독성 Alexandrium tamarense 의 EST 분석 및 삭시톡신 생합성 유전자의 확인 Expressed Sequence Tag Analysis of Toxic Alexandrium tamarense and Identification of Saxitoxin Biosynthetic Genes원문보기
A. tamarense로부터 ESTs library를 제작하였다. 이들의 염기서열을 분석하여 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하였다. 연구결과 827 클론의 염기서열이 분석되었고, 564개의 EST가 GenBank에서의 Blast search를 사용하여 기능에 따라 분류되었다. EST에서의 주요 유전자는 cellular organization, cell metabolism, energy, cell cycle과 DNA processing, cellular transport와 transport, cell rescue, defense, death와 aging 및 transcription 등으로 분석되었다. 특히 S-adenosylmethionine synthetase와 H2A histonefamily 유전자의 발현이 독성 A. tamarense에서 증가하였다. 이러한 결과는 두 개의 유전자가 A. tamarense에서의 삭시톡신 생합성을 검출하기 위한 좋은 바이오마커가 될 수 있음을 보여준다.
A. tamarense로부터 ESTs library를 제작하였다. 이들의 염기서열을 분석하여 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하였다. 연구결과 827 클론의 염기서열이 분석되었고, 564개의 EST가 GenBank에서의 Blast search를 사용하여 기능에 따라 분류되었다. EST에서의 주요 유전자는 cellular organization, cell metabolism, energy, cell cycle과 DNA processing, cellular transport와 transport, cell rescue, defense, death와 aging 및 transcription 등으로 분석되었다. 특히 S-adenosylmethionine synthetase와 H2A histone family 유전자의 발현이 독성 A. tamarense에서 증가하였다. 이러한 결과는 두 개의 유전자가 A. tamarense에서의 삭시톡신 생합성을 검출하기 위한 좋은 바이오마커가 될 수 있음을 보여준다.
Expressed sequence tag (EST) library was constructed from A. tamarense. Base sequences of EST clones were analyzed and saxitoxin biosynthesis-related genes were cloned. Sequences of 827 clones were analyzed and 564 EST were functionally clustered using Blast searches against GenBank. Main genes in t...
Expressed sequence tag (EST) library was constructed from A. tamarense. Base sequences of EST clones were analyzed and saxitoxin biosynthesis-related genes were cloned. Sequences of 827 clones were analyzed and 564 EST were functionally clustered using Blast searches against GenBank. Main genes in the EST had functions on cellular organization, cell metabolism, energy, cell cycle and DNA processing, cellular transport and transport, cell rescue, defense, death and aging, and transcription. Moreover, expression of S-adenosylmethionine synthetase and H2A histone family genes were increased in the toxic A. tamarense. These results show that two genes could be a good biomarkers for the detection of saxitoxin biosynthesis in the A. tamarense.
Expressed sequence tag (EST) library was constructed from A. tamarense. Base sequences of EST clones were analyzed and saxitoxin biosynthesis-related genes were cloned. Sequences of 827 clones were analyzed and 564 EST were functionally clustered using Blast searches against GenBank. Main genes in the EST had functions on cellular organization, cell metabolism, energy, cell cycle and DNA processing, cellular transport and transport, cell rescue, defense, death and aging, and transcription. Moreover, expression of S-adenosylmethionine synthetase and H2A histone family genes were increased in the toxic A. tamarense. These results show that two genes could be a good biomarkers for the detection of saxitoxin biosynthesis in the A. tamarense.
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문제 정의
EST clone의 염기서열 분석을 통하여 클론된 유전자의 특성을 파악한 후, STX 생합성 관련 유전자를 분리하였다. 분리된 유전자는 발현분석을 통하여 STX 생합성을 진단할 수 있는 바이오마커로 개발하고자 하였다.
우리나라 연안에서 적조를 유발하여 어류를 폐사시키고, 독성물질을 생산, 분비하는 것으로 알려진 A. tamarense의 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하고, 이들을 STX 생합성을 진단하기 위한 바이오마커로 활용하고자 하는 연구를 수행하였다. 독성 A.
제안 방법
827개의 E. coli 클론을 각각 plasmid miniprep하여, 일정량(2-3 μg)을 slot을 이용, nytran membrane에 bloting한후 A. tamarense toxic strain과 non-toxic strain에서 분리한 total RNA를 이용하여 dot-blot hybridization을 수행하였다.
96 well plate format으로 9개의 plate에 construction된 EST clone 3 μL를 1 mL Hogness Freezing Medium(Table 2)이 담긴 96 well deep well plate에 접종 하였다.
tamarense로부터 mRNA를 분리하고, 이들로부터 EST library를 제작하였다. EST clones의 염기서열을 분석하여 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하였다. 연구결과 827 클론의 염기서열이 분석되었고, 그 중 564개의 EST가 기능에 따라 분류되었다.
tamarense로부터 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 EST library를 구축하였다. EST clone의 염기서열 분석을 통하여 클론된 유전자의 특성을 파악한 후, STX 생합성 관련 유전자를 분리하였다. 분리된 유전자는 발현분석을 통하여 STX 생합성을 진단할 수 있는 바이오마커로 개발하고자 하였다.
Real time PCR에 의한 유전자의 발현 변화 분석을 위해서 세 개의 putative partial clone 중 기능이 확인된 SAM-S와 H2A 유전자를 선별하여 적합한 primer를 디자인하였다. Primer는 150 bp size의 product를 증폭할 수 있게 고안되었으며, 정확한 정량적 분석을 위해서 18S rRNA의 partial cDNA sequence를 이용하여 상대적인 정량을 PCR 과정을 수행하였다. Real time PCR 분석에 의한 유전자 발현의 상대적인 증가는 non-toxic strain보다 toxic strain에서 전체적으로 발현량이 증가하는 양상을 보였는데, SAM-S 유전자는 약 2배 정도 증가하였으며, H2A는 3배 정도 증가하였다[Fig.
Real time PCR에 의한 유전자의 발현 변화 분석을 위해서 세 개의 putative partial clone 중 기능이 확인된 SAM-S와 H2A 유전자를 선별하여 적합한 primer를 디자인하였다. Primer는 150 bp size의 product를 증폭할 수 있게 고안되었으며, 정확한 정량적 분석을 위해서 18S rRNA의 partial cDNA sequence를 이용하여 상대적인 정량을 PCR 과정을 수행하였다.
이전 실험에서 확인된 2개의 유전자에 대한 toxin 생성조건에 따른 시간적 발현변화를 real time PCR 방법을 이용하여 확인하였다. Real time PCR의 수행을 위해서 미세조류 배양 동안 시간별로 total RNA sampling을 실시하였다. 확보된 각각의 total RNA를 이용하여 1st strand cDNA를 만들고, internal control로 18s rRNA 유전자(primer 염기서열, forward 5'-TTGATCCTGC CAGTAGTCATATGC-3' 및 reverse 5'-CCTTGTT ACGACTTCTCCTTCCTC-3') 및 STX에 관련 된 2개의 유전자(SAM synthetase primer의 염기서열, forward 5'-ATTAGGTGACACTATAGAA-3' 및 reverse 5'-TAATA-CGACTCACTATAGGG-3'; H2A histon family primer의 염기서열, forward 5'-CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3'및 reverse 5'-TACAGATMGGCCCTGTGARC-3')에 대해 고안된 primer를 이용하여 real time PCR을 수행하였다.
1], 나머지 41개의 clone에 대해서는 재확인을 통해서 클로닝이 제대로 된 것을 확인하였다. 각 클론들의 분석을 위해서 염기서열 분석을 실시하였다.
tamarense의 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하고, 이들을 STX 생합성을 진단하기 위한 바이오마커로 활용하고자 하는 연구를 수행하였다. 독성 A. tamarense로부터 mRNA를 분리하고, 이들로부터 EST library를 제작하였다. EST clones의 염기서열을 분석하여 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하였다.
선발된 827개 클론들은 각 유전자의 5‘-말단 부위의 염기서열을 분석하였으며, 각 염기서열의 Data Base 조회결과(NCBI Blast program)에 따라 유전자를 동정하였다.
tamarense를 4,400×g로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 모았다. 액체질소내에서 막자사발을 이용하여 미세조류 세포를 파쇄한 후, 5 mL의 Trizol reagent(Molecular Research Center Inc.)를 첨가하여 total RNA를 추출하였다. Spectrophotometer를 이용하여 A260의 값을 측정하여 정량한 후, -70℃에 보관하였다.
이 연구에서는 대표적인 STX 합성 미세조류인 A. tamarense로부터 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 EST library를 구축하였다. EST clone의 염기서열 분석을 통하여 클론된 유전자의 특성을 파악한 후, STX 생합성 관련 유전자를 분리하였다.
5 unit의 Pfu DNA polymerase를 사용하여 blunt termini를 형성시켰다. 전기영동에 의해서 500 bp보다 큰 cDNA fragment들을 젤로부터 회수한 뒤 Uni-ZAP XR vector를 이용하여 ligation 반응을 수행하였다. Recombinant plasmid들은 E.
지수성장기(107 cells/mL)에 도달한 A. tamarense를 4,400×g로 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 모았다.
확보된 각각의 total RNA를 이용하여 1st strand cDNA를 만들고, internal control로 18s rRNA 유전자(primer 염기서열, forward 5'-TTGATCCTGC CAGTAGTCATATGC-3' 및 reverse 5'-CCTTGTT ACGACTTCTCCTTCCTC-3') 및 STX에 관련 된 2개의 유전자(SAM synthetase primer의 염기서열, forward 5'-ATTAGGTGACACTATAGAA-3' 및 reverse 5'-TAATA-CGACTCACTATAGGG-3'; H2A histon family primer의 염기서열, forward 5'-CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3'및 reverse 5'-TACAGATMGGCCCTGTGARC-3')에 대해 고안된 primer를 이용하여 real time PCR을 수행하였다. 형광을 검출하기 위해서 SYBR green I을 사용하였으며, thermal cycler는 RotorGene thermal cycler (RG3000, Corbett Research Co,)를 이용하였으며, Corbett Research Comparny에서 추천하는 조건에 맞게 PCR 반응을 실시하였다.
tamarense로부터 추출한 mRNA의 poly-adenylated fraction을 사용하여 2×105 pfu/ml clones의 cDNA library를 제작하였다. 확보된 827개의 EST library clone을 확인하기 위하여 대량의 plasmid mini-prep system을 이용하여 high- throughput screening을 실시하였다. Core-One Plasmid HTS Prep Kit을 이용하여 확인한 결과 총 827개의 clone중 786개의 clone에 insert가 정확히 삽입된 것으로 확인되었으며 [Fig.
확보된 EST library clone을 확인하기 위해서 대량의 plasmid mini-prep system을 이용하여 high-throughput screening을 실시하였다. 이를 위해서 Core-One Plasmid HTS Prep Kit(PHTS-30; for 96 well format, Corebio)을 이용하였다.
확보된 각각의 total RNA를 이용하여 1st strand cDNA를 만들고, internal control로 18s rRNA 유전자(primer 염기서열, forward 5'-TTGATCCTGC CAGTAGTCATATGC-3' 및 reverse 5'-CCTTGTT ACGACTTCTCCTTCCTC-3') 및 STX에 관련 된 2개의 유전자(SAM synthetase primer의 염기서열, forward 5'-ATTAGGTGACACTATAGAA-3' 및 reverse 5'-TAATA-CGACTCACTATAGGG-3'; H2A histon family primer의 염기서열, forward 5'-CTGAGCAAGGCGTTCAATTC-3'및 reverse 5'-TACAGATMGGCCCTGTGARC-3')에 대해 고안된 primer를 이용하여 real time PCR을 수행하였다.
Breathing paper로 덮고, 18시간 동안 37℃ 혼탕 배양기에서 250 rpm으로 배양하였다. 723개의 cultured EST clone은 Union 32R plus centrifuge(Hanil Co.)를 이용하여 plate 상태로 3,000 rpm, 4℃에서 원심분리하여 E. coli 세포만을 수집하였다.
STX을 생성하는 A. tamarense로부터 추출한 mRNA의 poly-adenylated fraction을 사용하여 2×105 pfu/ml clones의 cDNA library를 제작하였다.
이론/모형
이전 실험에서 확인된 2개의 유전자에 대한 toxin 생성조건에 따른 시간적 발현변화를 real time PCR 방법을 이용하여 확인하였다. Real time PCR의 수행을 위해서 미세조류 배양 동안 시간별로 total RNA sampling을 실시하였다.
성능/효과
이 결과를 EST library data와 비교 분석한 결과 총 3개의 유전자가 STX의 생합성 혹은 STX의 분비와 관련되어 발현이 증가하는 유전자로 추측되었다. 3개의 선별된 클론 중 1개의 새로운 유전자가 data base에 그 정보가 전혀 존재하지 않았으며, STX을 분비하는 A. tamarense strain에서 특이적으로 발현량이 증가되는 유전자인 것으로 추측되었다. 염기서열 분석 결과 선발된 3개의 유전자는 S-adenosylmethionine synthetase(SAM-S, 376번 clone), H2A histone family(H2A, 661번 clone) 및 hypothetical protein(423번 clone) 유전자로 확인되었다.
확보된 827개의 EST library clone을 확인하기 위하여 대량의 plasmid mini-prep system을 이용하여 high- throughput screening을 실시하였다. Core-One Plasmid HTS Prep Kit을 이용하여 확인한 결과 총 827개의 clone중 786개의 clone에 insert가 정확히 삽입된 것으로 확인되었으며 [Fig. 1], 나머지 41개의 clone에 대해서는 재확인을 통해서 클로닝이 제대로 된 것을 확인하였다. 각 클론들의 분석을 위해서 염기서열 분석을 실시하였다.
Primer는 150 bp size의 product를 증폭할 수 있게 고안되었으며, 정확한 정량적 분석을 위해서 18S rRNA의 partial cDNA sequence를 이용하여 상대적인 정량을 PCR 과정을 수행하였다. Real time PCR 분석에 의한 유전자 발현의 상대적인 증가는 non-toxic strain보다 toxic strain에서 전체적으로 발현량이 증가하는 양상을 보였는데, SAM-S 유전자는 약 2배 정도 증가하였으며, H2A는 3배 정도 증가하였다[Fig. 4].
Toxic strain과 non-toxic strain의 mRNA를 이용하여 reverse northern을 수행한 후 발현량이 증가되거나, 감소된 클론을 재확인한 결과 10개의 clone에서 현격한 증감이 확인되었다[Fig. 3]. 이 결과를 EST library data와 비교 분석한 결과 총 3개의 유전자가 STX의 생합성 혹은 STX의 분비와 관련되어 발현이 증가하는 유전자로 추측되었다.
26%) 등으로 분석되었다. 또한 SAM-S와 H2A 유전자가 클로닝되었고, 이들의 발현을 real-time PCR을 이용하여 분석한 결과, 독성 A. tamarense에서 발현이 증가하였다. 특히 H2A의 발현 변화는 STX 생합성과정이 cell-cyle과 밀접하게 관련되어 있다는 것을 나타내며, SAM-S와 H2A는 A.
EST clones의 염기서열을 분석하여 STX 생합성 관련 유전자를 클로닝하였다. 연구결과 827 클론의 염기서열이 분석되었고, 그 중 564개의 EST가 기능에 따라 분류되었다. 주요 유전자는 cellular organization (30.
tamarense strain에서 특이적으로 발현량이 증가되는 유전자인 것으로 추측되었다. 염기서열 분석 결과 선발된 3개의 유전자는 S-adenosylmethionine synthetase(SAM-S, 376번 clone), H2A histone family(H2A, 661번 clone) 및 hypothetical protein(423번 clone) 유전자로 확인되었다.
3]. 이 결과를 EST library data와 비교 분석한 결과 총 3개의 유전자가 STX의 생합성 혹은 STX의 분비와 관련되어 발현이 증가하는 유전자로 추측되었다. 3개의 선별된 클론 중 1개의 새로운 유전자가 data base에 그 정보가 전혀 존재하지 않았으며, STX을 분비하는 A.
전체 ESTs에 대한 toxic strain과 non-toxic strain으로부터의 mRNA를 이용한 reverse northern dot blotting에 의해서 발현량이 증가되거나 감소된 클론을 선별하였다. 전체 827개의 clone 중 발현량의 증감 차이를 보인 35개의 clone을 1차 선별하고, 선별된 35개의 clone을 재확인한 결과 10개의 clone에서 현격한 증감이 구분되었고, 그중 EST library data를 분석하여 2개의 STX의 생합성 혹은 STX의 분비와 관련된 유전자를 분리하였다.
전체 염기서열의 분석결과를 Genebank의 Blast program을 통해 조사한 결과, 대부분의 유전자들이 특정 생물체의 유전자와 homology를 갖는 putative clone으로 확인되었으며, 이를 통해 확보된 EST들의 functional clustering을 실시한 결과 전체 827 clone중 564개의 EST 에 대한 기능 분류가 가능하였다. 대부분 cellular organization(30.
연구결과 827 클론의 염기서열이 분석되었고, 그 중 564개의 EST가 기능에 따라 분류되었다. 주요 유전자는 cellular organization (30.54%), cell metabolism (21.34%), energy (12.13%), cell cycle과 DNA processing (8.37%), cellular transport와 transport (6.69%), cell rescue, defense, death와 aging (3.77%), transcription (2.93%) 및 cellular environment에 대한 regulation 또는 interaction (1.26%) 등으로 분석되었다. 또한 SAM-S와 H2A 유전자가 클로닝되었고, 이들의 발현을 real-time PCR을 이용하여 분석한 결과, 독성 A.
tamarense에서 발현이 증가하였다. 특히 H2A의 발현 변화는 STX 생합성과정이 cell-cyle과 밀접하게 관련되어 있다는 것을 나타내며, SAM-S와 H2A는 A. tamarense의 STX 생합성을 진단할 수 있는 좋은 바이오마커가 될 수 있음을 의미한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
해양미세조류는 연안지역에 무엇을 유발하는가?
해양미세조류는 전세계적으로 연안지역에서 적조 등과 같은 유해조류대발생(harmful algal bloom, HAB)을 유발한다[1]. 적조유발 외에도 일부 와편모조류는 독성물질을 생산하여 먹이사슬의 상위단계 생물에 독성을 유발한다[2]. 와편모조류에 의해 합성되는 독성물질 중 하나의 그룹은 마비성패독증(paralytic shellfish poisoning, PSP) 을 일으킨다.
saxitoxin 생합성에 관련된 유전자는 무엇이 있ㄴ느가?
Gonyaulax polyedra의 STX 합성 관련 연구 결과에 의하면 luciferin binding protein (LBP)이 cell cycle을 조절하여 G1 phase에서의 STX 생합성을 영향을 미친다[9,10]. Peridinin chlorophyll a binding proteins과 chlorophyll a to c binding proteins도 STX 생합성에 관련된 유전자로 알려져 있다[11,12]. 또한 cell cycle을 조절 하는 단백질로 알려진 CDC2 kinase는 Gambierdicus toxicus에서 연구되었으며, STX 생합성과 관련되었을 것으로 예상된 바 있다[13,14].
STX는 와편모조류 외에 어디서 생합성이 되는가?
와편모조류에 의해 합성되는 독성물질 중 하나의 그룹은 마비성패독증(paralytic shellfish poisoning, PSP) 을 일으킨다. 이 그룹에 포함된 독성물질 중의 하나는 saxitoxin(STX)이며[2,3], STX는 와편모조류 외에 일부 박테리아[4,5]와 남조류[6,7]에서도 생합성되는 것으로 알려져 있다. 그러나 STX의 생물학적 기능에 대해서는 아직까지도 잘 이해되지 않고 있으며, 특히 와편모조류의 STX 생합성과정의 조절에 관련해서는 거의 알려져 있지 않다[8].
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