troubles.
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문제 정의
선행연구들에서 금은화의 항산화, 항염증과 같은 다양한 연구가 진행 되었으나, 피부에서 금은화의 세부적인 효능 연구는 보고된 바가 없었다. 이에 본 연구에서는 각질형성세포 HaCaT keratinocyte에서 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)로 유발되는 산화적 스트레스에 대한 금은화 물추출 물의 효과를 알아보고자 하였다.
. 따라서, 먼저 H2O2처리 후 사람 각질형성세 포인 HaCaT 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고, 금은화의 효과를 살펴보고자 하였다. HaCaT 세포에 금은화를 0.
본 실험에서는 금은화 물추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해서 HaCaT keratinocytes에 활성산소의 한 종류로 잘 알려 진 H2O2 (500 µM)를 이용하여 산화적 스트레스를 유도하였다.
하지만 과도한 산화적 스트레스에 의해 keratinocyte가 손상되면, 방어 시스템의 붕괴가 와서 피부에 손상을 입게 된다. 따라서, 본 연구에서는 항산화, 항염증에 유용하게 사용되어온 금은화를 이용하여 HaCaT keratinocytes에서 항산화 활성을 평가하고 세포 손상을 억제하는 효과를 탐색하였다.
본 연구에서는 금은화 물 추출물의 사람 각질형성 세포에 서의 항산화 효과를 통한 세포 보호 효과를 살펴보고자 하였으며, 그 결과 금은화 물 추출물은 각질형성세포에서의 항산화, 세포보호 효과가 우수 하였다. 따라서, 본 연구 결과는 추후에 금은화를 이용한 피부에서의 다양한 효능 및 기전 연구를 하는데 기초적인 자료가 될 것으로 판단된다.
제안 방법
그 후 Flourscence microscopy (Olympus×70, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
HaCaT cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정했다. 세포들은 DMEM 배지에서 5☓104 cells/well의 밀도로 현탁하여 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 금은화 물 추출물을 처리 하였다. 24시간 배양 후 5 mg/ml의 농도로 MTT 용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
Cellular DNA fragmentation Kit (Millipore, MA, USA)를 이용하여 DNA의 분절 정도를 측정하였다. 먼저 HaCaT 세포를 2☓105 cells/ml로 현탁하고, bradU labeling solution 을 10 µM을 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건하에서 2시간 배양하였다.
실험군에 LJ를 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml 농도로 한 후 1시간 뒤, H2O2 500 µM을 처리하고 5% CO2, 37℃ 조건하에서 1시간 배양하였다.
HaCaT 세포에 금은화를 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양한 후 H2O2 500 µM 을 2시간 처리 한 뒤 세포 생존률을 살펴보았다.
세포 내 활성산소의 생성을 측정하기 위하여 형광 probe는 DCF-DA를 이용하였다. 비형광물질인 DCF-DA (Sigma, MO, USA)는 세포내 H2O2와 관련된 peroxide 존재시 ROS 에 의해 산화되어진다.
세포를 수확하기 전에 2 µM DCF-DA를 처리하여 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 배양한 세포는 PBS로 세척 하여 1% trypsine-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences)로 형광을 측정하였다. 정보의 분석은 Cell Quest software( Becton Dickinson)를 이용하였다.
금은화 물추출물이 사람 각질형성세포인 HaCaT 세포의 대사 및 독성에 영향을 주어 세포 사멸 및 산화적 스트레스 발생에 관여할 수 있음을 배제하기 위하여, HaCaT 세포에 농도별로 금은화를 0.1, 0.25, 0.5, 혹은 1 mg/ml의 농도로 처리하여 3시간 동안 배양한 후 세포 독성 분석법을 실시해 생존율을 관찰하였다. 그 결과, 아래 Fig.
5, 혹은 1 mg/ml의 농도로 처리하여 3시간 동안 배양한 후 세포 독성 분석법을 실시해 생존율을 관찰하였다. 그 결과, 아래 Fig. 1과 같이 금은화는 HaCaT 세포에서 최고 농도 0.5 mg/ml까지는 유의성있는 세포 독성을 보이지 않았으나, 1 mg/ml의 농도에서는 유의성있는 세포 독성을 보여, 실험의 농도를 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml로 설정하였다 (Fig. 1).
H2O2 처리 시 나타나는 세포 DNA 손상에 금은화가 주는 영향을 알아보기 위하여, 금은화를 농도별(0.1, 0.25, 0.5 mg/ml)로 1시간 전 처리 하고, H2O2 (500 µM)을 1시간 처리하였다.
H2O2 처리 시 ROS 생성이 활성화 되고, ROS 분비가 사람 각질 형성세포의 사멸 및 염증 반응을 촉진 한다는 보고에 따라서14,15), 금은화가 ROS의 생성에 어떤 영향을 주는지 알아보기 위하여, 금은화를 농도 별(0.1, 0.25, 0.5 mg/ml)로 1시간 전에 전처리 하고, H2O2 500 µM을 처리 하였다.
H2O2 처리 시 나타나는 세포 DNA 분절에 금은화가 주는 영향을 알아보기 위하여, 금은화를 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml을 H2O2 처리 1시간 전에 전 처리 하고, 1시간 후 H2O2 (500 µM)을 1시간 처리하였다.
5 mg/ml)로 1시간 전에 전처리 하고, H2O2 500 µM을 처리 하였다. H2O2 처리 1시간 후 세포에 DCF-DA를 염색하여, ROS의 생성을 관찰 하였다. 그 결과 정상군 보다 H2O2 (500 µM) 처리군에서 ROS 생성이 크게 증가하였다.
금은화 물추출물을 이용하여 사람각질형성세포인 HaCaT keratinocyte에서 H2O2로 유발한 산화적인 손상에 대한 효과를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
각질형성세포주인 HaCaT 세포주를 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% penicillin/streptomycine을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (GibcoBRL, Braunscheig, Germany) 배지를 사용하여 5% CO2, 37℃ 세포 배양기에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
의 꽃봉오리를 기원으로 하지만 중국약전에서는 인동덩굴은 물론, 화남인동 (華南忍冬) Lonicera confusa (Sweet) DC, 고선인동 (菰腺忍冬) Lonicera hypoglauca Miq. 황갈모인동 (黄褐毛忍冬) Lonicera fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng 등을 기원으로 사용한다. 본 연구에서는 인동덩굴 Lonicera japonica Thunb.
실험에 사용한 금은화(Lonicerae Japonicae Flos)는 옴니허브(경북 영천, 대한민국)에서 구입하여 정선해서 사용하였다.
본 실험에 사용된 HaCaT 세포는 Addexobio (San Diego, Califonia, USA)로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. HaCaT 세포는 형질 전환된 각질형성세포로 사람 피부의 정상 각질형 성세포와 형태 및 반응 양식이 동일하면서 계대배양이 제한되지 않아 유지하기가 편한 장점이 있다.
데이터처리
실험 결과에 대한 통계 처리는 SPSS V10.0을 이용하여 one way ANOVA로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
HaCaT cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정했다. 세포들은 DMEM 배지에서 5☓104 cells/well의 밀도로 현탁하여 0.
배양한 세포는 PBS로 세척 하여 1% trypsine-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 flow cytometry (FACS Calibur, BD Biosciences)로 형광을 측정하였다. 정보의 분석은 Cell Quest software( Becton Dickinson)를 이용하였다.
5 or 1 mg/ml) for 3 h. The cell viability was measured by MTT assay. The results sere similar in 3 additional experiments.
성능/효과
그 결과 H2O2 500 µM을 처리하였을때 감소하던 세포 생존률이 금은화 처리 군에서 농도 의존적으로 증가한 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 2).
그 결과 정상군 보다 H2O2 (500 µM) 처리군에서 ROS 생성이 크게 증가하였다.
5 mg/ml을 H2O2 처리 1시간 전에 전 처리 하고, 1시간 후 H2O2 (500 µM)을 1시간 처리하였다. 그 결과 정상군에 비하여 대조군인 H2O2 처리 군에서 DNA분절이 일어나는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig 4). 하지만 금은화를 0.
그 결과 정상군 보다 H2O2 (500 µM) 처리군에서 ROS 생성이 크게 증가하였다. 하지만 금은화를 처리 하였을 때 H2O2 처리로 인한 ROS 생성이 농도 의존적으로 유의하게 억제됨을 확인 할 수 있었다 (Fig. 5).
고로 ROS를 통한 세포 손상 및 사멸을 억제하는 것은 세포 보호에 있어서 아주 중요한 의미를 가진다. 본 연구에서는 기존의 연구와 일치하게 H2O2가 세포 사멸을 증가함을 알 수 있었다. 또한 H2O2는 DNA chromatin 응축 및 DNA 분절 등을 유도하여 세포 손상을 유도하였다.
또한 H2O2는 DNA chromatin 응축 및 DNA 분절 등을 유도하여 세포 손상을 유도하였다. 이에 금은화 물 추출물을 전 처리한 후, H2O2를 통하여 과도한 산화적 스트레스를 주었을 때, 이러한 세포 사멸 및 손상을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다. 또한 H2O2에 의한 과도한 ROS생성도 금은화에 의해 억제됨을 보았을 때, 금은화는 H2O2에 의한 ROS 생성을 억제하여서 추가적인 세포 사멸 및 손상을 억제함을 유추할 수 있다.
1. 금은화 물추출물은 HaCaT keratinocyte에서 0.5 mg/ml에서까지 유의성 있는 세포 독성을 보이지 않았으며, H2O2로 유발한 산화적 손상에 대해 농도 의존적으로 세포 생존률을 증가 시켰다.
2. 금은화 물추출물은 HaCaT keratinocyte에서 H2O2로 유발한 DNA chromatin의 응축 및 DNA 분절을 감소 시켰다.
이상의 결과, 금은화 물추출물은 사람각질형성세포인 HaCaT keratinocyte에서 H2O2로 유발한 산화적인 스트레스에서 세포 보호 및 ROS 생성 억제 효과가 우수하게 나타났으며, 이와 같은 결과를 바탕으로 금은화 물추출물이 피부의 산화적 손상을 개선하는데 주요하게 작용할 수 있을 것으로 추측된다. 추후에 금은화 물추출물의 피부에서 산화적인 손상을 억제하는 구체적인 기전 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.
후속연구
본 연구에서는 금은화 물 추출물의 사람 각질형성 세포에 서의 항산화 효과를 통한 세포 보호 효과를 살펴보고자 하였으며, 그 결과 금은화 물 추출물은 각질형성세포에서의 항산화, 세포보호 효과가 우수 하였다. 따라서, 본 연구 결과는 추후에 금은화를 이용한 피부에서의 다양한 효능 및 기전 연구를 하는데 기초적인 자료가 될 것으로 판단된다. 또한, 추후 연구에서 금은화 물 추출물의 피부에 대한 세부 기전 연구 및 활성 성분 분석에 대한 추가적인 실험이 필요할 것으로 사료된다.
따라서, 본 연구 결과는 추후에 금은화를 이용한 피부에서의 다양한 효능 및 기전 연구를 하는데 기초적인 자료가 될 것으로 판단된다. 또한, 추후 연구에서 금은화 물 추출물의 피부에 대한 세부 기전 연구 및 활성 성분 분석에 대한 추가적인 실험이 필요할 것으로 사료된다.
로 유발한 산화적인 스트레스에서 세포 보호 및 ROS 생성 억제 효과가 우수하게 나타났으며, 이와 같은 결과를 바탕으로 금은화 물추출물이 피부의 산화적 손상을 개선하는데 주요하게 작용할 수 있을 것으로 추측된다. 추후에 금은화 물추출물의 피부에서 산화적인 손상을 억제하는 구체적인 기전 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
각질형성세포의 역할은?
인체 피부는 크게 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 있다. 이 중에서 각질형성세포(keratinocytes)는 표피층에 존재하고 있으며, 외부환경으로부터 신체 내부를 보호하거나 보습, 체온조절 등 중요한 역할을 한다10). 하지만 피부 표피에 해당하는 각질형성세포(keratinocytes)는 바깥층에서 태양광선(자외선)을 비롯한 외부 자극에 직접적으로 노출 되게 되는데 이러한 지속적인 외부 자극의 노출을 통해 산화적 스트레스(oxidative stress)가 발생하게 된다.
인체 피부는 어떻게 구성되어 있나?
인체 피부는 크게 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 있다. 이 중에서 각질형성세포(keratinocytes)는 표피층에 존재하고 있으며, 외부환경으로부터 신체 내부를 보호하거나 보습, 체온조절 등 중요한 역할을 한다10).
대한약전과 중국약전에서 보는 금은화의 기원식물은?
금은화(金銀花, Lonicera japonica Flos, LJF)의 기원식물은 대한약전과 중국약전에 의하면 다양하다. 대한약전에서는 인동과(Caprifoliaceae)에 속한 인동덩굴 Lonicera japonica Thunb.의 꽃봉오리를 기원으로 하지만 중국약전에서는 인동덩굴은 물론, 화남인동 (華南忍冬) Lonicera confusa (Sweet) DC, 고선인동 (菰腺忍冬) Lonicera hypoglauca Miq. 황갈모인동 (黄褐毛忍冬) Lonicera fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng 등을 기원으로 사용한다. 본 연구에서는 인동덩굴 Lonicera japonica Thunb.
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