선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 파골세포 분화를 억제하여 골다공증의 치료와 예방 가능한 천연물로 꾸지뽕나무 뿌리를 대상으로 파골세포 분화에 대한 억제 효능과 작용기전을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- Actin Ring 형성 측정 − RAW 264.7 세포주를 α-MEM에 배양하여 CTE 1, 2.5, 5, 10 µg/mL의 농도로 전처리하고 RANKL 50 ng/mL로 처리하여 파골세포로 분화시킨 후,성숙한 파골세포를 Alexa Flour 488이 결합된 phallodin으로 염색시킨 후, 30분 동안 DAPI로 염색하였다.
- 5, 5, 10 µg/mL의 농도로 전처리하고 RANKL 50 ng/mL로 처리하여 파골세포로 분화시킨 후,성숙한 파골세포를 Alexa Flour 488이 결합된 phallodin으로 염색시킨 후, 30분 동안 DAPI로 염색하였다. Actin ring과DAPI 염색은 형광현미경으로 관찰하였다.
- CTE의 세포 독성 효과 − CTE의 RAW 264.7 세포주에서 세포 생존에 미치는 영향을 확인하기 위해 CTE를 농도별로 처리하여 세포 독성을 확인하였다(Fig. 1).
- Incubated RAW 264.7 cells with CTE (1, 2.5, 5 and 10 µg/mL)for 24 h and performed MTT assay.
- Western Blot 분석 − RAW 264.7 세포주를 6-well plate에 1×106 cells/well, 5×103 cells/well로 각각 seeding하여 24시간 배양시킨 후, CTE를 농도별로 전처리한 후 RANKL(100 ng/mL)을 처리하였다.
- 분화시킨 파골세포를 10% 포름알데히드로 10분 간 고정시킨 후 TRAP solution을 통해 염색하였다. 그 중 3개 이상의 핵을 함유하는 TRAPpostive 다핵 세포를 현미경을 통해 수를 세어 파골세포 생성지표로 삼았다.
- 7 세포주를 6-well plate에 1×106 cells/well, 5×103 cells/well로 각각 seeding하여 24시간 배양시킨 후, CTE를 농도별로 전처리한 후 RANKL(100 ng/mL)을 처리하였다. 상등액을 제거하고 PBS로 세척한 후, RIPA buffer를 첨가하여 세포를 용해시키고 원심 분리하여 얻은 단백질은 Bradford assay로 정량하여 12%, 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 한 후 PVDF membrane에 옮긴 다음 5% skim milk로 30분간 blocking한 후 1차 항체를 1:1000으로 희석하여 넣고 12시간 동안 반응한 다음, 다시 2차 항체를 반응시키고, ECL 용액을 1:1로 잘 섞어서 membrane 위에 가하여 발광시키고 LAS4000을 이용하여 확인하였다.
- 세포 독성 평가 − CTE의 RAW 264.7 세포주 독성을 확인하기 위해 꾸지뽕나무 뿌리의 농도를 1, 2.5, 5, 10 µg/mL로 처리하여 MTT assay를 실행하였다.
- 파골세포 생성 측정 − RAW 264.7 세포주를 α-MEM에 배양하여 CTE 1, 2.5, 5, 10 µg/mL의 농도로 전처리하고RANKL 50 ng/mL로 처리하여 파골세포로 분화시킨 후, 성숙한 파골세포의 발현 marker로 알려진 TRAP을 염색하여 TRAP-postive한 세포를 확인하였다.
대상 데이터
- Minimum essential medium α(α-MEM),Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)은 Gibco Laboratories 사에서 구입하였으며, phosphate-buffered saline(PBS), fetal bovine serum(FBS)는 Welgene사에서 구입하였다. 4-6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)는 Sigma Aldrich사 제품을 사용하였으며, Alexa flour 488은 Life Technologies사 제품을 사용하였다. Primary antibody로 phosphor-JNK,JNK, phosphor-ERK, ERK, phosphor-p38, p-38 그리고 rabbit polyclonal 항체는 Cell Signaling Technology사 제품을 사용하였으며, c-Fos는 Santa cruz사, anti-nuclear factor of activated T cells-c1(NFATc1)은 BD biosciences사 제품을 사용하였다.
- Primary antibody로 phosphor-JNK,JNK, phosphor-ERK, ERK, phosphor-p38, p-38 그리고 rabbit polyclonal 항체는 Cell Signaling Technology사 제품을 사용하였으며, c-Fos는 Santa cruz사, anti-nuclear factor of activated T cells-c1(NFATc1)은 BD biosciences사 제품을 사용하였다. Chemilu-minescence(ECL) western blotting detection system은 Advansta사에서 구입하였으며, 흡광도는 BioRad사의 microplate reader를 이용하여 측정하였다.
- Minimum essential medium α(α-MEM),Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)은 Gibco Laboratories 사에서 구입하였으며, phosphate-buffered saline(PBS), fetal bovine serum(FBS)는 Welgene사에서 구입하였다.
- 4-6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI)는 Sigma Aldrich사 제품을 사용하였으며, Alexa flour 488은 Life Technologies사 제품을 사용하였다. Primary antibody로 phosphor-JNK,JNK, phosphor-ERK, ERK, phosphor-p38, p-38 그리고 rabbit polyclonal 항체는 Cell Signaling Technology사 제품을 사용하였으며, c-Fos는 Santa cruz사, anti-nuclear factor of activated T cells-c1(NFATc1)은 BD biosciences사 제품을 사용하였다. Chemilu-minescence(ECL) western blotting detection system은 Advansta사에서 구입하였으며, 흡광도는 BioRad사의 microplate reader를 이용하여 측정하였다.
- 세포배양 − 마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포주는 American Type Culutre Collection(ATCC)사에서 구매하여사용하였으며, DMEM 배지에 10% FBS와 1% penicillin streptomycin을 첨가하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 마다 계대배양 하면서 실험에 사용하였다.
- 시약 및 기기 − Recombinant soluble RANKL ligand(RANKL)는 PeproTech사 제품을 사용하였으며, 3'-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Amresco사, dimethyl sulfoxide(DMSO)는 AppliChem사에서 구입 하였다.
- 실험 재료 − 본 실험에 사용된 꾸지뽕나무 뿌리는 2014년 6월 대구광역시 약령 시장에서 건조된 것을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험군의 결과는 평균치와 표준오차로나타내었으며, 각 실험군 간의 결과는 student’s t-test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다.
- 통계처리 − 본 실험의 통계처리는 GraphPad Prism,version 3.03(GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)을 사용하였다.
성능/효과
- 12) CTE의 파골세포 분화 억제 효과를 검증하기 위해 western blot을 통해 확인한 결과 농도 의존적으로 c-Fos와 NFATc1의 발현이 감소되었다(Fig. 5). 이 결과로, c-Fos와 NFATc1의 발현 억제가 CTE의 파골세포 분화 억제 작용 기전과 관련 있음을 증명하였다.
- 13) 분화된 파골세포에 CTE를농도별로 처리하여 actin ring 형성을 관찰한 결과, 농도 의존적으로 형성이 억제됨을 확인하였다(Fig. 3).
- CTE의 파골세포 분화 억제 효과 − RAW 264.7 세포주에CTE와 RANKL(50 ng/mL)을 5일 동안 처리한 후, TRAP 염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과 농도 의존적으로 TRAP positive cell의 크기가 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 2A).
- 1). 관찰한 결과, 24시간 배양 시 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다.
- 본 연구는 꾸지뽕나무 뿌리 70% 에탄올 추출물의 파골세포 분화 억제와 그 메커니즘에 관하여 연구하였으며, 그 결과 RAW 264.7 세포주를 RANKL로 유도하여 파골세포로 분화시킨 후, 꾸지뽕나무 뿌리 70% 에탄올 추출물을 처리하였을 때, 파골세포 분화가 억제됨을 TRAP, actin ring 형성을 통해 확인할 수 있었으며, 분화된 파골세포에서 JNK,p38의 인산화를 통해서 억제됨을 나타내었고, 또한 파골세포 분화의 필수 전사인자인 c-Fos와 NFATc1의 발현이 억제됨을 확인하였다.
- 5). 이 결과로, c-Fos와 NFATc1의 발현 억제가 CTE의 파골세포 분화 억제 작용 기전과 관련 있음을 증명하였다.
- 4). 이로써, CTE에 의한 파골세포 분화 억제경로는 JNK, p38임을 증명하였다.
- 이상의 연구 결과로, 꾸지뽕나무 뿌리 70% 에탄올 추출물은 RANKL로 유도된 파골세포 분화를 억제하며, 파골세포의 분화 및 활성화에 관련된 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타나 골다공증의 예방 및 치료에 효과가 있을 것이라 생각된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.