선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이러한 흐름에 맞추어 본 연구에서는 여러 가지의 천연물질을 스크리닝하였고, 그 중 상기생 추출물이 파골세포의 분화와 골흡수능을 억제하는 효과가 있음을 검증하고 어떠한 기전을 가지는지 규명하고자 실험을 진행하였다. 더 나아가, 향후 골다공증을 비롯한 골질환의 치료제로써의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 상기생 추출물이 파골세포 분화 및 골흡수에 미치는 영향과 작용기전을 밝힘으로써 골다공증 치료제로써의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 상기생 추출물은 JNK의 인산화와 파골세포와 관련된 주요 전사인자 발현을 저해함으로써 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제하였다. 따라서 상기생 추출물은 골다공증과 같은 파골세포와 관련된 골질환의 예방에 도움이 되는 물질이 될 수 있으며, 골질환 치료 후보물질로서의 가능성을 제시하였다.
- 그러나 기존에 사용하였던 골다공증의 치료제인 bisphosphonate 약물의 한계점이 드러나기 시작하면서 이를 대체할 만한 효과를 가진 천연물질에 대한 연구가 이루어지기 시작하였다. 이러한 흐름에 맞추어 본 연구에서는 여러 가지의 천연물질을 스크리닝하였고, 그 중 상기생 추출물이 파골세포의 분화와 골흡수능을 억제하는 효과가 있음을 검증하고 어떠한 기전을 가지는지 규명하고자 실험을 진행하였다. 더 나아가, 향후 골다공증을 비롯한 골질환의 치료제로써의 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 동시에 상기생 추출물을 주어진 농도로 처리하여 12시간 배양하였다. 12시간 배양 후, 세포는 증류수로 수세하고 광학 현미경을 통해 관찰하였다. Hydroxyapatite가 흡수된 pit area는 Image Pro-Plus program version, 4.
- 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 처리하여 배양하면서 상기생 추출물을 100, 250, 500 ng/ml의 농도별로 처리하였다. 3일 후, 같은 조건으로 media change를 하였고 다음 날, 배양한 세포를 TRAP 용액으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 세어서 분화 정도를 확인하였다.
- 파골세포의 전구세포가 되는 미부착 세포를 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin과 M-CSF (30 ng/ml)이 포함된 α-MEM 배지에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 부착된 대식세포를 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 처리하여 배양하면서 상기생 추출물을 100, 250, 500 ng/ml의 농도별로 처리하였다.
- 그리고 1차 항체 및 2차 항체를 처리했다. TBS-T 완충용액으로 PVDF막을 세척하고 enhanced chemiluminescence를 이용해 빛을 차단하여 단백질 발현을 관찰하였다.
- 골수세포를 분리하기 위하여 생후 5주령 ICR mouse를 경추탈골법으로 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하였다. 장골의 양끝을 절단한 후 양쪽 끝의 골수강에 1 ml의 주사기를 이용하여 뼈의 속질을 수세함으로써 골수 세포를 얻었다.
- 3일 후, 부착된 대식세포를 사용하여 실험하였다. 대식세포는 M-CSF (30 ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 처리하여 배양하면서 상기생 추출물을 100, 250, 500 ng/ml의 농도별로 처리하였다. 3일 후, 같은 조건으로 media change를 하였고 다음 날, 배양한 세포를 TRAP 용액으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포를 세어서 분화 정도를 확인하였다.
- 파골세포 분화를 억제하는 상기생 추출물의 작용기전을 규명하기 위하여 p38, JNK 등의 MAPK, Akt, 전사인자인 NF-kB 활성에 미치는 상기생 추출물의 효과를 검증하였다. 대식세포를 상기생 추출물로 전처리 후 RANKL에 의한 p38, JNK, Akt, IkB의 활성을 주어진 시간별로 확인하였다. RANKL로 자극한 대조군과 비교했을 때, 상기생 추출물을 같이 처리한 군에서는 RANKL에 의한 p38, Akt, IkB의 인산화 및 IkB의 분해의 차이를 관찰할 수 없었지만, JNK 인산화는 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 1B). 또한 상기생 추출물의 효과가 세포 독성과 연관되어 있는지를 확인하기 위하여 XTT 실험을 실행하였고, 다핵성 파골세포로의 분화를 억제하는 농도의 상기생 추출물에서는 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1C). 이를 통해, 상기생 추출물은 세포 독성이 없이 파골세포의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
- 분리된 골수세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 α-MEM 배지에서 1일간 배양한 후 미부착세포를 모았다.
- 상기생 추출물이 파골세포 골흡수능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 조골세포와 파골세포를 동조배양하여 성숙한 파골세포와 상기생 추출물을 hydroxyapatite로 코팅된 plate에 주입하였다. 그 결과, DMSO로 처리한 대조군에서는 hydroxyapatite가 파골세포에 의해 흡수된 부분을 많이 관찰할 수 있었지만, 상기생 추출물을 처리한 실험군에서는 흡수된 부분이 확연히 감소현상을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 성숙한 파골세포를 얻기 위하여 collagen으로 코팅한 90mm 배양접시에 골수세포와 조골세포를 첨가하고 1,25-dihydroxyvitamin D3 (VitD3)와 prostaglandin E2 (PGE2)를 처리하여 6일간 공생배양 하였다. 배양한 후, 세포는 0.
- 세포 내 총 RNA는 QIAzol lysis reagent (QIAGEN, Valencia, CA, USA)로 설명서에 따라 추출하였다. 동등한 양의 RNA는 TOPscript cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
- 골수세포를 분리하기 위하여 생후 5주령 ICR mouse를 경추탈골법으로 희생시킨 후, 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하였다. 장골의 양끝을 절단한 후 양쪽 끝의 골수강에 1 ml의 주사기를 이용하여 뼈의 속질을 수세함으로써 골수 세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 α-MEM 배지에서 1일간 배양한 후 미부착세포를 모았다.
- 파골세포 분화를 억제하는 상기생 추출물의 작용기전을 규명하기 위하여 p38, JNK 등의 MAPK, Akt, 전사인자인 NF-kB 활성에 미치는 상기생 추출물의 효과를 검증하였다. 대식세포를 상기생 추출물로 전처리 후 RANKL에 의한 p38, JNK, Akt, IkB의 활성을 주어진 시간별로 확인하였다.
- 파골세포의 분화에 상기생 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 대식세포에 파골세포 분화에 필수적인 M-CSF와 RANKL를 처리하고 상기생 추출물을 농도 별로 처리한 후 4일 동안 배양하였다. DMSO를 처리한 대조군에서는 TRAP 양성 다핵형 파골세포가 많이 생성되었으나, 상기생 추출물을 같이 처리한 실험군에서는 농도의 증가에 따른 TRAP 양성 파골세포의 형성이 억제되었고(Fig.
- 파골세포의 전구세포가 되는 미부착 세포를 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin과 M-CSF (30 ng/ml)이 포함된 α-MEM 배지에서 3일간 배양하였다.
- PCR 조건은 94℃에서 30초 동안 denaturation, 58℃에서 30초 동안 annealing, 그리고 72℃에서 30초 동안 extension 반응을 25 ~ 30 cycles로 하여 증폭시켰다. 합성된 cDNA는 1% agarose gel에서 분리하였고, EtBr로 염색하여 자외선에서 관찰하였다.
대상 데이터
- 상기생 추출물은 DMSO 용매를 사용하여 100, 250, 500 ng/ml로 희석하여 실험에 사용하였다. TRAP 용액은 Sigma Aldrich (St.Louis, MO, USA) 제품을 사용하였고, XTT assay kit는 Roche(Indianapolis, IN, USA)에서 구입하였다. 세포배양 및 파골세포 분화를 위해 필요한 α -MEM, FBS 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였고, human RANKL와 human M-CSF는 Peprotech (London, UK)의 제품을 사용하였다.
- Western blot을 위한 1차 항체로 rabbit-anti-c-Fos, mouse-anti-NFATc1 (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA, USA), rabbit-anti-phospho-p38, rabbit-anti-p38, rabbit-anti-phospho-Akt, rabbit-anti-Akt,rabbit-anti-phospho-JNK, rabbit-anti-JNK, rabbit-anti-phospho-IkB, rabbit-anti-IkB (Cell Signaling Technology; Beverly, MA, USA) 및 mouse-anti-β-actin (internal control) (Sigma Aldrich)등을 사용하였고, 2차 항체는 Amersham Phamacia Biotechnology Inc. (Tokyo, Japan)을 구입하여 사용하였다.
- 5 v/v% 용매로 추출한 것으로 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행에서 구입하였다. 상기생 추출물은 DMSO 용매를 사용하여 100, 250, 500 ng/ml로 희석하여 실험에 사용하였다. TRAP 용액은 Sigma Aldrich (St.
- 상기생 추출물은 ethanol 95~95.5 v/v% 용매로 추출한 것으로 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행에서 구입하였다. 상기생 추출물은 DMSO 용매를 사용하여 100, 250, 500 ng/ml로 희석하여 실험에 사용하였다.
- 세포배양 및 파골세포 분화를 위해 필요한 α -MEM, FBS 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였고, human RANKL와 human M-CSF는 Peprotech (London, UK)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 각각의 실험군은 3개 이상 수행하였고 평균값과 표준편차를 계산하였다. 모든 실험은 3회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험결과로 사용하였으며, 정량적인 결과의 통계는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
- 모든 실험은 3회 이상 반복하여 동일한 실험결과를 얻은 경우 실험결과로 사용하였으며, 정량적인 결과의 통계는 Student's t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
성능/효과
- 파골세포의 분화에 상기생 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위하여 대식세포에 파골세포 분화에 필수적인 M-CSF와 RANKL를 처리하고 상기생 추출물을 농도 별로 처리한 후 4일 동안 배양하였다. DMSO를 처리한 대조군에서는 TRAP 양성 다핵형 파골세포가 많이 생성되었으나, 상기생 추출물을 같이 처리한 실험군에서는 농도의 증가에 따른 TRAP 양성 파골세포의 형성이 억제되었고(Fig. 1A), TRAP 양성 세포 수도 상기생 추출물에 의해 농도 의존적으로 의미있게 감소하였다(Fig. 1B). 또한 상기생 추출물의 효과가 세포 독성과 연관되어 있는지를 확인하기 위하여 XTT 실험을 실행하였고, 다핵성 파골세포로의 분화를 억제하는 농도의 상기생 추출물에서는 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig.
- 대식세포를 상기생 추출물로 전처리 후 RANKL에 의한 p38, JNK, Akt, IkB의 활성을 주어진 시간별로 확인하였다. RANKL로 자극한 대조군과 비교했을 때, 상기생 추출물을 같이 처리한 군에서는 RANKL에 의한 p38, Akt, IkB의 인산화 및 IkB의 분해의 차이를 관찰할 수 없었지만, JNK 인산화는 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 이를 통해 상기생 추출물의 효과는 JNK의 신호전달 경로만을 이용하여 파골세포의 분화를 억제함을 알 수 있었다.
- 2B). c-Fos의 단백질은 억제된 반면, mRNA 발현은 변화가 없는 결과를 통해 상기생 추출물이 c-Fos의 번역과정을 억제함을 알 수 있었다.
- 상기생 추출물이 파골세포 골흡수능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 조골세포와 파골세포를 동조배양하여 성숙한 파골세포와 상기생 추출물을 hydroxyapatite로 코팅된 plate에 주입하였다. 그 결과, DMSO로 처리한 대조군에서는 hydroxyapatite가 파골세포에 의해 흡수된 부분을 많이 관찰할 수 있었지만, 상기생 추출물을 처리한 실험군에서는 흡수된 부분이 확연히 감소현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 4, top). 또한 실험군과 대조군의 골흡수 영역을 측정한 결과 실험군에서 의미있게 골흡수 영역이 감소됨을 확인하였다(Fig.
- AP-1 구성인자 중 하나인 c-Fos는 파골세포 분화 초기에 발현되며, c-Fos의 기능을 상실시킨 마우스모델에서 파골세포 분화의 완벽한 차단을 통해 골경화 현상을 보고됨에 따라 c-Fos 또한 파골세포 분화유도에 필수적인 전사인자임을 알 수 있다16,17). 따라서 상기생 추출물이 NFATc1과 c-Fos의 발현에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 흥미롭게도 NFATc1은 mRNA와 단백질 수준에서 모두 발현이 감소됨을 확인하였지만, c-Fos는 mRNA 발현에는 변화가 없으면서 단백질 수준에서 현저한 발현 억제 효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 이러한 실험결과를 통해 상기생이 c-Fos의 번역 단계에서의 억제를 유도하여 NFATc1의 저해함을 알 수 있었다.
- 2A). 또한 RANKL을 처리한 대조군은 c-Fos와 NFATc1의 단백질 발현을 촉진하였지만, 상기생 추출물을 처리에 의해 c-Fos, NFATc1 단백질 발현이 강하게 억제되었다(Fig. 2B). c-Fos의 단백질은 억제된 반면, mRNA 발현은 변화가 없는 결과를 통해 상기생 추출물이 c-Fos의 번역과정을 억제함을 알 수 있었다.
- 이러한 실험결과를 통해 상기생이 c-Fos의 번역 단계에서의 억제를 유도하여 NFATc1의 저해함을 알 수 있었다. 또한 상기생 추출물은 TRAP 과 OSCAR의 발현을 감소하였다. 더 나아가, integrin av와 integrin β3의 발현을 억제하였는데, 이를 통하여 상기생 추출물이 파골세포 형성에 있어서 기본이 되는 세포융합과 관련된 유전자인 integrin αv와 integrin β3의 활성을 제어하고18), 세포 외의 골기질 단백질인 vitronectin, osteopontin, fibrinogen과 integrin av, integrin β3의 상호작용을 억제함으로써 성숙한 파골세포로의 형성을 저해한다는 결과를 유추할 수 있었다19,20).
- 4, top). 또한 실험군과 대조군의 골흡수 영역을 측정한 결과 실험군에서 의미있게 골흡수 영역이 감소됨을 확인하였다(Fig. 4, bottom). 상기생 추출물이 파골세포의 bone material의 흡수를 억제시키는 현상을 동조배양을 통한 골흡수 분석에서 확인함으로써 인체 내에서도 상기생 추출물이 작용할 것이라고 예상할 수 있었다.
- 더 나아가, integrin av와 integrin β3의 발현을 억제하였는데, 이를 통하여 상기생 추출물이 파골세포 형성에 있어서 기본이 되는 세포융합과 관련된 유전자인 integrin αv와 integrin β3의 활성을 제어하고18), 세포 외의 골기질 단백질인 vitronectin, osteopontin, fibrinogen과 integrin av, integrin β3의 상호작용을 억제함으로써 성숙한 파골세포로의 형성을 저해한다는 결과를 유추할 수 있었다19,20). 또한 파골세포의 골격화 과정에서의 중요한 지표가 되는 actin ring과 밀접한 관계가 있는 유전자인 DC-STAMP와 Cathepsin K 유전자의 발현을 억제하는 결과를 통해 파골세포가 actin ring을 형성하여 성숙한 파골세포로써의 구조화를 막고 골흡수능을 저해할 것이라는 추측을 하였고21,22), hydroxyapatite 코팅된 plate를 이용한 골흡수 분석을 통해 상기생이 의미있게 골흡수를 억제함을 확인하였다(Fig. 4).
- 본 연구 결과, 상기생 추출물은 JNK 신호전달 경로를 통해 파골세포 분화 및 흡수에 관련된 전사인자의 활성을 저해시킴으로써 파골세포의 분화와 골흡수를 억제함을 확인하였다.
- 본 연구에 사용된 상기생은 100 ng/ml에서부터 세포 독성이 없이 농도 의존적으로 파골세포의 분화를 저해하였고, 500ng/ml에서는 현저히 억제하는 양상을 나타내었다(Fig. 1). 이러한 결과로 상기생이 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제함을 알 수 있지만, 본 연구를 통해서는 상기생 추출물의 어떠한 유효 성분이 파골세포 억제 효과를 나타내는지는 확인할 수 없으므로 더 나아가 성분 분석을 통하여 파골세포의 분화 억제 효과를 나타내는 유효성분 분석 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 JNK는 파골세포에서 AP1의 구성성분인 c-jun의 활성화를 통해 세포사를 억제하여 수명연장에 관여하는 것으로 보고되었다13,14). 본 연구에서 상기생 추출물의 작용기전을 확인해 본 결과, p38, Akt, IkB 인산화에는 영향을 주지 않았고, 오직 JNK 인산화만을 억제시키는 결과를 확인하였다(Fig. 3). 즉, 상기생 추출물에 의한 파골세포 분화의 주요 억제기전은 JNK의 신호경로를 저해함에 의한 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 파골세포의 분화에 중요한 유전자인 c-Fos, NFATc1, TRAP, OSCAR와 세포융합과 관련된 integrin αv, β3 그리고 actin ring과 연관된 DC-STAMP, Cathepsin K의 mRNA 발현을 확인한 결과, RANKL에 의해 증가된 mRNA 발현이 상기생 추출물의 처리에 의해 c-Fos를 제외하고 모두 통계적으로 유의있게 감소하였다(Fig. 2A).
- 상기생 추출물은 JNK의 인산화와 파골세포와 관련된 주요 전사인자 발현을 저해함으로써 파골세포 분화 및 골 흡수를 억제하였다. 따라서 상기생 추출물은 골다공증과 같은 파골세포와 관련된 골질환의 예방에 도움이 되는 물질이 될 수 있으며, 골질환 치료 후보물질로서의 가능성을 제시하였다.
- 4, bottom). 상기생 추출물이 파골세포의 bone material의 흡수를 억제시키는 현상을 동조배양을 통한 골흡수 분석에서 확인함으로써 인체 내에서도 상기생 추출물이 작용할 것이라고 예상할 수 있었다.
- 2). 이러한 실험결과를 통해 상기생이 c-Fos의 번역 단계에서의 억제를 유도하여 NFATc1의 저해함을 알 수 있었다. 또한 상기생 추출물은 TRAP 과 OSCAR의 발현을 감소하였다.
- 3). 이를 통해 상기생 추출물의 효과는 JNK의 신호전달 경로만을 이용하여 파골세포의 분화를 억제함을 알 수 있었다.
- 1C). 이를 통해, 상기생 추출물은 세포 독성이 없이 파골세포의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 1). 이러한 결과로 상기생이 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제함을 알 수 있지만, 본 연구를 통해서는 상기생 추출물의 어떠한 유효 성분이 파골세포 억제 효과를 나타내는지는 확인할 수 없으므로 더 나아가 성분 분석을 통하여 파골세포의 분화 억제 효과를 나타내는 유효성분 분석 연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.