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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 파골세포 분화에 효과가 있다고 밝혀진 단일 한약재 중 호두, 두충, 오가피, 생강을 사용하여 단독 추출물 및 복합 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보고자 하였다. 이를 위해 세포독성 측정에서 안전성을 확인한 후, TRAP activity, TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 시행하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 본 연구에서는 파골세포 분화에 효과가 있다고 밝혀진 단일 한약재 중 호두, 두충, 오가피, 생강을 사용하여 단독 추출물 및 복합 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보고자 하였다. 이를 위해 세포독성 측정에서 안전성을 확인한 후, TRAP activity, TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 시행하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- BMMs를 96-well plate에 1x104 cells /well로 분주하고 M-CSF(60 ng/㎖)를 처리한 후 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 첨가하여 4일간 배양하였다. 그 후 각각의 well에 CCK-8 용액을 처리하고, 2시간 동안 배양한 후 Molecular Devices(CA, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 Cell viability를 평가하였다.
- CCK-8을 이용하여 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 처리하여 세포독성을 측정하였다. ECE, ACE, JCE 처리군 중 모든 농도에서 세포독성이 발현되지 않았으나, JSE 처리군 중 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 각각 72.
- 3. Inhibition effect on osteoclast differentiation by JSE, ECE, ACE, JCE BMMs were cultured for 4 days with M-CSF(60 ng /㎖) and RANKL(100ng /㎖) in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. After 4 days cells were fixed in 10% formalin and stained for TRAP.
- 세포를 10% formaldehyde으로 고정하고, 활성화된 TRAP 염색 kit를 이용하여 TRAP 양성 세포로 염색하였다. JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로(3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800 ㎍/㎖) 처리 후, 신선한 배지 및 각 추출물 처리를 매3일마다 교체하고 TRAP 염색을 통해 파골 세포 분화를 관찰하였다. 현미경 관찰(배율, × 40)에서 TRAP 양성 다핵 세포 수를 세어 파골 세포로 간주하였다.
- JSE, ECE, ACE, JCE의 파골세포 분화에 대한 효과를 알아보기 위하여 마우스로부터 분리한 대식세포에 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 처리하고 RANKL로 파골세포로의 분화를 유도하였다. 그 결과, JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성있게 RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화를 농도 의존적으로 억제하였다.
- TRAP activity 측정 실험을 시행하여 호두, 두충, 오가피, 호두복합추출물 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화억제 효과를 확인하였다.
- TRAP activity 평가 역시 세포독성 평가와 같은 BMMs 분화 배지를 이용하여 JSE, ECE, ACE, JCE를 3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가한 후 TRAP으로 염색하여 측정하였다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 나타났다(p<0.
- TRAP 효소 활성을 특이적으로 측정하기 위해서 RBC lysis buffer로 세포를 파괴하고, 추출물에 존재하는 phosphatase 활성을 tartrate 존재 하에 측정을 시행하였다. 효소의 활성은 p-nitrophenylphosphate을 기질로 하여 형성된 p-nitrophenol의 양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.
- cells /well로 분주하고 M-CSF(60 ng/㎖)를 처리한 후 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 첨가하여 4일간 배양하였다. 그 후 각각의 well에 CCK-8 용액을 처리하고, 2시간 동안 배양한 후 Molecular Devices(CA, USA)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 Cell viability를 평가하였다.
- 각각 분쇄된 약재 100 g 을 환류추출기(heating Mantle, MS-DM609/20L)를 사용하여 45℃에서 30% 에탄올을 1ℓ 가하여 60분 추출한 후 다시 70% 에탄올 1ℓ를 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기(N-1200A, EYELA. CO. LTD, Japan)를 이용하여 유기용매를 제거하는 농축과정을 거치고, 동결건조기(PF-10/ALPHA 1-2LD, Germany)를 통하여 건조된 호두 추출물(JSE) 3.828 g(수득률 3.8%), 두충 추출물(ECE) 1.308 g(수득률 1.3%), 오가피 추출물(ACE) 1.716 g(수득률 1.7%), 호두복합추출물(JCE, 호두1:두충1:오가피1:생강1) 1.419 g(수득률 1.4%) 을 수득하였다.
- 모든 실험에서 JSE, ECE, ACE, JCE를 처리하지 않은 non treated group을 대조군으로 설정하여 0으로 명하였다. 실험군은 총 9군으로 각각의 추출물을 농도별(3.
- 세포독성 평가는 M-CSF와 RANKL을 처리하여 BMMs로 분화한 배지에서 JSE, ECE, ACE, JCE를 3.125 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖ 의 농도로 첨가하여 CCK-8을 사용하여 측정하였다. JSE를 제외한 실험군에서는 세포독성이 나타나지 않았으나, JSE 처리군에서는 200 ㎍/㎖ 처리군에서 72.
- 파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 내에 존재하는 3개 이상의 핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화정도를 측정하였다. 세포를 10% formaldehyde으로 고정하고, 활성화된 TRAP 염색 kit를 이용하여 TRAP 양성 세포로 염색하였다. JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로(3.
- 수컷 6-7 주령 ICR 마우스(Orient Bio Inc.)의 경골 및 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하고 BMMs를 이용하여 호두, 두충, 오가피 단독 및 호두복합추출물(호두, 두충, 오가피, 생강)이 파골세포 분화 억제에 미치는 영향을 알아보기 위해 세포독성, TRAP activity와 TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정을 시행하여 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 모든 실험에서 JSE, ECE, ACE, JCE를 처리하지 않은 non treated group을 대조군으로 설정하여 0으로 명하였다. 실험군은 총 9군으로 각각의 추출물을 농도별(3.125㎍/㎖, 6.25㎍/㎖, 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖)로 처리하였으며, 각 군을 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800으로 명하였다.
- BMMs는 10% FBS, Antibiotics(Penicillin, Streptomycin) 및 M-CSF(30ng/㎖)를 함유하는 α-MEM에서 배양되고 유지되었다. 파골 세포 분화에 대한 JSE, ECE, ACE, JCE의 효과를 측정하기 위해 M-CSF(60 ng/㎖)와 RANKL(100 ng/㎖)을 첨가한 BMMs(96-well plate에 1x104 cells/well)을 4일 동안 배양하였다.
- 파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 내에 존재하는 3개 이상의 핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화정도를 측정하였다. 세포를 10% formaldehyde으로 고정하고, 활성화된 TRAP 염색 kit를 이용하여 TRAP 양성 세포로 염색하였다.
- 파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 안에 존재하는 3개 이상의 핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화 억제 효과를 측정하였다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군에서 IC50(Half maximal inhibitory concentration) 값이 각각 13.
- 현미경 관찰(배율, × 40)에서 TRAP 양성 다핵 세포 수를 세어 파골 세포로 간주하였다.
- 호두, 두충, 오가피, 생강으로 구성된 호두복합추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 보기 위해 본 연구에서는 마우스의 골수유래 대식세포를 M-CSF와 RANKL이 함유된 배지에서 파골 전구세포로 배양하여 세포독성 평가와 TRAP 활성세포에서 TRAP activity 및 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 실시하였다.
- TRAP 효소 활성을 특이적으로 측정하기 위해서 RBC lysis buffer로 세포를 파괴하고, 추출물에 존재하는 phosphatase 활성을 tartrate 존재 하에 측정을 시행하였다. 효소의 활성은 p-nitrophenylphosphate을 기질로 하여 형성된 p-nitrophenol의 양을 흡광도를 이용하여 측정하였다. 96-well에 4×103 cells/well로 cell을 접종하고 분화인자와 시료를 처리하여 4일간 배양하였다.
대상 데이터
- M-CSF(60 ng/㎖), RANKL(100 ng/㎖) 그리고 cell counting kit-8(CCK-8)는 R&D system(Minneapolis, MN, USA)사의 제품을 사용하였다.
- M-CSF(60 ng/㎖), RANKL(100 ng/㎖) 그리고 cell counting kit-8(CCK-8)는 R&D system(Minneapolis, MN, USA)사의 제품을 사용하였다. TRAP은 KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY(Seattle, WA 98168, USA)사의 제품을 사용하였다. 흡광도 측정기는 Molecular Devices(CA, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 수컷 6-7 주령 ICR 마우스(Orient Bio Inc.)의 경골 및 대퇴골로부터 골수 세포를 분리하고 골수 유래 대식세포(Bone marrow-derived macrophages ; BMMs)를 사용하였다. BMMs는 10% FBS, Antibiotics(Penicillin, Streptomycin) 및 M-CSF(30ng/㎖)를 함유하는 α-MEM에서 배양되고 유지되었다.
- 실험에 사용된 10% fetal bovine serum(FBS), phosphate buffer saline(PBS), antibiotics(Penicillin/Streptomycin),M-CSF, α-minimum essential medium(α-MEM), red blood cell lysis buffer(RBC lysis buffer), 10% formaldehyde, 4-nitrophenylphosphatedisodium salt, 10 mM tartrate, 50 mM citrate buffer(pH4.6) 그리고 0.1N-NaOH는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 호두(Juglans regia), 두충(Eucommiaulmoides), 오가피(Eleutherococcus senticosus), 생강(Zingiberofficinale), 호두복합추출물(호두1:두충1:오가피1:생강1)은 한약규격품을 대전대학교 본초학교실에서 감정한 후 분쇄하여 시료 제조에 사용하였으며 대표적 한약공급업체인 옴니허브(Korea)에서 구입해 정선하여 사용하였다.
데이터처리
- 05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다. TRAP activity 및 TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정의 경우 Studentʹs t-test를 이용하여 분석한 후, Bonferroni 보정을 통해 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다.
- 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 세포 독성 측정의 경우 통계적인 차이는 Studentʹs t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.05 이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 별표(*)로 표시하였다. TRAP activity 및 TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정의 경우 Studentʹs t-test를 이용하여 분석한 후, Bonferroni 보정을 통해 p 값이 0.
- 정량적인 결과는 평균값과 표준편차로 표시하였다. 세포 독성 측정의 경우 통계적인 차이는 Studentʹs t-test를 이용하여 분석하였고 p 값이 0.
이론/모형
- BMMs were cultured 4 days with M-CSF(60 ng/㎖) in the presence or absence of JSE, ECE, ACE, JCE. The cell viability was evaluated by CKK-8 as described in materials and methods. Data are expressed as the percentage of control.
성능/효과
- ACE 및 JCE 처리군의 경우 25㎍/㎖ 이상의 농도에서 대조군에 비해 유의성 있는 TRAP 활성 감소 효과가 있는 것으로 나타났다(p<0.01, p<0.05, p<0.005).
- ECE, ACE, JCE 처리군 중 모든 농도에서 세포독성이 발현되지 않았으나, JSE 처리군 중 200㎍/㎖, 400㎍/㎖, 800㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 각각 72.84%, 57.44%, 27.48% 의 생존율 감소를 보여 대조군에 비해 유의성 있는 세포독성이 나타났다(p<0.05, p<0.01)(Fig. 1).
- JSE 및 ECE 처리군의 경우 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서, 대조군에 비해 유의성 있는 TRAP 활성을 줄이는 것으로 나타났다(p<0.005).
- JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 나타났다(p<0.05, p<0.01, p<0.005).
- JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포의 분화를 억제 효과로 농도 의존적으로 파골세포의 수를 감소시키는 것으로 나타났다(p<0.05, p<0.01, p<0.005).
- 파골세포를 분화시킨 후 일정 면적 안에 존재하는 3개 이상의 핵을 포함하면서 TRAP 양성인 세포 수를 측정함으로써, 파골세포의 분화 억제 효과를 측정하였다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군에서 IC50(Half maximal inhibitory concentration) 값이 각각 13.52㎍/㎖, 37.49㎍/㎖, 12.05㎍/㎖, 25.40㎍/㎖ 으로 확인되었다. JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포의 분화를 억제 효과로 농도 의존적으로 파골세포의 수를 감소시키는 것으로 나타났다(p<0.
- JSE를 제외한 실험군에서는 세포독성이 나타나지 않았으나, JSE 처리군에서는 200 ㎍/㎖ 처리군에서 72.84%의 생존율을 보여 대조군에 비해 유의성 있는 세포독성이 나타났으며(p<0.05), 400 ㎍/㎖ 처리군에서 57.44%, 800 ㎍/㎖ 처리군에서 27.48%의 생존율로 유효성 있는 세포독성이 나타났다(p<0.01).
- : 899 ㎍/㎖), ECE, ACE, JCE 처리군에서는 세포독성이 발생하지 않았다. TRAP activity 실험에 있어서 cell viability IC50값이 JSE 처리군은 13.52 ㎍/㎖, ECE 처리군은 37.49 ㎍/㎖, ACE 처리군은 12.05 ㎍/㎖, JCE 처리군은 25.40 ㎍/㎖으로 실험군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제효과가 나타났다(Fig. 5).
- TRAP 활성세포 염색 세포 수 측정 실험을 시행하여 호두, 두충, 오가피, 호두복합추출물 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화억제 효과를 확인하였다.
- JSE, ECE, ACE, JCE의 파골세포 분화에 대한 효과를 알아보기 위하여 마우스로부터 분리한 대식세포에 JSE, ECE, ACE, JCE를 농도별로 처리하고 RANKL로 파골세포로의 분화를 유도하였다. 그 결과, JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성있게 RANKL에 의해 유도된 파골세포의 분화를 농도 의존적으로 억제하였다.
- 대조군에 비해 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두 파골세포의 분화 억제에 영향을 주는 것으로 나타났다(p<0.05, p<0.01, p<0.005).
- 세포독성 측정 실험을 시행하여 호두복합추출물 처리군에서 세포독성이 발현되지 않았다. 두충, 오가피 단독 처리군에서 세포독성이 나타나지 않았으나, 호두 단독 처리군 중 일부 농도에서 세포독성이 나타났다.
- 세포독성 측정 실험과 TRAP activity 측정 실험을 종합하여볼 때, 호두복합추출물 처리군은 세포독성 없이 농도 의존적으로 파골세포 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
- 이 중 ACE 처리군에서 가장 우수한 TRAP 활성 감소 효과가 나타났다(p<0.01,p<0.005)(Fig. 2).
- 이상의 결과를 종합해보면, JSE 처리군에서는 200 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 800 ㎎/㎖ 농도에서 세포독성이 나타난데 비해, JCE을 처리한 군의 경우 세포독성이 나타나지 않는 것으로 보아 한약재의 상호작용으로 단일 물질보다 복합물질에 있어 더욱 안전한 것으로 사료된다. 또한 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 있어, 향후 이 약재들이 골다공증 예방 및 치료에 활용될 가능성을 확인하였다.
- 005). 특히 ACE 처리군에서 IC50값이 12.05㎍/㎖ 로 파골세포 분화 억제에 가장 효과적인 것으로 나타났다.
- 005). 특히 ACE 처리군이 가장 우수하게 파골세포 분화를 억제하는 결과를 보였다(Fig. 3, Fig. 4).
- 현미경으로 TRAP으로 염색한 파골세포의 다핵세포의 수를 측정하여 JSE, ACE 처리군에서는 50 ㎍/㎖ 의 농도에서부터, ECE, JCE 처리군에서는 100㎍/㎖ 의 농도에서부터 다핵세포가 관찰되지 않아 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 나타났다. 그러나 JSE 처리군의 경우 cell viability IC50값이 13.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해보면, JSE 처리군에서는 200 ㎎/㎖, 400 ㎎/㎖, 800 ㎎/㎖ 농도에서 세포독성이 나타난데 비해, JCE을 처리한 군의 경우 세포독성이 나타나지 않는 것으로 보아 한약재의 상호작용으로 단일 물질보다 복합물질에 있어 더욱 안전한 것으로 사료된다. 또한 JSE, ECE, ACE, JCE 처리군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 파골세포 분화 억제 효과가 있어, 향후 이 약재들이 골다공증 예방 및 치료에 활용될 가능성을 확인하였다.
- 향후 호두복합추출물로 골다공증 관련 연구를 시행할 때, 파골세포 분화 억제에 가장 우수한 효과를 보였던 오가피의 용량에 따른 효과, 파골세포 분화 억제와 관련된 유전자의 탐색, 조골세포에 미치는 영향 등을 고려한 심도 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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