원지의 뿌리는 기억력을 향상시키는 동양의 전통 약재로 널리 알려져 있다. 그러나 그 작용기전은 아직까지 해명되지 않았다. 본 연구에서는 항산화 효과 뿐만 아니라 신경 세포 에서 파생된 PC12 세포의 acetylcholinesterase(AchE) 활성과 연관된 인지능에 대한 원지열수추출물(PRHWE)의 효과를 in vitro 및 살아 있는 세포에서 조사하였다. 먼저 MTT assay을 이용한 세포생존에 대한 연구에서 PRHWE는 0.1% 이하의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. PRHWE는 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide의 소거활성과 환원력이 농도에 비례하여 증가시킨다는 것이 관찰되었다. 특히 PRHWE는 hydroxyl radical에 의하여 유발되는 DNA의 산화에 대한 보호효과를 나타내었다. 부가적으로 그것은 신경성세포에서 nitric oxide의 생성을 억제하였다. 더욱이 AchE 활성은 PRHWE의 농도에 비례하여 감소하였다. 뿐만 아니라, PRHWE는 PC12 세포에서 SOD-1과 NOS-2 발현수준을 증가 시킨다는 것이 발견되었다. 더욱이 reporter gene assay를 이용한 실험에서 p53과 NF-${\kappa}B$의 전사활성이 PRHWE의 존재 하에서 감소했다. 그러므로 이러한 결과들은 PRHWE가 신경성세포에서 항산화 활성 및 신경 세포 보호 효과가 있다는 것을 증명하였고, 이는 PRHWE가 사람의 건강을 위한 치료제로 큰 잠재성을 가지고 있다는 것을 시사한다.
원지의 뿌리는 기억력을 향상시키는 동양의 전통 약재로 널리 알려져 있다. 그러나 그 작용기전은 아직까지 해명되지 않았다. 본 연구에서는 항산화 효과 뿐만 아니라 신경 세포 에서 파생된 PC12 세포의 acetylcholinesterase(AchE) 활성과 연관된 인지능에 대한 원지열수추출물(PRHWE)의 효과를 in vitro 및 살아 있는 세포에서 조사하였다. 먼저 MTT assay을 이용한 세포생존에 대한 연구에서 PRHWE는 0.1% 이하의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. PRHWE는 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide의 소거활성과 환원력이 농도에 비례하여 증가시킨다는 것이 관찰되었다. 특히 PRHWE는 hydroxyl radical에 의하여 유발되는 DNA의 산화에 대한 보호효과를 나타내었다. 부가적으로 그것은 신경성세포에서 nitric oxide의 생성을 억제하였다. 더욱이 AchE 활성은 PRHWE의 농도에 비례하여 감소하였다. 뿐만 아니라, PRHWE는 PC12 세포에서 SOD-1과 NOS-2 발현수준을 증가 시킨다는 것이 발견되었다. 더욱이 reporter gene assay를 이용한 실험에서 p53과 NF-${\kappa}B$의 전사활성이 PRHWE의 존재 하에서 감소했다. 그러므로 이러한 결과들은 PRHWE가 신경성세포에서 항산화 활성 및 신경 세포 보호 효과가 있다는 것을 증명하였고, 이는 PRHWE가 사람의 건강을 위한 치료제로 큰 잠재성을 가지고 있다는 것을 시사한다.
The root of Polygala radix has been widely known as an oriental traditional medicinal stuff that improves memory. However, its mechanism of action remains unclear. In this study, the effect of Polygala radix hot water extracts (PRHWE) on cognitive function related to the activity of acetylcholineste...
The root of Polygala radix has been widely known as an oriental traditional medicinal stuff that improves memory. However, its mechanism of action remains unclear. In this study, the effect of Polygala radix hot water extracts (PRHWE) on cognitive function related to the activity of acetylcholinesterase (AchE) derived from neural cells (PC12) in addition to antioxidant activity was examined both in a cell-free system and live cells. First, in the study on cell viability using an MTT assay, PRHWE did not exhibit any cell toxicity at 0.1% (w/v) or below. It also was observed that PRHWE increased the scavenging activity of DPPH radical, hydrogen peroxide and superoxide, reducing power in a dose-dependent manner. In particular, PRHWE had a protective effect on DNA oxidation induced by hydroxyl radicals. Additionally, it inhibited the production of inducible nitric oxide in neuronal cells. Furthermore, the AchE activity decreased with increasing concentrations. In addition, PRHWE increased the expression level of SOD-1 and NOS-2 in PC12 cells. Moreover, the transcriptional activities of p53 and NF-${\kappa}B$ were reduced in the presence of PRHWE in an experiment using a reporter gene assay. Therefore, these results prove that PRHE has antioxidative and protective effects on neuronal cells, suggesting that it may have great potential as a therapeutic agent for human health.
The root of Polygala radix has been widely known as an oriental traditional medicinal stuff that improves memory. However, its mechanism of action remains unclear. In this study, the effect of Polygala radix hot water extracts (PRHWE) on cognitive function related to the activity of acetylcholinesterase (AchE) derived from neural cells (PC12) in addition to antioxidant activity was examined both in a cell-free system and live cells. First, in the study on cell viability using an MTT assay, PRHWE did not exhibit any cell toxicity at 0.1% (w/v) or below. It also was observed that PRHWE increased the scavenging activity of DPPH radical, hydrogen peroxide and superoxide, reducing power in a dose-dependent manner. In particular, PRHWE had a protective effect on DNA oxidation induced by hydroxyl radicals. Additionally, it inhibited the production of inducible nitric oxide in neuronal cells. Furthermore, the AchE activity decreased with increasing concentrations. In addition, PRHWE increased the expression level of SOD-1 and NOS-2 in PC12 cells. Moreover, the transcriptional activities of p53 and NF-${\kappa}B$ were reduced in the presence of PRHWE in an experiment using a reporter gene assay. Therefore, these results prove that PRHE has antioxidative and protective effects on neuronal cells, suggesting that it may have great potential as a therapeutic agent for human health.
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문제 정의
원지의 다양한 생물학적 효능이 밝혀져 있으나, 인지능과 관련된 효능은 현재까지도 명백하지 않다. 그러므로 본 연구에서는 원지추출물의 항산화 효과를 조사하기 위하여 동맥협착증에서 파생된 신경세포의 일종인 PC12 (pheochromocytoma) 갈색종 세포를 배양하여 acetylcholinesterase (AchE)가 얼마나 억제되는지에 대한 것과 PC12 세포에서 효과적인 농도로 세포에 처리하여 nitric oxide를 분비시키는지 원지추출물의 영향을 분석하였다.
제안 방법
Brand-Williams [5] 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 원지의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 PRHWE를 DPPH 용액을 가하여 10 분 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20 분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
PC12 세포의 세포막을 터뜨려 lysate를 추출하여 아세틸콜린을 분해하는 효소인 acetylcolinesterase 억제 능력을 나타내는지 확인하기 위하여, PRHWE을 처리하였다. Control군에는 PC12 cell lysate 만을 처리하였고, sample군에는 PRHWE을 처리하여 5 분, 10 분, 15 분간 변화를 측정하였다.
PRHWE이 항산화 효소의 발현을 조절하는데 가장 중요한 전사인자인 NF-ĸB 와 널리 알려진 항산화 효소인 SOD-1, NOS-2, p53 및 p-p53의 단백질 발현을 조사하였다. Fig.
따라서 본 연구에서는 두뇌의 산화적 손상과 관련하여 원지 열수 추출물의 항산화 효과를 조사하였다. PRHWE는 세포독 성이 없는 농도에서 DPPH radical 소거능력, reducing power, hydroxyl radical, hydrogen peroxide의 소거효과가 있는 것으로 나타났다.
본 실험에 사용한 원지는 흐르는 물에 깨끗이 세척한 다음 자연 건조한 후, 수 차례 물로 세척하여 세척·건조된 상기 원지를 각각 증류수와 1:10의 중량 %비로 혼합하여 진탕기로 80℃에서 3 시간 동안 진탕하여 2회 반복하여 열수 추출하였고, 얻어진 용액을 합하여 회전 진공 농축하여 용매를 증발시켜 추출물을 얻었다. 상기 추출물을 여과한 후, 여과된 여액을 동결건조하여 분말 형태의 원지 열수추출물을 얻는다.
생체에서 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH, hydrogen peroxide, hydroxyl radical와 같은 활성산소종에 대한 PRHWE의 소거능력 및 환원력에 대하여 조사하였다. DPPH radical 소거법은 DPPH radical이 항산화 물질로 인해 환원되면, 자색이 탈색되는 정도를 지표로 하여 지질 과산화의 초기 억제 정도를 예측 할 수 있다.
세포 수준에서 PRHWE의 항 염증과 활성산소억제 능력을 나타내는지 확인하기 위하여, PC12 세포에 PRHWE을 처리하여 NO생성억제 효과를 확인하였다. Fig.
대상 데이터
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. PC12 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)로 부터 제공받았다. 원지, MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타 시약은 Sigma Chemical Co.
상기 추출물을 여과한 후, 여과된 여액을 동결건조하여 분말 형태의 원지 열수추출물을 얻는다. 분말형태의 원지 열수추출물을 시험농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. PC12 세포는 American Type of Culture Collection (Manassas, VA, USA)로 부터 제공받았다.
데이터처리
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s test 한 후 p<0.
데이터를 "평균±표준편차(n=3)"로 나타내었다. 얻어진 Student's t-test를 이용한 대조군과 비교하여 통계적으로 분석하였다.
이론/모형
Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 PC12 세포로부터 추출하였다[29]. Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화 는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다[24]. 먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험농도의 PRHWE, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 PC12 세포로부터 추출하였다[29]. Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화 는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다[24].
Hansen [13]의 방법에 따라 PC12 세포에 대한 PRHWE의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
Oyaizu [26]의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 ml에 pH 6.
PRHWE가 PC12 세포에 독성을 미치지 않는 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. Fig.
후속연구
AchE의 활성을 억제하는 것은 알츠하이머 치료에 있어서 가장 중요하여, 이는 기억력 감퇴현상이 진행되는 것을 막아주어 병의 진행을 지연시키고 인지능을 증진시킨다는 점에서 큰 의미를 가지고 있다. 그러므로 향후에 원지의 유효성분을 분리, 정제 및 화학구조를 분석하고, 생체 내에서도 두뇌 인지능에 탁월한 효능을 나타내는 회합물의 구조와 작용원리를 규명하게 되면 새로운 치료 약제를 개발하기 위한 후보물질의 도출 가능성을 제시할 수 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
원지의 함유성분은 무엇이 있습니까?
원지의 성분과 효능에 관련된 연구결과는 비교적 많지 않은 편으로 원지의 함유성분은 polysaccharide, flavonoid, glycoside류, xanthone o-glycosides, xanthones 등이 보고되고 있으며, 효능에 관한 연구로는 안신작용, 이뇨효과 및 중추억제작용, 뇌성상세포로부터 염증성 세포활성물질 분비의 억제효과, 항정신성 및 항염증 작용 등이 보고 된 바 있다[20]. 원지의 뿌리에는 polygalitol, tenuigenin, xanthone 유도체 등이 포함되어 있으며, 이들 성분은 아드레날린이나 글루카곤의 혈당상승작용을 중개하는 세포 내 인자인 cAMP의 활성을 의미있게 억제하는 것으로 알려져 있다[12].
원지는 무엇으로 만든 약재입니까?
이러한 천연물 중 원지(Polygala radix, PR)는 원지과(polygalaceae)에 속하는 다년생 초본으로서 우리나라를 비롯하여 중국 등에서 서식하고 있는데, 오래 전부터 원지는 신경안정 및 항 정신병 효과를 가진 천연약물로 사용 되어 왔다[23]. 원지는 원지과에 속한 다년생 초본인 원지의 뿌리를 건조한 약재로 널리 알려진 인삼의 주요한 성분이다[2]. 원지의 다양한 생물학적 효능이 밝혀져 있으나, 인지능과 관련된 효능은 현재까지도 명백하지 않다.
원지가 발현을 증가시키는 기억력 관련 인자는 무엇이 있습니까?
원지의 경우 기억력 증가 실험을 위한 다양한 행동실험에서 원지 열수 추출물의 경우 기억력 감퇴를 회복시키며 또한 세포사멸로부터 신경세포를보호하며, 대조군에 비하여 기억력을 향상시킨다는 보고가 있다[28]. 최근에는 기억력과 관련된 인자 중 cAMP response element-binding protein (CREB)와 brain derived neurotrophic factor (BDNF)의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있고[7], 교감 신경계의 신경 전달 작용을 하는 부신수질에서 에피네프린과 함께 추출되는 호르몬 중 하나인 nor-epinephrine (NE), 호르몬이나 신경전달물질로서 중요한 노르에피네프린과 에피네프린 합성체의 전구물질(precursor)인 dopamine (DA) 역시 발현 양이 증가 되는 것으로 보고 있다[15]. 쥐 신장의 골수에서 유래된 PC12 cell에서 원지에 의한 세포독성을 줄여주고 caspase-3, DNA fragmentation 등 세포사멸과 관련된 인자를 줄여 세포생존력을 증가시켰으며, 기억력을 증가시키는 것으로 확인 되었다[35].
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