A protease inhibitor from fish eggs was fractionated using chromatographic methods. The fractionation efficiency was evaluated in terms of specific inhibitory activity (SIA, U/mg), purity (fold), total inhibitory activity (TIA, U), and recovery (%). The protease inhibitor (PI) from egg extracts of s...
A protease inhibitor from fish eggs was fractionated using chromatographic methods. The fractionation efficiency was evaluated in terms of specific inhibitory activity (SIA, U/mg), purity (fold), total inhibitory activity (TIA, U), and recovery (%). The protease inhibitor (PI) from egg extracts of skipjack tuna (ST Katsuwonus pelamis), yellowfin tuna (YT Thunnus albacares) and Alaska pollock (AP Theragra chalcogramma) was fractionated using Sephadex G-50 gel filtration and DEAE-Sepharose CL-6B anion exchange chromatography based on protein size exclusion and net charge, respectively. Fractions exhibiting strong inhibitory activity were contained in the 30-50 kDa fraction on gel filtration and in the range of 0.4-0.7 M NaCl gradient fraction on anion exchange chromatography. The respective TIA and percent recovery of the fraction obtained with gel filtration toward trypsin and $N{\alpha}$-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) were 2,758.7 U and 29.6% for ST, 1,005.5 U and 25.6% for YT, and 1,267.5 U and 26.0% for AP. Gel filtration chromatography was more effective at fractionating PI than using ion exchange chromatography. These results suggest that fish eggs act as serine protease inhibitors and might be useful for protease inhibition in foodstuffs.
A protease inhibitor from fish eggs was fractionated using chromatographic methods. The fractionation efficiency was evaluated in terms of specific inhibitory activity (SIA, U/mg), purity (fold), total inhibitory activity (TIA, U), and recovery (%). The protease inhibitor (PI) from egg extracts of skipjack tuna (ST Katsuwonus pelamis), yellowfin tuna (YT Thunnus albacares) and Alaska pollock (AP Theragra chalcogramma) was fractionated using Sephadex G-50 gel filtration and DEAE-Sepharose CL-6B anion exchange chromatography based on protein size exclusion and net charge, respectively. Fractions exhibiting strong inhibitory activity were contained in the 30-50 kDa fraction on gel filtration and in the range of 0.4-0.7 M NaCl gradient fraction on anion exchange chromatography. The respective TIA and percent recovery of the fraction obtained with gel filtration toward trypsin and $N{\alpha}$-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) were 2,758.7 U and 29.6% for ST, 1,005.5 U and 25.6% for YT, and 1,267.5 U and 26.0% for AP. Gel filtration chromatography was more effective at fractionating PI than using ion exchange chromatography. These results suggest that fish eggs act as serine protease inhibitors and might be useful for protease inhibition in foodstuffs.
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문제 정의
, 2013). 본 연구에서는 가다랑어 Katsuwonus pelamis, 황다랑어 Thunnus albacares 및 명태 Theragra chalcogramma 알을 대상으로 하여 이들의 crude extracts (CE)로부터 단백질의 분자량(size exclusion)과 하전(net charge)의 차이에 근거한 gel filtration과 anion exchange chromatography를 통하여 protease inhibitor 를 분획하고, 수율 및 총 저해활성을 통하여 분획효과를 검토함으로써 산업적 응용을 위한 효율적이고 직접적인 분획공정 개발을 위한 자료를 제시하고자 하였다.
7%)에 비하여 3종의 어류 알 모두에서 일정한 회수율을 나타냄으로써 보다 효과적인 분획방법이라 판단되었다. 앞서의 연구(Kim et al., 2013)의 단백질 용해도 차이에 의한 분획방법에서 우수한 분획 효과를 나타낸 ammonium sulfate (AS) 40-80% 포화 농도 획분을 대상으로 gel filtration 법을 적용한 연속분획을 통한 어류 알 protease inhibitor의 기초 분획공정 확립을 위한 실험을 진행하였다.
, 2013)과 본 실험의 결과를 토대로 최적의 분획 공정의 확립 및 개발을 위하여는 대량처리 및 분획이 가능한 ammonium sulfate의 장점과 단백질 분자량의 크기에 따른 분획효과와 연속처리가 가능한 gel filtration의 장점을 동시에 충족시키면서 단백질 변성을 최소화하는 단시간 내에 처리 가능한 분획 방법이 요구된다. 이에 이상의 장점을 충족하는 방법으로서 앞으로의 연구에서는 ultrafiltration system을 통한 분획 공정을 개발 확립하고자 한다.
제안 방법
6 x 95 cm)에 주입하고, 일정한 유속(40 mL/hr)으로, 용출(3 mL/tube) 시켜, 이를 9회 반복 실시하였다. Chromatogram 상의 단백질 농도 측정은 280 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, BAPNA 기질을 사용하여 trypsin에 대한 저해활성(%)을 보인 fraction을 분획한 다음, 이를 농축 및 투석하여 총 저해활성 및 회수율을 통해 분획효율을 검정하였다.
6 x 95 cm)에 주입하고, 일정한 유속(40 mL/hr)으로, 용출(3 mL/tube) 시켜, 이를 9회 반복 실시하였다. Chromatogram 상의 단백질 농도 측정은 280 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, BAPNA 기질을 사용하여 trypsin에 대한 저해활성(%)을 보인 fraction을 분획한 다음, 이를 농축 및 투석하여 총 저해활성 및 회수율을 통해 분획효율을 검정하였다.
Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 가다랑어(ST)가 약 20-40%의 저해활성 분포를 보였으며, 황다랑어(YT)는 약 15-25%, 그리고 명태 (AP)의 경우, 15-30%의 저해활성 분포를 나타내었다. 가다랑어, 황다랑어 및 명태 알 CE로부터 gel filtration chromatography를 9회 실시하여 분획 농축한 fraction의 trypsin에 대한 total inhibitory activity (TIA, U), specific inhibitory activity (SIA, U/mg), 정제도(fold)와 회수율(%)은 Table 1과 같다. 이들 fraction의 trypsin (BAPNA 기질)에 대한 SIA (U/mg) 및 TIA (U)는 가다랑어(ST-G)가 각각 108.
가다랑어(ST), 황다랑어(YT) 및 명태(AP) 알의 CE로부터 protease inhibitor의 분획은 gel filtration chromatography 분획법 및 anion exchange chromatography 분획법)에 의하여 실시하였다. 각 분획방법 별 fraction의 저해활성은 target protease인 trypsin에 대해 BAPNA 기질을 사용하여 측정함으로써 그 효과를 검정하였다.
먼저, BAPNA 기질을 사용하여 측정한 trypsin 활성은 일정량(30 μL)의 0.1% trypsin 용액에 0.6 mM BAPNA기질이 용해되어 있는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) 3 mL를 혼합 및 반응(40℃, 1 hr) 시킨다음, 반응액에 0.3 mL의 33% acetic acid를 가하여 반응 정지를 시킨 후, 410 nm에서 흡광도(U-2900, UV-VIS spectrophotometer, Hitachi, Tokyo, Japan)를 측정하였다.
먼저, 단백질 분자량의 차이에 따른 어류 알 CE의 분획은 5 mL의 CE를 0.1 M NaCl을 함유하는 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)로 평형화 시킨 Sephadex G-50 colum(i.d. 1.6 x 95 cm)에 주입하고, 일정한 유속(40 mL/hr)으로, 용출(3 mL/tube) 시켜, 이를 9회 반복 실시하였다. Chromatogram 상의 단백질 농도 측정은 280 nm에서의 흡광도로 나타내었으며, BAPNA 기질을 사용하여 trypsin에 대한 저해활성(%)을 보인 fraction을 분획한 다음, 이를 농축 및 투석하여 총 저해활성 및 회수율을 통해 분획효율을 검정하였다.
산업적 응용을 위한 기초 실험으로서, 앞서의 연구(Kim et al., 2013)에서 우수한 분획 효과를 보인 40-80% 포화 ammonium sulfate 분획의 fractions을 대상으로 Sephadex G-50 column (i.d. 1.6 x 95 cm)을 이용하여 gel filtration을 실시하고, 총 저해활성 및 회수율을 통해 연속분획효율을 검정하였다.
어류 알 CE로부터 ammonium sulfate (AS) 40-80% 포화 농도 획분을 대상으로 gel filtration 법을 적용한 연속분획을 통하여 어류 알 protease inhibitor의 기초 분획공정 확립을 위한 실험의 결과를 Fig. 4 및 Table 4에 나타내었다. 3종의 어류 알 AS 40-80% fractions의 Sephadex G-50 gel filtration 결과(Fig.
1 digit을 1 U/mg으로 나타내었다. 어류 알 CE의 target protease에 대한 상대 저해활성(RIA, relative inhibitory activity, %)은 이상에서 측정한 target protease의 어류 알 CE 및 분획물의 무첨가 대조구 활성(C) 및 첨가 활성(A)을 이용하여 다음과 같은 방법으로 산출하였다.
어류 알의 protease inhibitor를 효율적으로 분획할 목적으로 가다랑어, 황다랑어 및 명태 알 CE로부터 분자량의 크기에 따른 분획을 Sephadex G-50 column (i.d. 1.6 x 95 cm)을 사용하여 분획한 chromatogram은 Fig. 1과 같다. 3종의 어류 알의 CE 모두 fraction No.
1의 결과와 유사한 chromatogram을 나타내어 30-50 kDa의 획분에서 protease inhibitors가 용출되었으며, chromatogram 상의 저해활성은 가다랑어가 40-80%로 가장 강한 활성을 나타내었고, 황다랑어(10-35%) 그리고 명태(10-15%) 순이었다. 이들 획분을 모아 농축하여 회수율(%) 및 정제도(fold)에 대하여 상호 비교하여 연속분획공정의 분획효과에 대해 검토하였다(Table 4). 먼저, AS 40-80% fractions의 TIA (U)는 각각 가다랑어 (ST)는 9,216.
대상 데이터
Target proteases, 기질 및 buffer 어류 알 crude extracts (CE)로부터 protease inhibitor 획분의 분획을 사용한 sephadex G-50 gel matrix와 DEAE-sepharose CL-6B anion exchange resin, 저해활성 분포를 살펴보기 위한 target protease로는 serine protease인 trypsin와 이의 합성기질인 BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide)은 SigmaAldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 시용하였으며, 그 외 시약은 분석급으로 구입하여 사용하였다.
실험에 사용한 3 종류의 어류 알은 가다랑어(ST, Skipjack tuna) 및 황다랑어(YT, Yellowfin tuna) 알은 경상남도 창원시 소재 (주) 동원산업에서 동결상태로 분양받았고, 대조구로서 사용한 명태(AP, Alaska pollock) 알은 부산광역시 사하구 소재 블루오션 (주)에서 동결상태로 분양받았다. 분양 받은 3 종류의 어류 알은 초저온 냉동고 (-70℃)에 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 3 종류의 어류 알은 가다랑어(ST, Skipjack tuna) 및 황다랑어(YT, Yellowfin tuna) 알은 경상남도 창원시 소재 (주) 동원산업에서 동결상태로 분양받았고, 대조구로서 사용한 명태(AP, Alaska pollock) 알은 부산광역시 사하구 소재 블루오션 (주)에서 동결상태로 분양받았다. 분양 받은 3 종류의 어류 알은 초저온 냉동고 (-70℃)에 보관하여 두고 실험에 사용하였다.
이론/모형
Serine protease인 trypsin 활성은 기질로 BAPNA를 사용하여 Ji et al. (2011)의 방법에 따라 측정하였다. 먼저, BAPNA 기질을 사용하여 측정한 trypsin 활성은 일정량(30 μL)의 0.
Walker (2002)의 방법에 따라, 10% Mini-PROTEANⓇTGXTM Precast gel (Bio-Rad Lab. Inc., USA)을 Mini-PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad Lab. Inc., USA)에 장착한 한 다음, 일정량(5-10 μL)의 시료를 주입하고, gel (10 well)당 10 mA의 전류로 전기영동을 실시하였다.
가다랑어(ST), 황다랑어(YT) 및 명태(AP) 알의 CE로부터 protease inhibitor의 분획은 gel filtration chromatography 분획법 및 anion exchange chromatography 분획법)에 의하여 실시하였다. 각 분획방법 별 fraction의 저해활성은 target protease인 trypsin에 대해 BAPNA 기질을 사용하여 측정함으로써 그 효과를 검정하였다.
어류 알 CE 및 분획물의 단백질 농도는 Lowry et al. (1951)의 비색법에 따라 bovine serum albumin을 표준 단백질로 하여 구한 검량곡선으로부터 측정하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 시용하였으며, 그 외 시약은 분석급으로 구입하여 사용하였다. 효소활성 측정을 위해 사용한 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0)는 Dawson et al. (1986)의 방법에 따라 조제하였다.
성능/효과
4 및 Table 4에 나타내었다. 3종의 어류 알 AS 40-80% fractions의 Sephadex G-50 gel filtration 결과(Fig. 4)는 Fig. 1의 결과와 유사한 chromatogram을 나타내어 30-50 kDa의 획분에서 protease inhibitors가 용출되었으며, chromatogram 상의 저해활성은 가다랑어가 40-80%로 가장 강한 활성을 나타내었고, 황다랑어(10-35%) 그리고 명태(10-15%) 순이었다. 이들 획분을 모아 농축하여 회수율(%) 및 정제도(fold)에 대하여 상호 비교하여 연속분획공정의 분획효과에 대해 검토하였다(Table 4).
1과 같다. 3종의 어류 알의 CE 모두 fraction No. 22-36 (분자량 30-50 kDa 범위)에서 trypsin 저해활성을 나타내는 fraction이 용출되었다. Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 가다랑어(ST)가 약 20-40%의 저해활성 분포를 보였으며, 황다랑어(YT)는 약 15-25%, 그리고 명태 (AP)의 경우, 15-30%의 저해활성 분포를 나타내었다.
22-36 (분자량 30-50 kDa 범위)에서 trypsin 저해활성을 나타내는 fraction이 용출되었다. Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 가다랑어(ST)가 약 20-40%의 저해활성 분포를 보였으며, 황다랑어(YT)는 약 15-25%, 그리고 명태 (AP)의 경우, 15-30%의 저해활성 분포를 나타내었다. 가다랑어, 황다랑어 및 명태 알 CE로부터 gel filtration chromatography를 9회 실시하여 분획 농축한 fraction의 trypsin에 대한 total inhibitory activity (TIA, U), specific inhibitory activity (SIA, U/mg), 정제도(fold)와 회수율(%)은 Table 1과 같다.
108-122)에서 trypsin에 대한 저해활성을 나타내는 fraction이용출되었다. Chromatogram 상의 trypsin 저해활성(RIA, %)은 가다랑어가 약 30-70%의 저해활성 분포를 보였으며, 황다랑어는 약 10-20%, 그리고 명태의 경우, 5-10%의 저해활성 분포를 나타내었다.
1 U)의 순이었다. 그러나, 어류 알 CE로부터 분획된 fraction의 정제도(fold)와 회수율(%)은 SIA 및 TIA와는 달리 가다랑어(ST-I)의 경우 각각 3.4배 및 9.3%로 가장 낮았고, 다음으로 명태(AP-I, 7.3배 및 16.4%) 및 황다랑어 알(YT-I, 2.9배 및 23.7%)의 순으로 높았다.
어류 알 CE, gel (ST-G 및 YT-G) 및 anion exchange chromatography (ST-I 및 YT-I)에 의한 fractions의 native-PAGE 전기영동 결과는 Fig 3과 같다. 먼저 가다랑어 (K. pelamis)의 CE (lane 1)에는 gel 상단에 cationic protein band와 중간에 부분에 protein band가 확인되었으며, ST-G (lane 2)와 ST-I (lane 3)의 경우도 gel 상단의 cationic protein band가 존재하는 반면, CE에 비하여 gel 중간 부분의 band는 감소한 경향을 보였다. 황다랑어(T.
이들 획분을 모아 농축하여 회수율(%) 및 정제도(fold)에 대하여 상호 비교하여 연속분획공정의 분획효과에 대해 검토하였다(Table 4). 먼저, AS 40-80% fractions의 TIA (U)는 각각 가다랑어 (ST)는 9,216.3 U, 황다랑어(YT)는 5,785.9 U 그리고 명태(AP)는 5,904.3 U로서 각 어류 알 CE에 대하여 각각 27.2, 38.7 및 33.4%의 회수율을 나타내어, 어류알 CE의 gel filtration fractions (Table 1, 25.6-29.6%)보다는 우수한 것으로 나타났다. 이들 획분을 gel filtration을 통해 연속처리 한 fractions의 회수율이 각 어류 알 CE에 대해 ST-AG가 9.
0%로 10% 미만의 회수율을 보임으로써 AS fraction에서 gel filtration 과정 중에 단백질 변성과 protease inhibitor의 분획과정 중의 유실로 인한 상당한 저해활성 손실이 있음이 확인되었다. 아울러 분획물의 SIA (U/mg) 및 정제도에서도 황다랑어를 제외하고는 감소하는 경향을 보였으며, 황다랑어의 경우도 2.2에서 2.6배로 정제도가 크게 개선되지 않음으로써 ammonium sulfate 분획 및 gel filtration을 연속분획 공정은 정제 및 분획효과가 거의 없는 것으로 나타났다.
가다랑어, 황다랑어 및 명태 알 CE로부터 gel filtration chromatography를 9회 실시하여 분획 농축한 fraction의 trypsin에 대한 total inhibitory activity (TIA, U), specific inhibitory activity (SIA, U/mg), 정제도(fold)와 회수율(%)은 Table 1과 같다. 이들 fraction의 trypsin (BAPNA 기질)에 대한 SIA (U/mg) 및 TIA (U)는 가다랑어(ST-G)가 각각 108.1 U/mg 및 2758.7 U로서 CE (각각 28.4 U/mg 및 9,201.6 U)에 비하여 3.8배의 정제도와 29.6%의 회수율을 나타내어 가장 높았고, 다음으로 명태가 각각 98.1 U/mg 및 1,267.5 U로서 CE (각각 11.8 U/mg 및 4,885.2 U)에 비해 8.3배의 정제도가 증가하였으며, 이때의 회수율은 26.0%이었다. 황다랑어(YT-G)의 경우는 102.
6%)보다는 우수한 것으로 나타났다. 이들 획분을 gel filtration을 통해 연속처리 한 fractions의 회수율이 각 어류 알 CE에 대해 ST-AG가 9.8%, YT-AG는 8.8% 그리고 AP-AG는 5.0%로 10% 미만의 회수율을 보임으로써 AS fraction에서 gel filtration 과정 중에 단백질 변성과 protease inhibitor의 분획과정 중의 유실로 인한 상당한 저해활성 손실이 있음이 확인되었다. 아울러 분획물의 SIA (U/mg) 및 정제도에서도 황다랑어를 제외하고는 감소하는 경향을 보였으며, 황다랑어의 경우도 2.
이상 결과로 미루어 보아 Sephadex G-50 gel filtration chromatography를 이용한 3종의 어류 알의 CE로부터 protease inhibitor의 분획은 25-30% 수준의 회수율 보여 회수율 고려한다면, 적적한 분획방법이 아닌 것으로 판단되나, 정제도 측면에서는 오히려 3.8-8.3배의 정제도를 나타냄으로써 상대적으로 순도가 높은 획분을 얻고자 한다면, 분획방법으로서 유용한 수단이 될 수 있으리라 판단되었다.
이상의 결과로 미루어 보아 DEAE-Sepharose CL-6B anion exchange resin을 이용한 이온교환 크로마토그래피에 의해 3종의 어류 알 CE로부터 protease inhibitor를 분획하고자 하는 경우, NaCl 농도 0.4-0.7 M 범위에서 fraction을 분획하는 것이 적절하리라 판단되었다.
4%로서 약 10% 내외의 차이를 보였다. 이상의 결과로 어류 알 CE로부터 protease inhibitor를 chromatography법을 이용하여 분획하고자 하는 경우, 회수율 측면에서 gel filtration 법(25.6-29.6%)이 anion exchange chromatography법 (9.3-23.7%)에 비하여 3종의 어류 알 모두에서 일정한 회수율을 나타냄으로써 보다 효과적인 분획방법이라 판단되었다. 앞서의 연구(Kim et al.
후속연구
따라서, 앞서의 연구(Kim et al., 2013)과 본 실험의 결과를 토대로 최적의 분획 공정의 확립 및 개발을 위하여는 대량처리 및 분획이 가능한 ammonium sulfate의 장점과 단백질 분자량의 크기에 따른 분획효과와 연속처리가 가능한 gel filtration의 장점을 동시에 충족시키면서 단백질 변성을 최소화하는 단시간 내에 처리 가능한 분획 방법이 요구된다. 이에 이상의 장점을 충족하는 방법으로서 앞으로의 연구에서는 ultrafiltration system을 통한 분획 공정을 개발 확립하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
수산물 가공 중 발생하는 알의 양이 가장 많은 어종은?
우리나라에서 생산되는 성게, 명태, 대구, 연어 및 청어 알은 대부분이 알젓의 형태로 제조되어 판매가 되고 있을 뿐이며, 수산물 가공 중 발생하는 알의 양이 가장 많은 어종인 가다랑어 및 황다랑어 알의 경우, 전어체 중량의 1.5-3.
가다랑어 및 황다랑어 알은 어떻게 이용되는가?
5-3.0%를 차지하며, 식용소재로서 효율적으로 이용되지 못하고 가축 및 애완동물의 사료로 이용되거나 대부분 폐기되고 있는 실정이다(Heu et al., 2006; Intarasirisawat et al.
ion exchange chromatography 분획법의 장점은?
Ion exchange chromatography 분획법은 acetone이나 ammonium sulfate 분획법과 같이 CE로부터 사용되는 ion exchange matrix의 양에 비례하여 1회에 대량처리가 가능한 점, 단백질의 하전 차이에 따른 분획이므로 분획효과가 뛰어나다는 점, 비교적 단시간에 처리가 가능하다는 점, 사용한 ion exchange matrix는 regeneration과정을 거쳐 반복사용이 가능한 점, 비교적 단백질의 변성 가능성이 적은 점 등과 같은 장점이 있다. 하지만, ion exchange chromatography 분획법은 ion exchange matrix가 고가인 점, 하전에 의한 분획방법이므로 분획을 위하여 각기 이온강도를 달리하면서 사용하여야 하는 점, 상온에서의 단백질 변성을 최소화하기 위해 저온에서 실행하여야 하는 점, 1회 처리 후 재사용을 위해 ion exchange matrix의 regeneration과정을 거쳐야 하는 점, 분획 후 이온강도의 차이를 위해 사용한 염이 각 fraction에 함께 존재하므로 탈염조작이 필요한 점, 경우에 따라 fraction의 농축과정이 필요한 점 등과 같은 단점이 있다.
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