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문제 정의
- 그러나, 구기자와 맥문동의 생리 기능성이 우수하다는 보고에도 불구하고 이들을 이용한 건강 주류 개발 그리고 이들에 대한 저장성 연구는 현재까지 이루어져 있지 않고 있다. 따라서 기호성과 생리기능성이 우수한 고품질의 구기자-맥문동 막걸리를 개발하고자 전보[13]에서 전통 구기자-맥문동 전통주(약주) 제조에 적합한 알코올 발효 효모로서 Saccharomyces cerevisiae C-2를 선발하였고, 이들의 최적 발효 조건과 선발된 효모를 이용한 저장 중 품질 특성과 생리기능성의 변화를 보고하였다. 본 연구는 S.
- 따라서 기호성과 생리기능성이 우수한 고품질의 구기자-맥문동 막걸리를 개발하고자 전보[13]에서 전통 구기자-맥문동 전통주(약주) 제조에 적합한 알코올 발효 효모로서 Saccharomyces cerevisiae C-2를 선발하였고, 이들의 최적 발효 조건과 선발된 효모를 이용한 저장 중 품질 특성과 생리기능성의 변화를 보고하였다. 본 연구는 S. cerevisiae C-2 를 사용하여 제조한 전통 구기자-맥문동 막걸리의 최적 저장기간을 확립하기 위해 수행하였다. 이를 위해 발효기간과 발효를 마친 후 저장 기간 동안 효모와 세균 특히 젖산균의 변화를 평판배지를 이용한 생균수 측정과 동시에 DGGE를 사용하여 전기영동에 의해 분리된 rRNA 유전자 DNA밴드들의 염기서열을 결정하여 시료에 존재하는 미생물을 동정하였다.
제안 방법
- 발효 과정 중 그리고 4°C와 20°C에서 저장하는 동안 막걸리의 생균수 측정에 사용한 것과 동일한 시료로부터 DNA를 추출한 후 rRNA 유전자를 증폭시키기 위해 PCR반응을 수행하였다. 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 산물들을 40-80%의 변성제가 들어 있는 폴리아크릴아마이드젤을 이용하여 분석하였다. 그 결과 4°C(Fig.
- 전기영동이 완료된 젤을 RedSafe(Intron, Daejeon, Korea)로 30분 동안 염색을 시킨 후 젤을 분석하였다. DNA 밴드는 ImageMaster VDS(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 촬영하였다.
- 막걸리 1 mL를 원심분리한 후 침전물을 bead beater를 이용하여 세포벽을 파괴하였다. DNA를 추출하기 위해 genomic DNA prep kit (Solgent, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 추출한 DNA는 16S rRNA 유전자와 18S rRNA 유전자를 증폭하기 위해 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) 분석을 하기 위해 8% 폴리아크릴아마이드 젤에 7 M urea와 40%(v/v) formamide를 100%로 하여 박테리아 분석은 40-80%의 변성제가 들어있는 젤을 그리고 효모와 진균류 분석은 30-70%의 변성제가 들어있는 젤을 사용하였다. 변성제의 농도가 구배를 갖도록 제조된 젤을 1X TAE(20 mM Tris, 10mM acetate, 0.
- 이를 GC 클램프가 없는 동일한 프라이머 세트(즉, 세균은 338F와 518R 그리고 효모는 NS3와 YM951R)를 사용하여 PCR 반응으로 DNA를 증폭시켰다. PCR 반응에 의해 증폭된 산물을 2% 아가로스 젤 전기영동을 한 후 이를 QIAEX II agarose gel extraction kit(Qiagen Valencia, CA, USA)를 사용하여 회수한 후 DNA 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열은 BLAST를 이용하여 GenBank의 데이터베이스와 비교하여 가장 유사한 미생물을 확인할 수 있었다.
- 구기자-맥문동 막걸리 발효 과정 동안 그리고 발효 종료 후 30일 동안 저장하면서 미생물 변화를 DGGE로 분석하여 동정하였다. 발효 과정 중 그리고 4°C와 20°C에서 저장하는 동안 막걸리의 생균수 측정에 사용한 것과 동일한 시료로부터 DNA를 추출한 후 rRNA 유전자를 증폭시키기 위해 PCR반응을 수행하였다.
- 구기자-맥문동 막걸리중의 젖산균 변화는 cycloheximide (50 μg/gL)를 첨가하여 조제한 MRS 평판배지에서 연속희석법을 사용하여 조사하였다.
- 먼저 효모는 각 시료를 일정 농도로 멸균수에 희석시킨 후 100 μL를 ampicillin(100 μg/μL)이 함유되어 있는 YPD배지에 도말하여 30°C에 36시간 배양 후 집락수를 측정하였다.
- 먼저, 멥쌀 40 g과 밀가루 5 g을 50 mL에 넣고 곡자를 g당 30 sp첨가한 다음 30°C에서 2일간 발효시켜 주모를 제조하였다.
- 발효 과정 중 그리고 4°C와 20°C에서 저장하는 동안 막걸리의 생균수 측정에 사용한 것과 동일한 시료로부터 DNA를 추출한 후 rRNA 유전자를 증폭시키기 위해 PCR반응을 수행하였다.
- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis(DGGE) 분석을 하기 위해 8% 폴리아크릴아마이드 젤에 7 M urea와 40%(v/v) formamide를 100%로 하여 박테리아 분석은 40-80%의 변성제가 들어있는 젤을 그리고 효모와 진균류 분석은 30-70%의 변성제가 들어있는 젤을 사용하였다. 변성제의 농도가 구배를 갖도록 제조된 젤을 1X TAE(20 mM Tris, 10mM acetate, 0.5 mM EDTA [pH 8.0]) running buffer가 첨가된 C.B.S DGGE-2004 system(CBS Scientific, San Diego, CA, USA)을 이용하여 80V에 15시간 동안 전기영동을 하였다. 전기영동이 완료된 젤을 RedSafe(Intron, Daejeon, Korea)로 30분 동안 염색을 시킨 후 젤을 분석하였다.
- 위와 같이 제조한 구기자-맥문동 막걸리를 4°C와 20°C에서 각각 보관하면서 일정한 간격으로 저장 중 효모 생균수의 변화를 조사하였다.
- acidilactici들 이외에는 다른 세균들이 확인되지 않았으므로 구기자-맥문동 막걸리의 균총은 젖산균으로만 구성되어 있다고 결론 내릴 수 있다. 유사한 방법으로 발효 기간 중 그리고 저장 기간 중의 막걸리로부터 일정 간격으로 시료를 취해 DNA를 추출한 후 18S rRNA 유전자 증폭을 위해 PCR반응을 수행하였다. PCR 증폭 산물들을 30-70%의 변성제가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 효모의 DNA 밴드들을 분석한 결과, 주 알코올 발효균인 S.
- 이 발효액을 거즈로 여과하여 얻은 상등액을 생 막걸리로 하여 4°C와 20°C에서 각각 저장하면서 효모와 총 세균 그리고 젖산균 수를 측정하였다.
- 0)에 넣어 DNA가 확산되어 나오도록 하였다. 이를 GC 클램프가 없는 동일한 프라이머 세트(즉, 세균은 338F와 518R 그리고 효모는 NS3와 YM951R)를 사용하여 PCR 반응으로 DNA를 증폭시켰다. PCR 반응에 의해 증폭된 산물을 2% 아가로스 젤 전기영동을 한 후 이를 QIAEX II agarose gel extraction kit(Qiagen Valencia, CA, USA)를 사용하여 회수한 후 DNA 염기서열을 결정하였다.
- cerevisiae C-2 를 사용하여 제조한 전통 구기자-맥문동 막걸리의 최적 저장기간을 확립하기 위해 수행하였다. 이를 위해 발효기간과 발효를 마친 후 저장 기간 동안 효모와 세균 특히 젖산균의 변화를 평판배지를 이용한 생균수 측정과 동시에 DGGE를 사용하여 전기영동에 의해 분리된 rRNA 유전자 DNA밴드들의 염기서열을 결정하여 시료에 존재하는 미생물을 동정하였다. 이를 통해 발효 및 저장 과정 동안 막걸리 안에서 일어난 미생물 균총 변화를 조사하였다.
- 이를 위해 발효기간과 발효를 마친 후 저장 기간 동안 효모와 세균 특히 젖산균의 변화를 평판배지를 이용한 생균수 측정과 동시에 DGGE를 사용하여 전기영동에 의해 분리된 rRNA 유전자 DNA밴드들의 염기서열을 결정하여 시료에 존재하는 미생물을 동정하였다. 이를 통해 발효 및 저장 과정 동안 막걸리 안에서 일어난 미생물 균총 변화를 조사하였다.
- S DGGE-2004 system(CBS Scientific, San Diego, CA, USA)을 이용하여 80V에 15시간 동안 전기영동을 하였다. 전기영동이 완료된 젤을 RedSafe(Intron, Daejeon, Korea)로 30분 동안 염색을 시킨 후 젤을 분석하였다. DNA 밴드는 ImageMaster VDS(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 촬영하였다.
- 주모 제조 및 담금은 전보[1, 13]의 구기자 전통주 담금법을 일부 변형시켜 다음과 같이 실시하였다.
- 총 세균 수와 젖산균 수는 각각의 희석시료 100 μL를 cycloheximide(50 μg/μL)가 함유되어 있는 PCA배지와 MRS 배지에 각각 도말 하여 30°C에서 48시간 배양하여 이들의생균수를 측정하였다.
대상 데이터
- 16S RNA유전자 증폭은 GC338F(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG)와 518R(5’-ATTACCGCGGGCTGCTGG) 프라이머 세트를[8], 그리고 18S rRNA 유전자 증폭은 GCNS3(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACTCTGGTGCCAGCAGCC)와 YM951R(5’-TTGGCAAATGCTTCGC) 프라이머 세트를[3] 사용하였다.
- 구기자(장명)와 맥문동(맥문동 1호)은 2010년 9월 청양 구기자 시험장에서 재배한 것을 분양 받아 사용하였고 멥쌀은 2010년 이천에서 재배된 것을 시중에서 구입하여 사용하였다. 누룩은 SJ곡자 제품을 사용하였고, 효모는 전보[13]에서 우수 효모로 선발한 S.
- 구기자(장명)와 맥문동(맥문동 1호)은 2010년 9월 청양 구기자 시험장에서 재배한 것을 분양 받아 사용하였고 멥쌀은 2010년 이천에서 재배된 것을 시중에서 구입하여 사용하였다. 누룩은 SJ곡자 제품을 사용하였고, 효모는 전보[13]에서 우수 효모로 선발한 S. cerevisiae C-2를 사용 하였다.
성능/효과
- 20°C에서 수행한 저장 실험에서는 15일간 저장한 후 2.2×107 cfu/mL로 초기 효모균수의 87%가 감소 하였으며 30일간 저장한 후에는 8.0×106 cfu/mL로서 초기 효모균수의 약 95.2%가 감소되었다(Fig. 1).
- 발효를 마친 시점에서 효모의 성장을 억제하기 위해 50 μg/μL의 농도로 cycloheximide 를 첨가하여 제조한 PCA평판배지에서 연속희석법으로 측정된 총 세균 수는 9.7×108 cfu/mL이었다(Fig. 2).
- 본 실험 목적 중 하나인 발효주의 저장 기간은 YPD 배지를 이용하여 효모의 생균수를 측정한 결과를 기준으로 하여 4°C에서는 15일까지 그리고 20°C에서는 저장하지 않는 것이 바람직하다고 판단되었다.
- acidilactici는 젖산 생산 및 pedi°Cin이라고 알려진 박테리오신을 만들어서 유해균의 생장을 억제하는 효과를 갖고 있다는 보고가 있다[2]. 시간에 따른 총 세균수 및 젖산균의 변화 양상(Fig. 2, 3) 그리고 DGGE로 분석한 세균 종의 동정 결과(Fig. 4)를 비교해 보면, 막걸리 발효 기간 및 저장 기간 중 이상발효젖산균인 W. cibaria와 L. fermentum 그리고 내산성균이면서 정상발효젖산균인 P. acidilactici들 이외에는 다른 세균들이 확인되지 않았으므로 구기자-맥문동 막걸리의 균총은 젖산균으로만 구성되어 있다고 결론 내릴 수 있다. 유사한 방법으로 발효 기간 중 그리고 저장 기간 중의 막걸리로부터 일정 간격으로 시료를 취해 DNA를 추출한 후 18S rRNA 유전자 증폭을 위해 PCR반응을 수행하였다.
- DGGE에서 나타난 세균의 DNA밴드들을 분석한 결과는 Table 1에 정리되어 있다. 시중에 유통되고 있는 상업용 막걸리의 PCR-DGGE분석 결과와 비교하여 보았을 때(data not shown), 구기자-맥문동 막걸리 발효 과정 중 존재하는 세균 균총으로부터 유래된 16S rDNA 밴드들의 양상은 시판용 막걸리들에 비해 비교적 단순하게 나타났다. 구기자-맥문동 막걸리 시료에서는 Weissella cibaria, Lactobacillus fermentum 그리고 Pedi°C°Ccus acidilactici가 주요 박테리아로 동정되었는데, 이들은 모두 숙주세포에 유용한 역할을 하는 프로바이오틱으로 알려져 있다[2, 6, 10].
- PCR 반응에 의해 증폭된 산물을 2% 아가로스 젤 전기영동을 한 후 이를 QIAEX II agarose gel extraction kit(Qiagen Valencia, CA, USA)를 사용하여 회수한 후 DNA 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열은 BLAST를 이용하여 GenBank의 데이터베이스와 비교하여 가장 유사한 미생물을 확인할 수 있었다.
- acidilactici로 대체된다는 점이다. 즉 W. cibaria의 DNA 밴드가 발효 초기에 가장 진하게 나타나다가 발효 종료 시점에서 급격히 감소하였고(Fig. 4, 밴드 a), 발효 개시일(-7 days)에 명확히 보이지 않던 L.
- 특히 20°C(Fig. 4B)에서 30일 동안 저장하면 P. acidilactici에 해당하는 DNA 밴드가 L. fermentum 에 비해 상대적으로 더 진해지는 것으로 보아 P. acidilactici가 최종적인 우점균이 된다고 판단된다.
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