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문제 정의
- 이상과 같은 결과에 따라서 차후에는 alumina TLC의 사용, 시약농도의 변화, 시약의 용매의 변경 및 다른 유도체화 시약의 적용에 따른 영향 등에 대하여 추가된 실험 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 잔류 전개용매와 ammonium hydroxide를 제거한 후, 254 nm UV light로 spot을 확인하였다(LOD 결정의 경우, 시약의 분무위치를 결정하기 위하여 UV 조사하에서 육안으로 확인 가능한 농도의 시료를 TLC판상 반대편에 점적하여 이와 Rf값이 유사한 부근에 분무하였다).
- 적절한 용매 조건에서 전개한 후, 건조 시키고, 254 nm UV light로 spot을 확인하였다. 1D 및 2D에서의 LOD 농도 결정은 혼합물이 아닌 단일시료 상태에서 반응시켜 결정하였다. 모든 TLC plate상의 실험은 3회 이상, 상이한 날짜에 실행하여 spot의 존재가 대조물질과 동일 Rf값에서 확인된 경우의 농도(mg/mL, 2 µL per spot)로 결정하였다.
- 3 가지 시료의 THF 저장용액을 각각 적절한 농도로 희석한 후 TLC plate에 개별적으로 혹은 혼합물로 점적하고 동일 spot상에 일정한 농도의 유도체화 시약을 점적하여 약 10분간 실온에서 반응시킨 후 건조한 다음에 hexane:ethyl acetate=3:1 비율의 전개용매에서 전개하였다.
- 3 가지의 시료의 저장용액을 적절한 농도로 희석하여 TLC plate (10 × 10 cm) 우측하단(원점)에 점적한 후(1-3의 혼합물, 반응성 시험), dichloromethane: methanol: ammonium hydroxide=9:1:0.1 비율로 제조된 전개용매 조건에서 1차 전개(1st, Fig. 4)하였다.
- 3,7 특히, 현장과 감정기관에서 마약류 확인 차원의 예비실험으로 빠르고 간단하게 사용할 수 있는 TLC 용 유도체화 시약으로서 FMOC-NHS (Fig. 1)의 amphetamine류 화합물에 대한 활용 가능성을 알아보기 위하여 3 가지 phenethylamine류 화합물(Fig. 2)과 silica gel TLC상에서의 직접적인 유도체화 반응성을 1D와 2D의 방법으로 실행하여 대조 화합물(R1, R2 및 R3)과 비교한 실험 결과를 Fig. 4에 제시하였다.
- 3-5 그러나 본 실험에서는 유도체화 시약에 의한 직접적인 TLC상 반응을 통하여 검출한계가 알려진 바 없는 시료를 적정한 농도로 희석한 후, 방해물질이 없는 순수한 상태에서 얻은 유도체화 반응 생성물을 UV 조사 하에서 관찰한 결과로부터 확인된 시료의 최저 검출농도(mg/mL, 2 µL per spot)를 Table 1에 정리하였다.
- 3가지의 아민 시료 화합물(1-3)을 각각 THF 용액에 10 mg/mL의 농도로 저장용액을 만든 다음에 적정농도로 희석시킨 시료를 TLC plate (5 × 10 cm, 1D; 10 × 10 cm, 2D)에 점적한 후, THF에 녹여 제조된 유도체화 시약 5 mg/mL의 저장용액을 적절한 농도의 동일 용매로 희석시키고, 시료 spot상에 점적(1D cospot) 또는 spray 방법(2D)으로 반응시켰다.
- 모든 1H NMR spectra는 CDCl3를 사용하였을 경우, 내부 표준물질 tetramethylsilane (TMS)의 피크에 준하여 δ 단위 (ppm)로 확인하였다. CD3OD 용매내 시료들에 대하여는 3.30 ppm, 그리고 d6-DMSO 용매중의 시료들에 대하여는 2.49 ppm에서 나타나는 5중선의 중심선을 기준선으로 하여 확인하였다. 짝지움 상수(J)들은 hertz (Hz) 단위로 확인하였다.
- 질량분석 스펙트럼(MS)은 Waters의 ACQUITY UPLC, Micromass Quattro microTM API기기를 사용하여 얻었다. Column chromatography는 silica gel (Merck, grade 60, 230-400 mesh)을 사용하여 이루어졌다.
- 4. Photographs of actual silica gel 2D (left) and 1D (right) TLCs showing spots of derivatized phenethylamines (1-3) after reaction with derivatizing reagent (FMOC-NHS, F) with spots of reference compounds (R1, R2 and R3), F, S, co-spot of sample 1, 2, 3 and F; 1st, first development; 2nd, second development.
- 3에 제시하였다. THF용액 내 각 아민 시료와 FMOC-NHS (1.2당량)의 혼합물을 4시간 동안 실온에서 저어주었다. 반응액의 용매를 농축한 후, 잔사는 cyclohexane 용매내 30% ethyl acetate를 사용하여 silica gel column chromatography에 의하여 정제하였으며 백색 고형상 화합물을 얻었다.
- 2)과 대조물질을 합성하여, silica gel TLC상에서의 유도체화 반응성을 비교하고 검출한계(LOD) 농도를 탐색하였다. 또한, 유도체화 반응에 영향을 미칠 수 있는 시약 농도의 적정화를 시도하였다.
- 4에 제시하였다. 먼저, 2D 실험에서 시료 혼합물(1-3)을 1차 전개로 분리한 경우, 이동상 중 보조용매 ammonium hydroxide를 사용하여 끌림현상을 감소시키고, 강하게 UV-active한 fluorenyl-기를 amino-기에 빠르고 용이하게 결합시키기 위하여 FMOC-NHS를 분무하여 반응 시켰다. FMOC-NHS는 아민과 반응 시 염기(base)를 필요로 하지 않으며 상온에서 짧은 시간에 높은 수득률을 보인다.
- 모든 TLC plate상의 실험은 3회 이상, 상이한 날짜에 실행하여 spot의 존재가 대조물질과 동일 Rf값에서 확인된 경우의 농도(mg/mL, 2 µL per spot)로 결정하였다.
- 반응액의 용매를 농축한 후, 잔사는 cyclohexane 용매내 30% ethyl acetate를 사용하여 silica gel column chromatography에 의하여 정제하였으며 백색 고형상 화합물을 얻었다.
- 본 연구에서는 FMOC-NHS (Fig. 1)와 아민을 함유한 amphetamine류에 대한 유도체화 반응을 이용하여 현장 적용은 물론, 감정기관에서 사용할 수 있는 빠르고 용이한 screening방법으로서 TLC상에서 직접적인 유도체화 시약으로서의 활용 가능성을 타진하기 위하여 amphetamine류 화합물과 유사한 구조를 가진 3 가지 phenethylamine류 화합물(Fig. 2)과 대조물질을 합성하여, silica gel TLC상에서의 유도체화 반응성을 비교하고 검출한계(LOD) 농도를 탐색하였다. 또한, 유도체화 반응에 영향을 미칠 수 있는 시약 농도의 적정화를 시도하였다.
- 4)을 시켰다. 비교를 위하여 유도체화 시약(F)과 대조 화합물(R1-R3)을 적절한 농도로 THF에 녹여 반응시의 시료와 동일선상에 각기 점적한 후 전개하였다.
- 아민을 함유한 마약류에 대한 용이한 screening방법의 개발을 위한 선행실험으로서 silica gel TLC상에서 amphetamine류와 유사한 phenethylamine류 화합물(1-3)과 유도체화 시약(FMOC-NHS)과의 직접적인 반응 및 이를 이용한 검출한계를 평가한 결과로부터 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 현장에서는 일반적으로 정성적 감도(Qualitative sensitivity)가 높은 면역분석법을 사용하여 음성과 양성으로 판단한다. 양성인 시료에 대하여는 감정기관에서 GC/MS 등을 사용하여 확인 실험을 한다. 확인 실험에서는 주로chromatography를 사용하여 불법약물을 순수하게 분리한 후, 특정한 검출기(예, 질량분석기)를 사용하여 각 물질의 구조 확인 및 농도를 측정한다.
- 짝지움 상수(J)들은 hertz (Hz) 단위로 확인하였다. 질량분석 스펙트럼(MS)은 Waters의 ACQUITY UPLC, Micromass Quattro microTM API기기를 사용하여 얻었다. Column chromatography는 silica gel (Merck, grade 60, 230-400 mesh)을 사용하여 이루어졌다.
- 4)후, TLC plate 상의 전개용매를 제거한 다음에 254 nm UV light로 spot을 확인하였다. 최종 전개 결과를 비교하고자 2차 전개 전 1차 전개 후 전개된 시료와 동일선상(X 축)에 유도체화 시약(F, Fig. 4)과 대조 화합물(R1, R2 및 R3, Fig. 4)을 점적하였다.
- 통상 적정농도의 시료 및 유도체화 시약(1D co-spot)은 2 µL (per spot)의 양으로 실험하였다.
- 모든 TLC plate상의 실험은 3회 이상, 상이한 날짜에 실행하여 spot의 존재가 대조물질과 동일 Rf값에서 확인된 경우의 농도(mg/mL, 2 µL per spot)로 결정하였다. 화학적으로 다른 3종 시료의 유도체화 시약에 대한 상대적인 반응성을 검토하고자 혼합물의 상태로 반응(S, 1D co-spot, Fig. 4) 혹은 분리 후 반응(2D spray, Fig. 4)을 시켰다. 비교를 위하여 유도체화 시약(F)과 대조 화합물(R1-R3)을 적절한 농도로 THF에 녹여 반응시의 시료와 동일선상에 각기 점적한 후 전개하였다.
- 양성인 시료에 대하여는 감정기관에서 GC/MS 등을 사용하여 확인 실험을 한다. 확인 실험에서는 주로chromatography를 사용하여 불법약물을 순수하게 분리한 후, 특정한 검출기(예, 질량분석기)를 사용하여 각 물질의 구조 확인 및 농도를 측정한다. 화합물 분리를 위해 사용하는 chromatography는 HPLC, LC, GC 및 TLC 등이 있다.
대상 데이터
- Silica gel TLC plate (20 × 20 cm silica gel 60 F254, Aluminium plate)는 Merck(Germany)사의 제품으로 형광물질이 도포되어 있어서 UV 조사 시 강한 형광을 내는 제품을 사용하였다.
- Acetone 용매는 Jin Chemical, 전개용매로 사용된 메클로로메탄과 메탄올은 Burdick & Jackson사, 아민을 위한 보조 전개용매로 사용된 암모니아 용액(28%)은 Junsei (Japan)사에서 각각 구입하였으며 모든 시약들과 용매들은 상품화 된 것들을 구입하여 추가적인 정제 없이 사용하였다.
- 시료로 사용된 3종의 아민함유 화합물(1-3; Fig. 2), phenethylamine, N-methylphenethylamine, DL-α-methylbenzylamine은 Sigma-Aldrich사에서 free base상태로 구입하여 사용하였다.
- 합성을 위해 사용된 실험기기로는 Rotary Evaporator N-1000 (EYELA, JAPAN), DOA-P704-AC/Vacuum & Pressure Pump(GAST, U.S.A), 400 MHz FT-NMR (Akishima, Japan)을 사용하였다.
이론/모형
- TLC상 유도체화 반응에 사용된 시약 FMOC-NHS(Fig. 1)는 Acros(USA)사에서 구입하여 tetrahydrofuran(이하 THF)에 적정농도로 녹여 점적(1D co-spot) 혹은 spray방법(2D)으로 TLC상에 적용하였다.
성능/효과
- 1. FMOC-NHS는 아민함유 화합물 1-3과 실온에서 빠르게 반응하여 강하게 UV-active한 fluorenyl 유도체를 생성하였으나 이들이 혼합물의 상태로 반응할 경우에는 경쟁성을 나타내므로 주의가 필요하였다.
- 2. 1D 실험에서 검출한계 농도(0.002~0.007 mg/mL)는 2D 실험에서의 검출한계 농도(0.01~0.045 mg/mL)보다 낮았으며 검출한계는 유도체화 시약의 농도에 의존성을 보였다.
- 2D 실험에서는 분무 시약의 농도를 알아 본 결과(data not shown), 5 mg/mL, 1 mg/mL 및 0.5 mg/mL에서 차이가 없었으며 고농도(5 mg/mL)를 사용할 경우에는 미반응 시약의 과량존재 및 시약 분해물 등으로 인하여 강한 밴드(band)가 TLC상에서 관찰되었다. Fig.
- 3. 유도체화 반응 후, UV에 의한 검출한계는 유도체화 반응 전에 비하여 2D 실험의 경우에는 13~60배, 그리고 1D 실험에서는 86~300 배의 향상을 각각 나타내었다.
- 4. 유도체화 시약으로서 FMOC-NHS는 silica gel TLC상에서 아민함유 화합물에 대해 빠르고 간편하게 검출한계를 향상시킬 수 있는 가능성을 보였다.
- 모든 반응에서 100%에 가까운 수득률을 보였으며 TLC, 1H-NMR 및 LC-MS(ESI) 등의 방법으로 합성된 대조물질들이 알려진 화합물과 동일함을 확인 하였다.
- 물론 현재의 방법으로 향상된 검출한계 농도는 면역분석법에 비해 매우 높으나 분석물질 유도체의 TLC상 분리 후 대조물질과의 비교를 통해 특정성을 다소 높일 수 있고, 차후 기존에 알려진 다른 유도체화 시약을 제시된 방법으로 반응하여 감도를 증가시킬 수 있는 가능성을 제시하였다.
- 007 mg/mL보다 전반적으로 높은 농도에서 시료를 관찰할 수 있었다. 이 결과는 유도체화 반응 전에 비하여 2D 실험의 경우에 13 배에서 60 배, 그리고 1D 실험의 경우에 90 배에서 300 배에 이르는 향상된 검출결과를 보여준다. 2D 실험의 검출한계의 농도가 높은 이유는 1차 전개 시, 시료 spot의 끌림으로 밴드(band)가 넓게 형성되어 유도체화 반응 후, 2차 전개가 이루어지는 동안에 spot이 희석되어 넓게 퍼지므로 시료 물질의 확인이 불가능한 것으로 보인다.
후속연구
- 차후, 관련 기관의 승인 하에 실제 아민함유 마약류에 대한 실험들이 진행되어야 할 것이다. 또한, 혼합물의 형태로 직접적인 TLC상 반응(1D 혹은 2D)을 통하여 앞서의 실험 예와 유사한 방법으로 다양한 아민류 화합물은 물론, 2차-아민의 반응성이 감소되지 않는 특정한 시약의 검출한계에 미치는 전개용매의 조성 및 유사물질과의 반응을 통한 선택성 확인 실험에 관련한 연구가 이루어져야 하겠다.
- 33 비록 현실에서 관련법의 제약으로 인하여 실제의 amphetamine류 시료 물질을 사용하지 못하였으나, 이들 마약류를 사용하여 실험할 경우 결과는 유사할 것으로 예측된다. 차후, 관련 기관의 승인 하에 실제 아민함유 마약류에 대한 실험들이 진행되어야 할 것이다. 또한, 혼합물의 형태로 직접적인 TLC상 반응(1D 혹은 2D)을 통하여 앞서의 실험 예와 유사한 방법으로 다양한 아민류 화합물은 물론, 2차-아민의 반응성이 감소되지 않는 특정한 시약의 검출한계에 미치는 전개용매의 조성 및 유사물질과의 반응을 통한 선택성 확인 실험에 관련한 연구가 이루어져야 하겠다.
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