In this study, we developed and validated the HPLC method using the isolated components from Erycibae caulis. Their structures were elucidated by spectroscopic methods including UV, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, FAB-Mass and ESI-Mass as Compound 1 (crypto-chlorogenic acid), Compound...
In this study, we developed and validated the HPLC method using the isolated components from Erycibae caulis. Their structures were elucidated by spectroscopic methods including UV, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, FAB-Mass and ESI-Mass as Compound 1 (crypto-chlorogenic acid), Compound 2 (scopolin), Compound 3 (neochlorogenic acid) and Compound 4 (3,4-di-O-caffeoylquinic acid). Major three compounds and scopoletin were decided as representative components of Erycibae caulis. We established HPLC analytical method by using the representative components and 20 commercial samples which were collected considering to various cultivated area. The HPLC fingerprinting was successfully achieved with an AKZO NOBEL Kromasil 100-5C18 column. The mobile phase consisted of 0.5% acetic acid in water (A) and methanol (B) using gradient method of 85(A) to 50(A) for 35min. The fingerprints of chromatograms were recorded at an optimized wavelength of 330 nm. This developed analytical method was validated with specificity, selectivity, accuracy and precision. And it is suggested that scopolin, scopoletin, neochlorogenic acid, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid were more than 0.162%, 0.133%, 0.057%, 0.044%, respectively. In addition, principal component analysis (PCA) was performed on the analytical data of 20 different Erycibae caulis samples in order to classify samples collected from different regions. We hope that this assay can be readily utilized as quality control method for Erycibae caulis.
In this study, we developed and validated the HPLC method using the isolated components from Erycibae caulis. Their structures were elucidated by spectroscopic methods including UV, $^1H$-NMR, $^{13}C$-NMR, FAB-Mass and ESI-Mass as Compound 1 (crypto-chlorogenic acid), Compound 2 (scopolin), Compound 3 (neochlorogenic acid) and Compound 4 (3,4-di-O-caffeoylquinic acid). Major three compounds and scopoletin were decided as representative components of Erycibae caulis. We established HPLC analytical method by using the representative components and 20 commercial samples which were collected considering to various cultivated area. The HPLC fingerprinting was successfully achieved with an AKZO NOBEL Kromasil 100-5C18 column. The mobile phase consisted of 0.5% acetic acid in water (A) and methanol (B) using gradient method of 85(A) to 50(A) for 35min. The fingerprints of chromatograms were recorded at an optimized wavelength of 330 nm. This developed analytical method was validated with specificity, selectivity, accuracy and precision. And it is suggested that scopolin, scopoletin, neochlorogenic acid, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid were more than 0.162%, 0.133%, 0.057%, 0.044%, respectively. In addition, principal component analysis (PCA) was performed on the analytical data of 20 different Erycibae caulis samples in order to classify samples collected from different regions. We hope that this assay can be readily utilized as quality control method for Erycibae caulis.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 중국과 우리나라에 수입되는 정공등의 품질평가 방법이 미비함에 착안하여 주성분인 coumarin류와 chlorogenic acid류를 분리하여 기기분석을 실시하여 구조를 규명한 후 검체 20종을 채취하고 이와 함께 HPLC-UV 방법을 이용 다성분 함량분석을 실시하여 정공등의 원료에 대한 다성분 함량분석방법을 개발하는데 그 목적이 있고 나아가 다성분 패턴을 이용 PCA 군집 분석을 통하여 기원종을 구분하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
1~200 µg/ml의 농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다.
HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 정공등의 지표물질 5가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 10개 피크의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi-Variate Statistical Package(Version 3.
HPLC를 이용한 분석법 검증(validation) − 정공등에서 분리한 3 가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization)가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다.
ICH 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하여 단계별로 희석한 표준액을 반복측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy), 및 정밀성(precision)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
30 부근에서 파란색 반점으로 나타난다. Positive FAB-MS spectrum에서 m/z 355에서 M+H의 molecular ion peak를 관찰 하였다.
Scheme 1와 같이 분획한 후 주성분을 함유하는 Water와 butanol 분획에서 compound 5종을 분리하여 각종기기분석을 이용 확인 동정하였다.
HPLC를 이용한 분석법 검증(validation) − 정공등에서 분리한 3 가지 주성분을 지표로 하여 HPLC-UV를 이용한 다 성분 동시분석법을 설정하였고 이에 대하여 ICH(International Conference on Harmonization)가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하였다. 각각 농도의 표준액을 반복 측정하여 선택성(specificity), 직선성(linearity), 정량한계(LOQ), 검출한계(LOD), 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)12)을 측정하여 분석법의 타당성을 검증하였다.
각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR, FAB-Mass, ESI-Mass)을 통하여 compound 1은 (1R,3S,4R,5S)-4-((E)-3-(3,4-dihydroxy-phenyl)acryloyloxy)-1,3,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 인 crypto-chlorogenic acid(C16H18O9)로, compound 2는 7-(β-D-glucopyranosyloxy)-6-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one 인 scopolin(C16H18O9), compound 3은 (1R,3S,4R,5S)-5-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,4-trihydroxycyclohexane-carboxylic acid인 neochlorogenic acid(C16H18O9)으로, Compound 4는 3,4-di-O-caffeoylquinic acid로 확인 동정하였다.
검량선의 y 절편의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법으로, 표준용액을 단계별로 3회 반복 측정한 평균값으로 검량선을 작성하여 다음의 식에 따라 계산하여 검출한계와 정량한계를 확인하였다.
먼저 천연물화학적 방법으로 methanol로 추출하고, 주성분이 함유되어 있는 butanol과 water 분획을 column chromatography를 실시하고 4종 coumarin 성분과 chlorogenic acid 성분을 분리하였다.
분석물질에 대하여 특이적이고 식별성을 가진 방법임을 입증하기 위해 compound 2, 3, 4 및 scopoletin을 혼합하였을 경우 peak가 확실하게 분리되어 나타나는 것으로 특이성을 확인하였다.
시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인 하였다.
이상의 결과와 문헌을 비교하여,17) 이 compound를 3,4-di-Ocaffeoylquinic acid로 확인 동정하였다(Fig. 1).
일정농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 지표성분과 피크면적의 결과로 회수율과 상대표준편차(RSD%)를 확인 하여 정확성을 측정하였다.
일정농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이와 같은 방법으로 실험하여 HPLC 크로마토그램에서 지표성분과 피크면적의 결과로 회수율과 상대표준편차(RSD%)를 확인 하여 정확성을 측정하였다.
그 후 물 엑스에 ethyl acetate를 가하여 진탕 반복추출하고 분액깔때기에서 분획하여 ethyl acetate 층과 물층을 분취한 후 이를 감압 농축하여 ethyl acetate 엑스 31 g을 얻었다. 잔사를 포함하여 4개의 분획으로 나눈 후, 아래 Scheme 1의 방법으로 분리하였으며 총 4개의 compound를 순수 분리하였다(Scheme 1).
정공등에서 주성분으로 분리하여 동시분석 가능한 3개의 compound 2, 3, 4와 scopolin의 가수분해 물질인 scopoletin을 표준물질로 하여 HPLC를 통한 정공등의 분석법 개발 및 함량 모니터링을 실시하였다.
정밀성(precision) − 확립된 분석 방법의 반복성을 확인하기 위하여 같은 농도에 대하여 3번 반복실험을 하였으며, 실험실 내 정밀성을 확인하기 위하여 실험자 등을 변경 후 4가지 시료에 대하여 반복실험 하였다.
정확성(accuracy) − 확립된 분석방법의 정확성을 확인하기 위하여 3가지 농도에 대하여 3번 반복 실험하였으며, 3개의 농도를 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 구하였다.
표준생약의 조제 − 정공등에서 분리한 compound 2, 3, 4와 scopoletin을 1 mg 정확하게 취하여 methanol 1 ml를 가한 후 단계별로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
SAMPLE 수집 − 본 실험에서 사용한 정공등은 총 20점으로 중국에서 정공등으로 유통되고 있는 것을 수집하여 검체로 사용하였다(Table II).
본 실험에 사용한 기기로는 UV-VIS spectrophotometer(Optizen 2120UV, Korea), FAB-MS(VG 70-VSEQ, England, Source-ionized by 35 keVCs+ ion beam, Matrix-glycerol), 1H-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 600 MHz, U.S.A), 13C-NMR spectrometer(Varian Gemini 2000, 125 MHz, U.S.A.) 등을 사용하였고 분석용 기구 및 시약으로는 TLC(Kieselgel 60 F254, Merck, Germany), Diaion-HP 20(Nippon Rensui Co., Japan), Sephadex-LH 20(25~100 µm, Parmacia, Sweden), MCI gel CHP20P(75~150 µm, Mitsubishi, Japan) 등을 사용하였다.
본 실험에 사용한 정공등(Erycibe obtusifolia Benth.)은 중국 호남중의학대학 유향전교수에게 의뢰하여 식물학적 감정을 한 후 분리 실험에 사용하였으며 중국에서 유통되는 검체는 직접 중국에서 20점(중국 유통품)을 수집하여 중앙대학교 약품자원식물 학교실에서 기원에 대한 식물학적 감정을 거친 후 사용하였다.
, Japan), Sephadex-LH 20(25~100 µm, Parmacia, Sweden), MCI gel CHP20P(75~150 µm, Mitsubishi, Japan) 등을 사용하였다. 분석을 위한 HPLC 분석장비는 Waters 600, Waters 2489 detector, Waters 717 plus Autoampler와 Column은 AKZO NOBEL. KR-100-5C18(4.
45 µM을 사용하였다. 추출 및 분획에 사용된 methanol, ethanol, chloroform, ethyl acetate, butanol의 시약은 Samchun pure chemical(Korea) 제품을 사용하였다.
데이터처리
HPLC/UV를 이용한 함량분석에서 정공등의 지표물질 5가지를 포함한 주변 피크들을 포함하여 총 10개 피크의 면적을 변수로 하여 군집 분석(cluster analysis)과 주성분 분석(principal component analysis)에 적용하여 패턴분석을 하였다. 군집 분석과 주성분 분석에는 Kovach Computery Services사의 Multi-Variate Statistical Package(Version 3.13p) 프로그램을 사용하였고, 총 20개 정공등의 4종의 지표물질 면적을 변수로 하여 군집 분석을 실시하였다(Fig. 5, 6).
기울기 S는 분석대상물질의 검량선으로부터 구하였으며 표준편차(σ)는 정량한계 내에 있는 분석대상물질을 포함한 검체를 사용하여 특이적인 검량선을 작성한 후 y 절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
다른 실험자가 각각 4개의 표준액을 조제한 후 3회 주입하여 실험실 내 정밀성을 측정하였으며 측정한 결과를 피크 면적비의 상대표준편차(RSD%)로 확인하였다.
1~200 µg/ml의 농도의 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 각각의 샘플을 확립된 분석법을 이용하여 3회 주입하였다. 이를 이용하여 검량선을 작성하였으며 검량선으로부터 직선식의 상관계수(correlation coefficient)를 구하여 직선성을 확인하였다.
시험농도의 100%에 해당하는 농도로 compound 2, 3, 4 및 scopoletin의 표준액을 조제하여 분석법의 전 조작을 3회 반복 측정하였다. 이에 따른 결과를 상대표준편차(RSD%)로 확인 하였다.
측정한 결과를 피크면적비의 상대표준편차로서 나타내었으며 전체적으로 3% 이내의 비교적 만족스러운 정밀성을 보이고 있으므로 이를 통하여 분석법의 정밀성을 확보하였다(Table VII).
성능/효과
HPLC를 이용한 모니터링 결과, 정공등은 수집한 샘플 모두에서 유사한 패턴을 보였으며, 평균적으로 scopolin 0.25±0.062%, scopoletin 0.2±0.068%, neochlorogenic acid 0.102±0.062%, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid 0.073±0.042%를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다(Table VIII).
각 성분피크 면적비의 표준편차를 각 성분피크 면적비의 평균값으로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였으며 compound 2는 0.43%의 정밀성을 나타내었고 compound 3은 0.65%, compound 4는 0.53%, scopoletin은 0.82%의 반복성을 나타내었다(Table VI).
정확성(accuracy) − 확립된 분석방법의 정확성을 확인하기 위하여 3가지 농도에 대하여 3번 반복 실험하였으며, 3개의 농도를 주입하여 검량선에 따라 구해진 값과 참값을 비교한 회수율로 구하였다. 그 값은 compound 2이 95.32~102.99%, compound 3는 95.77~102.71%, compound 4는 94.39~103.59%, scopoletin 은 94.50~108.60%의 정확성을 나타내었다. 이를 통하여 분석법의 정확성을 확보하였다(Table V).
그 결과, 정공등은 지역별로 시판되고 있는 유통품은 함유된 성분이 비슷하지만 각 성분함량이 차이를 보였으며, 중국 호남, 호북성 그리고 광동, 광서성 지역의 것이 4종의 함량기준을 이용한 군집 분석을 통하여 확인할 수 있었다.
이상의 가이드라인을 바탕으로 HPLC를 이용하여 국내 및 중국에서 유통되고 있는 정공등 20종에 대한 함량평가를 실시한 결과 전체 시료에서 scopolin 0.25±0.062%, scopoletin 0.2± 0.068%, neochlorogenic acid 0.102±0.062%, 3,4-di-O-caffeoyl-quinic acid 0.073±0.042%를 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과와 문헌을 비교하여,13,14) 이 compound를(1R,3S,4R,5S)-4-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,5- trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 즉, crypto-chlorogenic acid(C16H18O9)로 확인 동정하였다.
이상의 결과와 문헌을 비교하여,16) 이 compound를(1R,3S,4R,5S)- 5-((E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyloxy)-1,3,4-trihydroxycyclohexanecarboxylic acid 즉, neochlorogenic acid(C16H18O9)로 확인 동정하였다.
이상의 결과와 문헌을 비교하여,3,15) 이 compound를(β-D-glucopyranosoyloxy)-6-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one 즉, scopolin으로 확인 동정하였다.
직선성(Linearity) − Compound 2, 3, 4와 scopoletin의 표준액을 1~200 µg/ml의 범위에서 4가지 성분 모두 검량선 상관계수가 0.999 이상으로 양호한 직선성을 나타내었다(Fig. 3, Table III).
특이성(Specificity) − Compound 2, 3, 4와 scopoletin을 이들 성분의 머무름 시간은 각각 compound 2가 약 15.5 min, compound 3이 약 14.2 min, compound 4가 약 24 min, scopoletin이 약 30.6 min에 명확하게 분리되어 나타나는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2).
후속연구
또한 HPLC를 이용한 함량평가 결과를 이용한 다변량분석(PCA)을 통하여 종간 또는 지역별 유사성 실험을 실시하였으며 그 결과 지역별로 시판되고 있는 정공등 유통품은 함유된 성분이 패턴은 비슷하지만 각 성분함량에서 큰 차이를 보이고 있어 산지를 확인하는데 중요한 자료가 될 것으로 사료된다.
이상의 결과를 종합하여 중국 뿐만 아니라 우리나라에 수입 유통되는 정공등에 대하여 주성분인 scopolin, scopoletin, neochlorogenic acid 및 3,4-di-O-caffeoylquinic acid등 4종을 이용 다성분 함량 품질 평가 방법을 개발하였으며 또한 PCA군집 분석을 통하여 유통품의 주산지를 확인 할 수 있어서 앞으로 정공등을 이용한 의약품 및 기능성 식품개발에 기초자료로서 제공될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
정공등은 어떠한 효능이 있는가?
정공등 Erycibe obtusifolia Bentham은 메꽃과(Convolvulaceae)의 덩굴성 식물로서 줄기는 거풍제습(風除濕), 소중지통(消止痛) 등 효능이 있고 류머티스, 반신불수(半身不遂), 부종 등의 치료제로 사용한다.4) 또한 염증, 면역조절, 축동(縮瞳), 심혈관, 중수신경계 등2)의 질환에 민간약으로도 중국에서 널리 이용되어 왔다.
정공등이란 무엇인가?
정공등 Erycibe obtusifolia Bentham은 메꽃과(Convolvulaceae)의 덩굴성 식물로서 줄기는 거풍제습(風除濕), 소중지통(消止痛) 등 효능이 있고 류머티스, 반신불수(半身不遂), 부종 등의 치료제로 사용한다.4) 또한 염증, 면역조절, 축동(縮瞳), 심혈관, 중수신경계 등2)의 질환에 민간약으로도 중국에서 널리 이용되어 왔다.
정공등은 중국에서 어떻게 활용되는가?
정공등 Erycibe obtusifolia Bentham은 메꽃과(Convolvulaceae)의 덩굴성 식물로서 줄기는 거풍제습(風除濕), 소중지통(消止痛) 등 효능이 있고 류머티스, 반신불수(半身不遂), 부종 등의 치료제로 사용한다.4) 또한 염증, 면역조절, 축동(縮瞳), 심혈관, 중수신경계 등2)의 질환에 민간약으로도 중국에서 널리 이용되어 왔다.5-11) 전세계에 약 66종이 분포하며 주로 아시아 지역에 자생하며 일부는 호주에 있다.
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