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문제 정의
- 현재 국내에는 고시된 공정분석법이 없어 개발회사에서 제공하는 HPLC 를 이용한 개별 분석법을 일부 활용하고 있으나 분석과정이 복잡하여 범용으로 활용하기에는 어려움이 많다. 따라서 본연구에서는 isopyrazam의 국내 농산물에 최적화 된 새로운 개별 분석법 개발을 목표로 추출 및 정제효과가 높고 수행이 간편한 과정들을 조합하여 실용적인 분석법을 확립하고자 하였다.
- 4와 같다. 분석 대상 성분의 분자구조로부터 유도되는 분자이온과 주요 fragment ion을 확인함으로써 보다 신뢰성 있는 정성확인이 가능하도록 하였다. 분석 대상 성분을 LC/MS로 재확인할 때 monitoring하는 SIM channel의 수를 과다하게 설정하면 신호/잡음(S/N) 비가 낮아짐으로 분석 시료별 SIM channel의 설정은 3개 이내로 제한하는 것이 적정 감도를 위하여 필요하였다(이영득, 2012).
- 추출물로부터 isopyrazam성분 외에 추출 혼입된 농산물 시료의 유래 불순물을 제거하기 위하여 dichloromethane 또는 n-hexane과 같은 비극성 유기용매로 최적의 분배법을 확립하고자 하였다. 분석 대상 농약의 추출액을 포화식염수/증류수로 희석한 후 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate의 적용성을 검정하였다.
제안 방법
- 대상 성분의 n-hexane/acetonitrile 분배법의 분배효율을 조사한 결과 Table 6과 같다. 500 mL 용량의 분액여두에 isopyrazam의 표준용액을 정확히 가한 후 acetonitrile로 포화시킨 n-hexane 40 mL을 가하여 n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile 30 mL로 2회 및 3회 실시하였을 때 모두 100% 이상의 회수율을 보여 2회 분배를 선정하였다. n-Hexane/acetonitrile 분배법을 대상 농산물 시료에 적용하여 각 시료에 대한 유지성 불순물 제거 효율을 조사한 결과 Table 7과 같다.
- 이었다. HPLC/UVD 분석을 통하여 시료 중 검출된 isopyrazam 잔류분의 정성적 신뢰성 확인을 위하여 LC/ MS를 이용하였으며, 분석 조건은 Table 2와 같다.
- 6%이었고, 분석오차는 모두 10% 미만으로 개별 분석법 기준 범위를 만족하였다. HPLC/UVD를 이용하여 분석한 isopyrazam 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위하여 LC/MS를 이용한 재확인용 기기분석법을 수행하여 정량한계수준에서 재확인 하였다. 본 연구에서 확립한 isopyrazam의 개별 분석법은 각 단계별 효율을 검증하였을 뿐만 아니라 재확인 과정을 포함하여 잔류분석결과의 신뢰성을 확보하였다.
- 분석 단계별 표준화된 검증을 수행하였으며, 시료 조제 및 기기분석과정의 명확성과 편의성을 함께 고려하였다. Isopyrazam의 대표 농산물 6종 (현미, 대두, 고추, 감귤, 오이, 참외)의 시료로부터 잔류분을 acetonitrile로 추출하고 n-hexane으로 분배 추출하였다. 현미와 대두 시료의 경우 n-hexane/acetonitrile 분배 과정을 추가로 확립하여, 유지 및 비극성 간섭물질이 다량 함유되어 있는 작물 시료까지 분석대상 시료의 범위를 확장하였다.
- 또한 isopyrazam의 분석 대상 시료 중 현미와 대두 시료는 n-hexane/acetonitrile 분배법을 적용하여 보다 깨끗한 크로마토그램 결과를 확보할 수 있었다. Isopyrazam의 대표 농산물 현미, 대두, 고추, 감귤, 오이 및 참외 무처리 시료에 isopyrazam을 정량한계 수준을 포함하여 3수준 3반복으로 처리한 후 확립한 분석과정을 수행하였다. 회수율 및 정량한계를 산출한 결과 Table 12, 13과 같다.
- LC/MS를 이용하여 isopyrazam의 표준품으로 대상 화합물의 mass spectrum상 분자구조를 잘 반영하면서 intensity가 높은 최적 ion 및 fragment ion 값을 얻고자 total-ion chromatogram (TIC)을 확보하였다. TIC로부터 얻은 isopyrazam의 mass spectrum으로부터 selected-ion monitoring (SIM)용 최적 fragment를 선정하였다(Fig.
- 일반적으로 중성의 화합물 분리에 많이 사용되는 역상(reversed phase) column (C18)을 사용하여 분석하였으며, 재현성과 분석 시간 측면에서 유리 할 것으로 판단되는 isocratic 조건을 우선적으로 시도하였다. Syn과 anti-isomer 간 분리가 충분히 이루어지고 분석 시료 중 불순물의 간섭이 적었던 acetonitrile/water (60/40, v/v) 조건을 isopyrazam의 분석 조건으로 선정하였다.
- 각 농산물 시료별 잔류분석법의 적용성을 검정하기 위하여 무처리 시료에 대한 회수율 시험을 수행하였다. 각각의 대상 농산물 무처리 시료에 isopyrazam의 표준용액을 0.
- 각각의 대상 농산물 무처리 시료에 isopyrazam의 표준용액을 0.04, 0.4 및 2.0 mg kg−1 수준이 되도록 3수준 3반복으로 처리하여 앞서 기술한 분석과정을 수행하여 회수율 및 분석오차를 산출하였다.
- 본 연구에서 확립된 잔류분석법을 이용하여 분석된 isopyrazam 잔류분의 신뢰성 높은 정성적 재확인을 위하여 LC/MS를 이용한 재확인용 기기분석법을 확립하였다.
- HPLC/UVD를 이용하여 분석한 isopyrazam 잔류분의 신뢰성을 확보하기 위하여 LC/MS를 이용한 재확인용 기기분석법을 수행하여 정량한계수준에서 재확인 하였다. 본 연구에서 확립한 isopyrazam의 개별 분석법은 각 단계별 효율을 검증하였을 뿐만 아니라 재확인 과정을 포함하여 잔류분석결과의 신뢰성을 확보하였다. 즉, 확립된 분석법은 높은 감도와 우수한 재현성, 분석과정의 편의성을 고려할 때 농산물의 잔류농약에 대한 잔류 검사 및 안전성 평가를 위한 공정 분석법으로 활용될 수 있다고 판단된다.
- Isopyrazam에 대하여 HPLC/UVD를 이용한 새로운 정밀 잔류농약 분석법을 확립하였다. 분석 단계별 표준화된 검증을 수행하였으며, 시료 조제 및 기기분석과정의 명확성과 편의성을 함께 고려하였다. Isopyrazam의 대표 농산물 6종 (현미, 대두, 고추, 감귤, 오이, 참외)의 시료로부터 잔류분을 acetonitrile로 추출하고 n-hexane으로 분배 추출하였다.
- 추출물로부터 isopyrazam성분 외에 추출 혼입된 농산물 시료의 유래 불순물을 제거하기 위하여 dichloromethane 또는 n-hexane과 같은 비극성 유기용매로 최적의 분배법을 확립하고자 하였다. 분석 대상 농약의 추출액을 포화식염수/증류수로 희석한 후 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate의 적용성을 검정하였다. 액-액 분배조건에 따른 isopyrazam의 분배효율과 양상을 조사한 결과 Table 4, 5와같다.
- 용출액을 40℃ 이하 수욕 상에서 감압 · 농축하여, 건고한 잔류물을 acetonitrile 5 mL로 재용해 한 후 HPLC/UVD로 분석하였다.
- 그 결과 210 nm에서 가장 높은 흡광력을 보였으나, 유기화합물이 대부분인 시료 중 방해물질과의 간섭을 최소화하기 위하여 다음으로 높은 흡광력을 보인 254 nm를 측정파장으로 선정하였다. 일반적으로 중성의 화합물 분리에 많이 사용되는 역상(reversed phase) column (C18)을 사용하여 분석하였으며, 재현성과 분석 시간 측면에서 유리 할 것으로 판단되는 isocratic 조건을 우선적으로 시도하였다. Syn과 anti-isomer 간 분리가 충분히 이루어지고 분석 시료 중 불순물의 간섭이 적었던 acetonitrile/water (60/40, v/v) 조건을 isopyrazam의 분석 조건으로 선정하였다.
- 증기압은 25℃에서 1.3 × 10−4mPa으로 휘발성이 낮은 편이며, 분자 구조 내에 -NH기를 함유하고 있어 GLC 분석이 어려울 것으로 판단되어 HPLC-UVD를 이용한 기기분석법을 시도하였다.
- 현미와 대두 시료의 경우 n-hexane/acetonitrile 분배 과정을 추가로 확립하여, 유지 및 비극성 간섭물질이 다량 함유되어 있는 작물 시료까지 분석대상 시료의 범위를 확장하였다. 최종적으로 florisil 흡착 크로마토그래피를 이용한 정제과정을 이용하여 추출액을 정제함으로써 간섭물질의 최소화, 분석의 정확성 및 신뢰성을 극대화하였다. Isopyrazam의 정량 한계는 0.
- 합친 여과액을 40℃ 이하 수욕 상에서 감압 · 농축하여, 농축잔사를 1,000 mL 용량의 분액여두에 옮기고 포화식염수 50 mL, 증류수 400 mL를 가하여 n-hexane으로 50 mL, 50 mL로 2회 분배 하였으며, 분배액을 15 g의 anhydrous sodium sulfate층을 통과시켜 탈수시킨 후 감압 · 농축, 건고하였다. 현미와 대두 시료를 제외한 고추, 감귤, 오이 및 참외의 경우 건고한 잔류물에 10 mL의 n-hexane으로 재용해 하여, 흡착 크로마토 그래피를 수행하였으며, 현미와 대두시료의 경우 비극성 불순물을 제거하기 위하여 n-hexane/acetonitrile 분배과정을 추가하였다. 건고한 현미와 대두 시료 잔류물에 acetonitrile로 포화시킨 n-hexane 40 mL을 가하여 500 mL 용량의 분액여두에 옮기고, n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile 30 mL를 가하여 2회 반복 분배 하였다.
대상 데이터
- n-Hexane/ethyl acetate의 혼합용매를 사용하여 최적의 방법을 확립하고자 isopyrazam의 용출 양상을 조사한 결과 Table 8~11과 같다. Isopyrazam보다 빠르게 용출되는 간섭물질을 제거하기 위한 세척용 용출용매는 100 mL의 용매로 용출시켰을 때 isopyrazam의 용출이 없는 n-hexane/ethyl acetate (90/10, v/ v) 혼합용매를 선정하였으며, isopyrazam의 성분을 회수하기 위한 용출용매는 100 mL 구간을 용출시켰을 때 syn-isomer와 anti-isomer 모두 98% 이상 용출된 n-hexane/ ethyl acetate (70/30, v/v) 혼합용매를 선정하였다.
- Isopyrazam의 분석법 확립을 위한 분석 대상 농산물은 Codex Alimentarius Commission의 잔류분석법 검증을 위한 대표시료 분류기준에 따라 곡류는 현미, 두류는 대두, 채소류는 고추, 오이 및 참외, 과일류는 감귤로 총 6종의 대표 농산물 시료를 선정하였다. 대표 농산물로 선정된 현미, 대두, 고추, 감귤, 오이 및 참외의 무농약 재배 시료는 지역 대형마트에서 판매하는 유기농산물을 구매하여 “농약잔류성 시험 기준과 방법”에 따라 분석하였다.
- LC/MS를 이용하여 isopyrazam의 표준품으로 대상 화합물의 mass spectrum상 분자구조를 잘 반영하면서 intensity가 높은 최적 ion 및 fragment ion 값을 얻고자 total-ion chromatogram (TIC)을 확보하였다. TIC로부터 얻은 isopyrazam의 mass spectrum으로부터 selected-ion monitoring (SIM)용 최적 fragment를 선정하였다(Fig. 3). Isopyrazam의머무름 시간 및 LC/MS SIM을 위한 fragment의 m/z 값은 Table 14에 나타내었으며, 이러한 LC/MS 조건을 대상 농산물 시료에 적용한 잔류분의 재확인의 예는 Fig.
- 흡착 크로마토그래피법에 의한 정제에 사용된 florisil (60~100 mesh, 잔류분석용)은 Fluka (USA)로부터 구입하여 130℃에서 5시간 이상 활성화 시킨 후 사용하였다. n-Hexane, acetonitrile 및 ethyl acetate 는 J. T. Baker (USA)에서 구입하여 사용하였으며, dichloromethane은 Junsei Chemical, Co., Ltd. (GR급, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 무기 및 기타 시약은 잔류분석용 또는 GR급을 사용하였다.
- 1과 같다. 그 결과 210 nm에서 가장 높은 흡광력을 보였으나, 유기화합물이 대부분인 시료 중 방해물질과의 간섭을 최소화하기 위하여 다음으로 높은 흡광력을 보인 254 nm를 측정파장으로 선정하였다. 일반적으로 중성의 화합물 분리에 많이 사용되는 역상(reversed phase) column (C18)을 사용하여 분석하였으며, 재현성과 분석 시간 측면에서 유리 할 것으로 판단되는 isocratic 조건을 우선적으로 시도하였다.
- 본 연구에 사용된 isopyrazam (syn-isomer, 순도 97.3%; anti-isomer, 순도 96.3%)의 분석용 표준품은 Syngenta Korea에서 분양받아 사용하였다. Isopyrazam 표준품의 일정 량을 acetonitrile에 녹여 500 mg kg−1의 농도로 조제하여 2℃에서 냉장 보관하면서 필요시 마다 보관 중인 stock solution을 희석하여 사용하였다.
- 따라서 시료 내부로의 침투성이 높아 충분한 추출 효율을 얻을 수 있는 수용성 유기용매인 acetone, acetonitrile 및 methanol을 주로 사용한다(이영득, 2012). 본 연구에서는 대상 농산물 시료로부터 isopyrazam을 추출하기 위한 용매로 비극성 농약의 잔류분석법에서 표준적으로 널리 사용되고 있는 acetonitrile을 사용하였다(AOAC, 2005; US FDA, 2002).
- 본 연구의 분석 대상 농약 isopyrazam은 신젠타에서 개발한 pyrazolecarboxamide계 살균제로 anti와 syn 이성질체가 존재한다(Tomlin, 2009). Isopyrazam은 국내 신규농약으로 오이와 참외의 흰가루병에 대하여 등록되어 있으며, 잔류허 용기준은 2012년 9월에 오이 2.
- 무기 및 기타 시약은 잔류분석용 또는 GR급을 사용하였다. 전처리 시 농산물 시료를 마쇄 및균질 화 하기위한 시료균질기(AM-10, Nissei, Nihonseiki Kaisha Ltd., Japan)와 진탕기(Lab. Companion IS-971R, Jeio Tech, Korea)를 사용하였으며, 추출액을 감압유거 하기 위하여 농축기(Eyela NE-1001, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)를 사용하였다.
- Isopyrazam 표준품의 일정 량을 acetonitrile에 녹여 500 mg kg−1의 농도로 조제하여 2℃에서 냉장 보관하면서 필요시 마다 보관 중인 stock solution을 희석하여 사용하였다. 흡착 크로마토그래피법에 의한 정제에 사용된 florisil (60~100 mesh, 잔류분석용)은 Fluka (USA)로부터 구입하여 130℃에서 5시간 이상 활성화 시킨 후 사용하였다. n-Hexane, acetonitrile 및 ethyl acetate 는 J.
- 잔류농약분석에서 대상성분의 기기 분석을 위한 최종 정제과정에서 필수적으로 이용되는 흡착크로마토그래피법은 간섭물질 제거법으로 가장 많이 사용하는 방법이다. 흡착제 로는 alumina, florisil, silica gel 및 활성탄 등이 있으며, isopyrazam의 이화학 특성을 고려하여 중간 극성의 잔류분석법에서 표준적으로 사용하는 florisil을 흡착제로 선정하였다. Florisil은 silica (SiO2)와 magnesia (MgO)를 혼합 · 용융하여 제조한 합성 흡착제로서 유지 및 색소의 비용출성이 우수한 장점이 있다(이영득, 2012).
이론/모형
- 대표 농산물로 선정된 현미, 대두, 고추, 감귤, 오이 및 참외의 무농약 재배 시료는 지역 대형마트에서 판매하는 유기농산물을 구매하여 “농약잔류성 시험 기준과 방법”에 따라 분석하였다.
- Isopyrazam의 표준용액을 1,000 mL 용량의 분액여두에 정확히 가한 후 포화식염수 50 mL, 증류수 400 mL를 가하여 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate 액-액 분배 조건에 따른 분배효율과 양상을 조사한 결과 50 mL 용매로 2회 및 3회 실시하였을 때 세 분배용매 모두 95% 이상의 회수율을 보였다. 추출할 경우 간섭물질의 방해가 적을 것으로 판단되는 n-hexane을 분배용매로 하여 2회 분배법을 선정하였다(이영득, 2012). 한편 n-hexane/acetonitrile 분배 법은 비극성인 지방이나 왁스물질의 제거에 주로 이용되는 정제법으로 액-액 분배과정 중 hexane층으로 분배되는 비극성 간섭물질의 제거효과가 기대되었다.
성능/효과
- Isopyrazam의 정량 한계는 0.04 mg kg−1이었으며, 분석법 검증을 위한 회수율 시험 결과 대상 성분과 농산물 시료에 따라 syn-isomer의 회수율은 81.0~105.4%, anti-isomer의 회수율은 80.8~105.6%이었고, 분석오차는 모두 10% 미만으로 개별 분석법 기준 범위를 만족하였다.
- Isopyrazam의 표준용액을 1,000 mL 용량의 분액여두에 정확히 가한 후 포화식염수 50 mL, 증류수 400 mL를 가하여 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate 액-액 분배 조건에 따른 분배효율과 양상을 조사한 결과 50 mL 용매로 2회 및 3회 실시하였을 때 세 분배용매 모두 95% 이상의 회수율을 보였다. 추출할 경우 간섭물질의 방해가 적을 것으로 판단되는 n-hexane을 분배용매로 하여 2회 분배법을 선정하였다(이영득, 2012).
- 2와 같았으며, isopyrazam의 분석 대상 무처리 시료의 크로마토그램에서 간섭물질은 관찰되지 않았다. 또한 isopyrazam의 분석 대상 시료 중 현미와 대두 시료는 n-hexane/acetonitrile 분배법을 적용하여 보다 깨끗한 크로마토그램 결과를 확보할 수 있었다. Isopyrazam의 대표 농산물 현미, 대두, 고추, 감귤, 오이 및 참외 무처리 시료에 isopyrazam을 정량한계 수준을 포함하여 3수준 3반복으로 처리한 후 확립한 분석과정을 수행하였다.
- 본 연구에 사용된 isopyrazam의 대상 농산물 무처리 시료에서 대상 성분들의 peak가 관찰되지 않았으며, 인위적으로 각각의 표준품을 첨가한 시료에서는 동일한 머무름 시간대에 정확하게 isopyrazam의 잔류분만을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 확립한 분석과정을 적용하여 isopyrazam의 잔류분석을 수행한 결과 Fig. 2와 같았으며, isopyrazam의 분석 대상 무처리 시료의 크로마토그램에서 간섭물질은 관찰되지 않았다. 또한 isopyrazam의 분석 대상 시료 중 현미와 대두 시료는 n-hexane/acetonitrile 분배법을 적용하여 보다 깨끗한 크로마토그램 결과를 확보할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구에 사용된 isopyrazam의 대상 농산물 무처리 시료에서 대상 성분들의 peak가 관찰되지 않았으며, 인위적으로 각각의 표준품을 첨가한 시료에서는 동일한 머무름 시간대에 정확하게 isopyrazam의 잔류분만을 확인할 수 있었다. 따라서 LC/MS의 SIM 조건을 이용할 경우 HPLC/UVD를이용한 정량법과 더불어 isopyrazam의 잔류분의 추가적 정성 분석법으로 활용할 수 있다.
- 본 연구에서 확립한 isopyrazam의 개별 분석법은 각 단계별 효율을 검증하였을 뿐만 아니라 재확인 과정을 포함하여 잔류분석결과의 신뢰성을 확보하였다. 즉, 확립된 분석법은 높은 감도와 우수한 재현성, 분석과정의 편의성을 고려할 때 농산물의 잔류농약에 대한 잔류 검사 및 안전성 평가를 위한 공정 분석법으로 활용될 수 있다고 판단된다.
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