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문제 정의
- 본 연구에서는 전통적인 방법으로 제조한 청국장과 볏짚으로부터 배양방법을 사용하여 발효미생물을 분리 및 동정하고 동시에 비배양방법인 DGGE 방법을 이용한 청국장의 발효미생물 군집의 분포를 조사하여 배양방법에 의한 미생물 군집조사의 한계점을 보완하고 청국장 발효미생물 군집에 대한 기초자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- PCR 반응시 Takara Perfect Premix (0.4 mM dNTP, 0.5 units Taq polymerase, 4 mM Mg2+이 함유된 PCR buffer) 10 µL에 DNA template (20 µg/mL) 1 µL, forward와 reverse primer (1.0 µM)를 각각 1 µL씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20 µL가 되도록 제조하였다.
- PCR 증폭은 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension)을 30 cycles 실시하였고, 72℃에서 5분간 최종 extension을 실시하였다. PCR 산물의 존재와 분자량을 확인하기 위해서 1×TAE buffer (40 mM Tris·HCl, 40 mM acetate, 1.
- PCR 산물의 존재와 분자량을 확인하기 위해서 1×TAE buffer (40 mM Tris·HCl, 40 mM acetate, 1.0 mM EDTA)에 2% agarose을 넣고 녹인 후에 ethidium bromide을 첨가하여 gel을 만든 다음, loading하여 100 V에서 60분간 전기영동하였다.
- 0 µM)를 각각 1 µL씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20 µL가 되도록 제조하였다. PCR 증폭은 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension)을 30 cycles 실시하였고, 72℃에서 5분간 최종 extension을 실시하였다.
- PCR을 이용하여 증폭된 DNA는 Bio-Rad DCode™ Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 8% (w/v) polyacrylamide gel (urea와 formamide의 첨가량을 달리한 30-70%의 gradient gel)을 만든 다음, loading하여 60 V, 60℃에서 16시간 전기영동 하였다.
- 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후 tryptic soy agar (TSA; Difco, Detroit, MI, USA) plate에 100 µL씩 도말하여 37℃에서18시간동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다. TSA plate당 100개 colony 정도가 얻어진 plate의 미생물은 모두 순수분리한 후, 16S rRNA 동정을 수행하였다.
- circulans, Acinetobacter sp. 등의 미생물을 확인 하였다. 그리고 배양방법으로는 분리되지 않는 uncultured bacterium 과 uncultured Bacillus sp.
- 미생물 분리에 사용한 현탁액을 원심분리(13,000×g, 10 min)하여 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy tissue kit (Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 배양방법에 의해 분리되지 않는 미생물의 확인을 위해 청국장과 볏짚시료로부터 미생물을 배양하지 않고 직접 genomic DNA 를 추출하고 선발한 341FGC와 518R universal PCR primer를 사용 하여 PCR-DGGE를 수행하였다. 청국장과 볏짚에서 추출한 bacterial 16S rRNA 는 DGGE 변성 구배 젤의 30-70% 농도에서 band 패턴이 가장 잘 분리되었다(Fig.
- 볏짚과 청국장 시료를 각각 취하여 멸균 생리식염수에 1 : 9 비율로 혼합한 후, homogenizer (Stomacher 400, Seward, England) 를 사용하여 10분 동안 균질화한 후, 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후 tryptic soy agar (TSA; Difco, Detroit, MI, USA) plate에 100 µL씩 도말하여 37℃에서18시간동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다.
- 분리 미생물의 genomic DNA를 분리한 다음, 16S rRNA sequencing에 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 94℃에서 1분(denaturation), 51℃에서 1분(annealing), 72℃에서 1분 30초(polymerization)간 반응시키는 조건에서 PCR 증폭을 수행하였다.
- 미륵산농원(강원도 귀래면)의 볏짚시료에서 54개의 single colony 를 분리하였고 청국장에서는 53개의 single colony를 분리하였다. 분리미생물은 16S rRNA sequencing 분석을 통해 동정하였으며, 그 결과는 Table 1A에 나타내었다. 볏짚에서 분리한 미생물의 동 정결과, Pantoea agglomerans (65%)가 우점종을 나타내었고, P.
- 흥업토속 청국장(강원도 흥업면)의 볏짚시료에서 68개의 single colony를 분리하였고 청국장에서는 76개의 single colony를 분리 하였다. 분리미생물은 16S rRNA sequencing 분석을 통해 동정하였으며, 그 결과는 Table 1B에 나타내었다. 볏짚에서 분리한 미생물의 동정결과, B.
- 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후 tryptic soy agar (TSA; Difco, Detroit, MI, USA) plate에 100 µL씩 도말하여 37℃에서18시간동안 배양한 후에 미생물 집락의 형태에 따라 서로 다른 미생물을 분리하였다.
- PCR을 이용하여 증폭된 DNA는 Bio-Rad DCode™ Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 8% (w/v) polyacrylamide gel (urea와 formamide의 첨가량을 달리한 30-70%의 gradient gel)을 만든 다음, loading하여 60 V, 60℃에서 16시간 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 GreenStarTM Nucleic Acid Staining (1:10,000 dilution) (Bioneer, Seoul, Korea)으로 염색하고 UV-transilluminator (Korea BioTech Co.)를 이용하여 DNA band를 확인하였다. DGGE band의 intensity는 Gel-Pro analyzer 프로그램(Media Cybernetics Inc.
- 0 mM EDTA)에 2% agarose을 넣고 녹인 후에 ethidium bromide을 첨가하여 gel을 만든 다음, loading하여 100 V에서 60분간 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 UV-transilluminator (Korea Bio-Tech Co., Seongnam, Korea)를 이용하여 DNA band를 확인하였다.
- 전통적인 방법으로 제조한 청국장과 볏짚시료로부터 배양방법과 비배양방법인 DGGE를 이용한 청국장의 발효미생물 군집을 분석하였다. 배양방법에서는 미륵산농원의 볏짚과 청국장 시료에서 P.
- 청국장 발효의 starter로 사용하는 볏짚과 청국장 발효미생물 군집분석을 위해 시료를 멸균 생리식염수로 각각 희석하여 TSA 배지에 도말한 후, 배양하여 형성된 colony의 개수가 100 CFU/plate 전후되는 plate를 선발하여 모든 colony를 순수분리하였다.
- 분리 미생물의 genomic DNA를 분리한 다음, 16S rRNA sequencing에 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를 사용하여 94℃에서 1분(denaturation), 51℃에서 1분(annealing), 72℃에서 1분 30초(polymerization)간 반응시키는 조건에서 PCR 증폭을 수행하였다. 한편, DGGE 전기영동 후 polyacrylamide gel에서 DNA band의 분리를 확인한 후, 메스를 이용하여 DNA band를 잘라내어 QIAEXⅡ gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 DNA를 elution한 후, 341F와 518R primer를 사용하여 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(polymerization) 간 반응시키는 조건에서 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭된 산물은 T vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환 시켰다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 청국장과 볏짚 시료들은 한국 전통식 방법으로 제조하고 있는 미륵산농원(Wonju, Korea)과 흥업토속 청국장(Wonju, Korea)에서 각각 구입하여 실험에 사용하였다.
- 추출된 DNA의 16S rRNA gene 증폭을 위하여 GC clamp (5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')가 부착된 341F (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG3')와 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3') primer를 이용하였다(16).
데이터처리
- )를 이용하여 DNA band를 확인하였다. DGGE band의 intensity는 Gel-Pro analyzer 프로그램(Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD, USA)을 사용하여 분석하였다.
- 증폭된 산물은 T vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합시킨 후 형질전환 시켰다. T vector sequencing primer를 이용하여 염기서열 결정을 수행하였으며 그 결과는 BLAST search (http://www.ncbi.nlm.nih. gov) program을 이용하여 GENBANK (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 16S rRNA sequencing과 비교하여 동정하였다.
성능/효과
- subtilis, Bacillus sp., B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. circulans로 동정하였다(Table 2A). 흥업토속된장에서 수집한 볏짚시료에서는 8개의 band로 분리하였고 미생물 동정결과, Pseudomonas fulva, P.
- , Bacillus sp., uncultured bacterium, B. subtilis, B. circulans, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens로 동정하였다(Table 2B).
- DGGE band의 intensity가 높다는 것은 개체군의 수가 많다는 것을 의미하는데(17), 본 연구결과에서는 DGGE band의 intensity가 높은 B. subtilis (Band intensity 25.7%)와 B. amyloliquefaciens (Band intensity 27.3%) 미생물이 청국장 발효 우점미생물로 확인 하였다. 수집한 볏짚과 청국장 시료로부터 직접 추출한 bacterial 16S rRNA 의 band는 DGGE gel 상에서 위치와 동정결과가 유사한 것을 확인할 수 있었다.
- amyloliquefaciens (57%와 52%)가 우점미생물로 확인하였다. DGGE 분석에서는 미륵산농원의 볏짚과 청국장 시료에서 P. agglomerans (Band intensity 20.6%)와 B. subtilis (Band intensity 25.7%)가 우점미생물로 나타내었고 흥업토속 청국장의 볏짚과 청국장 시료에서는 B. amyloliquefaciens (Band intensity 27.3%, 26.4%)가 우점미생물로 확인하였다. 그 외에도 볏짚에서는 Pantoea sp.
- circulans, Acinetobacter sp. 등의 미생물을 확인이 되었으며, 비배양 방법을 이용한 청국장 발효미생물 균총 조사는 배양이 불가능한 미생물을 확인할 수 있었다.
- 볏짚을 끓는 물에 30분동안 처리한 후, 백금이를 이용하여 TSA에 도말하여 배양한 결과, 포자를 생성하는 Bacillus species의 colony만이 확인이 되었는데, 이는 열처리 과정을 통해 Pantoea species는 사멸되는 것으로 사료되었다(data not shown). 따라서 볏짚을 청국장 발효 starter로 사용할 경우, 볏짚을 끓는 물에 넣어서 열처리한 후, 사용하는 것이 위생적인 청국장을 제조할 수 있을 것으로 사료되었다. Kim 등(10)은 청국장 발효에 관여하는 주요 미생물이 B.
- 이외에 다른 속에 해당하는 미생물이 다양하게 분포한 반면에 청국장 시료에서는 대부분이 Bacillus sp. 미생물이 우점하는 것으로 확인되었다. 이는 전통방식의 청국장 제조는 주로 볏짚을 사용하는데, 끓는 물에서 열처리한 후, 사용하기 때문에 대부분 포자형성 미생물인 Bacillus sp.
- 전통적인 방법으로 제조한 청국장과 볏짚시료로부터 배양방법과 비배양방법인 DGGE를 이용한 청국장의 발효미생물 군집을 분석하였다. 배양방법에서는 미륵산농원의 볏짚과 청국장 시료에서 P. agglomerans (65%)와 B. subtilis (60%)가 우점미생물로 나타내었고, 흥업토속 청국장의 볏짚과 청국장 시료에서는 B. amyloliquefaciens (57%와 52%)가 우점미생물로 확인하였다. DGGE 분석에서는 미륵산농원의 볏짚과 청국장 시료에서 P.
- 그러나, DGGE 방법은 이러한 배양방법의 단점을 보완함으로써 다양한 미생물의 존재를 확인할수 있었다. 볏짚과 청국장 시료에 존재하는 미생물의 16S rRNA gene 을 추출하여 universal primer를 이용해 PCR 증폭 후 DGGE를 수행함으로써 조금 더 빠르고 신속하게 미생물을 동정할 수 있었고 소수로 존재하는 미생물들도 확인할 수 있었다.
- 분리미생물은 16S rRNA sequencing 분석을 통해 동정하였으며, 그 결과는 Table 1A에 나타내었다. 볏짚에서 분리한 미생물의 동 정결과, Pantoea agglomerans (65%)가 우점종을 나타내었고, P. ananatis (30%), Bacillus subtilis (5%)를 분리하였다. 청국장에서 분리한 미생물의 동정결과, B.
- agglomerans는 그람음성 호기성간균이며, Enterobacteriaceae 과에 속하는 미생물로 보고되어 있다. 볏짚을 끓는 물에 30분동안 처리한 후, 백금이를 이용하여 TSA에 도말하여 배양한 결과, 포자를 생성하는 Bacillus species의 colony만이 확인이 되었는데, 이는 열처리 과정을 통해 Pantoea species는 사멸되는 것으로 사료되었다(data not shown). 따라서 볏짚을 청국장 발효 starter로 사용할 경우, 볏짚을 끓는 물에 넣어서 열처리한 후, 사용하는 것이 위생적인 청국장을 제조할 수 있을 것으로 사료되었다.
- 3%) 미생물이 청국장 발효 우점미생물로 확인 하였다. 수집한 볏짚과 청국장 시료로부터 직접 추출한 bacterial 16S rRNA 의 band는 DGGE gel 상에서 위치와 동정결과가 유사한 것을 확인할 수 있었다. 이는 볏짚에서 유래한 미생물이 청국장의 발효에 관여한 것으로 사료된다.
- ananatis (14%)를 분리하였다. 청국장에서 분리한 미생물의 동정결과, B. amyloliquefaciens (52%) 가 우점종을 나타내었고 B. circulans (26%), B. licheniformis (18%), Acinetobacter sp. (4%)를 분리하였다.
- ananatis (30%), Bacillus subtilis (5%)를 분리하였다. 청국장에서 분리한 미생물의 동정결과, B. subtilis (60%) 가 우점종을 나타내 었고 B. circulans (28%), B. amyloliquefaciens (12%)를 분리하였다. 흥업토속 청국장(강원도 흥업면)의 볏짚시료에서 68개의 single colony를 분리하였고 청국장에서는 76개의 single colony를 분리 하였다.
후속연구
- 배양방법에 의한 볏짚과 청국장 시료의 발효미생물 군집을 살펴보면, 전반적으로 시료에서 우점종을 차지 하는 미생물이 대부분 분리되었으며 미생물 동정결과, 3-4종으로 구성되어 있었다. 강원도 귀래면의 미륵산 농원과 강원도 흥업면의 흥업토속 청국장으로부터 수집한 볏짚과 청국장에서 분리된 미생물의 분포를 살펴보면 볏짚에서는 P. agglomerans와 B. amyloliquefaciens 미생물이 높은 우점도를 나타내었고, 청국장 시료에서는 B. subtilis 와 B. amyloliquefaciens 미생물이 높은 우점도를 나타내며 분리 및 동정되어 다양한 미생물은 분리되지 않는 배양방법의 한계를 보여주었다. 그러나, DGGE 방법은 이러한 배양방법의 단점을 보완함으로써 다양한 미생물의 존재를 확인할수 있었다.
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