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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 중국과 우리나라에 수입되는 정공등의 품질평가 방법이 미비함에 착안하여 주성분인 coumarin류와 chlorogenic acid류를 분리하여 기기분석을 실시하여 구조를 규명한 후 검체 20종을 채취하고 이와 함께 HPLC-UV 방법을 이용 다성분 함량분석을 실시하여 정공등의 원료에 대한 다성분 함량분석방법을 개발하는데 그 목적이 있고 나아가 다성분 패턴을 이용 PCA 군집 분석을 통하여 기원종을 구분하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 1~200 µg/ml의 농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다.
- HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 정공등의 지표물질 5가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 10개 피크의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi-Variate Statistical Package(Version 3.
- HPLC를 이용한 분석법 검증(validation) − 정공등에서 분리한 3 가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization)가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다.
- ICH 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하여 단계별로 희석한 표준액을 반복측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy), 및 정밀성(precision)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
- 30 부근에서 파란색 반점으로 나타난다. Positive FAB-MS spectrum에서 m/z 355에서 M+H의 molecular ion peak를 관찰 하였다.
- Scheme 1와 같이 분획한 후 주성분을 함유하는 Water와 butanol 분획에서 compound 5종을 분리하여 각종기기분석을 이용 확인 동정하였다.
- HPLC를 이용한 분석법 검증(validation) − 정공등에서 분리한 3 가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization)가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다. 각각 농도의 표준액을 반복 측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)12)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
- 각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR, FAB-Mass, ESI-Mass)을 통하여 compound 1은 (1R,3S,4R,5S)-4-((E)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)acryloyloxy)-1,3,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 인 crypto-chlorogenic acid(C16H18O9)로, compound 2는 7-(β-D-glucopyranosyloxy)-6-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one 인 scopolin(C16H18O9), compound 3은 (1R,3S,4R,5S)-5-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,4-trihydroxycyclohexane-carboxylic acid인 neochlorogenic acid(C16H18O9)으로, Compound 4는 3,4-di-O-caffeoylquinic acid로 확인 동정하였다.
- 검량선의 y 절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
- 먼저 천연물화학적 방법으로 methanol로 추출하고, 주성분이 함유되어 있는 butanol과 water 분획을 column chromatography를 실시하고 4종 coumarin 성분과 chlorogenic acid 성분을 분리하였다.
- )으로, Compound 4는 3,4-di-O-caffeoylquinic acid로 확인 동정하였다. 분리된 compound 2, 3, 4와 scopolin의 가수분해물인 scopoletin을 지표 성분으로 설정하여 HPLC 분석조건을 확립하였다.
- 분석물질에 대하여 특이적이고 식별성을 가진 방법임을 입증하기 위해 compound 2, 3, 4 및 scopoletin을 혼합하였을 경우 peak가 확실하게 분리되어 나타나는 것으로 특이성을 확인하였다.
- 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인 하였다.
- 이상의 결과와 문헌을 비교하여,17) 이 compound를 3,4-di-Ocaffeoylquinic acid로 확인 동정하였다(Fig. 1).
- 일정농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 지표성분과 피크면적의 결과로 회수율과 상대표준편차(RSD%)를 확인 하여 정확성을 측정하였다.
- 일정농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 지표성분과 피크면적의 결과로 회수율과 상대표준편차(RSD%)를 확인 하여 정확성을 측정하였다.
- 그 후 물 엑스에 ethyl acetate를 가하여 진탕 반복추출하고 분액깔때기에서 분획하여 ethyl acetate 층과 물층을 분취한 후 이를 감압 농축하여 ethyl acetate 엑스 31 g을 얻었다. 잔사를 포함하여 4개의 분획으로 나눈 후, 아래 Scheme 1의 방법으로 분리하였으며 총 4개의 compound를 순수 분리하였다(Scheme 1).
- 정공등에서 주성분으로 분리하여 동시분석 가능한 3개의 compound 2, 3, 4와 scopolin의 가수분해 물질인 scopoletin을 표준물질로 하여 HPLC를 통한 정공등의 분석법 개발 및 함량 모니터링을 실시하였다.
- 정밀성(precision) − 확립된 분석 방법의 반복성을 확인하기 위하여 같은 농도에 대하여 3번 반복실험을 하였으며, 실험실 내 정밀성을 확인하기 위하여 실험자 등을 변경 후 4가지 시료에 대하여 반복실험 하였다.
- 정확성(accuracy) − 확립된 분석방법의 정확성을 확인하기 위하여 3가지 농도에 대하여 3번 반복 실험하였으며, 3개의 농도를 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 구하였다.
- 지역별로 수집한 20개의 시료를 검증된 분석법을 이용하여 HPLC 함량 모니터링을 실시하였다(Fig. 4, Table VIII).
- 표준생약의 조제 − 정공등에서 분리한 compound 2, 3, 4와 scopoletin을 1 mg 정확하게 취하여 methanol 1 ml를 가한 후 단계별로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- SAMPLE 수집 − 본 실험에서 사용한 정공등은 총 20점으로 중국에서 정공등으로 유통되고 있는 것을 수집하여 검체로 사용하였다(Table II).
- 본 실험에 사용한 기기로는 UV-VIS spectrophotometer(Optizen 2120UV, Korea), FAB-MS(VG 70-VSEQ, England, Source-ionized by 35 keVCs+ ion beam, Matrix-glycerol), 1H-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 600 MHz, U.S.A), 13C-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 125 MHz, U.S.A.) 등을 사용하였고 분석용 기구 및 시약으로는 TLC(Kieselgel 60 F254, Merck, Germany), Diaion-HP 20(Nippon Rensui Co., Japan), Sephadex-LH 20(25~100 µm, Parmacia, Sweden), MCI gel CHP20P(75~150 µm, Mitsubishi, Japan) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 정공등(Erycibe obtusifolia Benth.)은 중국 호남중의학대학 유향전교수에게 의뢰하여 식물학적 감정을 한 후 분리 실험에 사용하였으며 중국에서 유통되는 검체는 직접 중국에서 20점(중국 유통품)을 수집하여 중앙대학교 약품자원식물 학교실에서 기원에 대한 식물학적 감정을 거친 후 사용하였다.
- , Japan), Sephadex-LH 20(25~100 µm, Parmacia, Sweden), MCI gel CHP20P(75~150 µm, Mitsubishi, Japan) 등을 사용하였다. 분석을 위한 HPLC 분석장비는 Waters 600, Waters 2489 detector, Waters 717 plus Autoampler와 Column은 AKZO NOBEL. KR-100-5C18(4.
- 45 µM을 사용하였다. 추출 및 분획에 사용된 methanol, ethanol, chloroform, ethyl acetate, butanol의 시약은 Samchun pure chemical(Korea) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 정공등의 지표물질 5가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 10개 피크의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi-Variate Statistical Package(Version 3.13p) 프로그램을 사용하였고, 총 20개 정공등의 4종의 지표물질 면적을 변수로 하여 군집 분석을 실시하였다(Fig. 5, 6).
- 기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
- 다른 실험자가 각각 4개의 표준액을 조제한 후 3회 주입하여 실험실 내 정밀성을 측정하였으며 측정한 결과를 피크 면적비의 상대표준편차(RSD%)로 확인하였다.
- 1~200 µg/ml의 농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이를 이용하여 검량선을 작성하였으며 검량선으로부터 직선식의 상관계수(correlation coefficient)를 구하여 직선성을 확인하였다.
- 시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인 하였다.
- 측정한 결과를 피크면적비의 상대표준편차로서 나타내었으며 전체적으로 3% 이내의 비교적 만족스러운 정밀성을 보이고 있으므로 이를 통하여 분석법의 정밀성을 확보하였다(Table VII).
성능/효과
- HPLC를 이용한 모니터링 결과, 정공등은 수집한 샘플 모두에서 유사한 패턴을 보였으며, 평균적으로 scopolin 0.25±0.062%, scopoletin 0.2±0.068%, neochlorogenic acid 0.102±0.062%, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid 0.073±0.042%를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Table VIII).
- 각 성분피크 면적비의 표준편차를 각 성분피크 면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였으며 compound 2는 0.43%의 정밀성을 나타내었고 compound 3은 0.65%, compound 4는 0.53%, scopoletin은 0.82%의 반복성을 나타내었다(Table VI).
- 정확성(accuracy) − 확립된 분석방법의 정확성을 확인하기 위하여 3가지 농도에 대하여 3번 반복 실험하였으며, 3개의 농도를 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 구하였다. 그 값은 compound 2이 95.32~102.99%, compound 3는 95.77~102.71%, compound 4는 94.39~103.59%, scopoletin 은 94.50~108.60%의 정확성을 나타내었다. 이를 통하여 분석법의 정확성을 확보하였다(Table V).
- 그 결과, 정공등은 지역별로 시판되고 있는 유통품은 함유된 성분이 비슷하지만 각 성분함량이 차이를 보였으며, 중국 호남, 호북성 그리고 광동, 광서성 지역의 것이 4종의 함량기준을 이용한 군집 분석을 통하여 확인할 수 있었다.
- 이상의 가이드라인을 바탕으로 HPLC를 이용하여 국내 및 중국에서 유통되고 있는 정공등 20종에 대한 함량평가를 실시한 결과 전체 시료에서 scopolin 0.25±0.062%, scopoletin 0.2± 0.068%, neochlorogenic acid 0.102±0.062%, 3,4-di-O-caffeoyl-quinic acid 0.073±0.042%를 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과와 문헌을 비교하여,13,14) 이 compound를(1R,3S,4R,5S)-4-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,5- trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 즉, crypto-chlorogenic acid(C16H18O9)로 확인 동정하였다.
- 이상의 결과와 문헌을 비교하여,16) 이 compound를(1R,3S,4R,5S)- 5-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,4-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 즉, neochlorogenic acid(C16H18O9)로 확인 동정하였다.
- 이상의 결과와 문헌을 비교하여,3,15) 이 compound를(β-D-glucopyranosoyloxy)-6-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one 즉, scopolin으로 확인 동정하였다.
- 직선성(Linearity) − Compound 2, 3, 4와 scopoletin의 표준액을 1~200 µg/ml의 범위에서 4가지 성분 모두 검량선 상관계수가 0.999 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다(Fig. 3, Table III).
- 특이성(Specificity) − Compound 2, 3, 4와 scopoletin을 이들 성분의 머무름 시간은 각각 compound 2가 약 15.5 min, compound 3이 약 14.2 min, compound 4가 약 24 min, scopoletin이 약 30.6 min에 명확하게 분리되어 나타나는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).
후속연구
- 또한 HPLC를 이용한 함량평가 결과를 이용한 다변량분석(PCA)을 통하여 종간 또는 지역별 유사성 실험을 실시하였으며 그 결과 지역별로 시판되고 있는 정공등 유통품은 함유된 성분이 패턴은 비슷하지만 각 성분함량에서 큰 차이를 보이고 있어 산지를 확인하는데 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합하여 중국 뿐만 아니라 우리나라에 수입 유통되는 정공등에 대하여 주성분인 scopolin, scopoletin, neochlorogenic acid 및 3,4-di-O-caffeoylquinic acid등 4종을 이용 다성분 함량 품질 평가 방법을 개발하였으며 또한 PCA군집 분석을 통하여 유통품의 주산지를 확인 할 수 있어서 앞으로 정공등을 이용한 의약품 및 기능성 식품개발에 기초자료로서 제공될 수 있을 것으로 사료된다.
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