[국내논문]개와 고양이에서 분리된 Enterobacteriaceae와 Pseudomonas aeruginosa의 항균제 내성 및 내성 유전자의 분포 Antimicrobial resistance and distribution of resistance gene in Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa isolated from dogs and cats원문보기
This study was carried out to investigate the antimicrobial resistance pattern and distribution of resistance gene in 44 Enterobacteriaceae and 21 Pseudomonas (P) aeruginosa isolated from hospitalized dogs and cats in animal hospital from 2010 to 2011 in Daegu. Among Enterobacteriaceae, Escherichia ...
This study was carried out to investigate the antimicrobial resistance pattern and distribution of resistance gene in 44 Enterobacteriaceae and 21 Pseudomonas (P) aeruginosa isolated from hospitalized dogs and cats in animal hospital from 2010 to 2011 in Daegu. Among Enterobacteriaceae, Escherichia (E) coli was highly resistant to ampicillin (56.7%), followed by tetracycline (53.3%), cephalothin, streptomycine, sulfamethoxazole/trimethoprim, gentamicin and norfloxacin (40.0~43.3%). The remaining isolates of Enterobacteriaceae had high resistance to ampicillin (64.3%) and streptomycin (42.9%). Whereas, P. aeruginosa was low resistant to all antimicrobials tested (less than 15%). int I 1 gene was detected in 20 (57.1%) of 35 antimicrobial resistant Enterobacteriaceae and 2 (9.5%) of 21 P. aeruginosa., but int I 2 gene was not detected in all isolates. The eight resistance genes were found either alone or combination with other gene (s): $bla_{TEM}$, aadA, strA-strB, clmA, tetA, tetB, sul I and sul II. About 78% of integron-positive isolates were resistance to more than four antimicrobial agents. The findings suggest that class I integrons are widely distributed in E. coli among Enterobacteriaceae from dogs and cats and multi-drug resistance related to the presence of class I integrons. The prudent use of antimicrobials and continuous monitoring for companion animals are required.
This study was carried out to investigate the antimicrobial resistance pattern and distribution of resistance gene in 44 Enterobacteriaceae and 21 Pseudomonas (P) aeruginosa isolated from hospitalized dogs and cats in animal hospital from 2010 to 2011 in Daegu. Among Enterobacteriaceae, Escherichia (E) coli was highly resistant to ampicillin (56.7%), followed by tetracycline (53.3%), cephalothin, streptomycine, sulfamethoxazole/trimethoprim, gentamicin and norfloxacin (40.0~43.3%). The remaining isolates of Enterobacteriaceae had high resistance to ampicillin (64.3%) and streptomycin (42.9%). Whereas, P. aeruginosa was low resistant to all antimicrobials tested (less than 15%). int I 1 gene was detected in 20 (57.1%) of 35 antimicrobial resistant Enterobacteriaceae and 2 (9.5%) of 21 P. aeruginosa., but int I 2 gene was not detected in all isolates. The eight resistance genes were found either alone or combination with other gene (s): $bla_{TEM}$, aadA, strA-strB, clmA, tetA, tetB, sul I and sul II. About 78% of integron-positive isolates were resistance to more than four antimicrobial agents. The findings suggest that class I integrons are widely distributed in E. coli among Enterobacteriaceae from dogs and cats and multi-drug resistance related to the presence of class I integrons. The prudent use of antimicrobials and continuous monitoring for companion animals are required.
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문제 정의
aeruginosa에서 이들 내성 유전자에 관한 보고는 드물다(Rubin 등, 2008). 따라서 이번 연구에서는 대구지역 동물병원에 입원 치료 중인 개와 고양이에서 분리한 Enterobacteriaceae와 P. aeruginosa를 대상으로 각종 항균제에 대한 내성 유형을 분석하고, 한 가지 이상의 약제에 내성을 보인 균주에 대해서는 항생제 내성 유전자의 보유 유무를 조사하기 위해 시험하였다.
제안 방법
공시균을 Mueller-hinton broth (Oxoid, UK)에 접종하여 37℃에서 2∼4시간 배양하여 균 농도를 McFarland No. 0.5로 조정한 후 멸균면봉을 이용하여 MuellerHinton agar (Oxoid, UK) 평판배지에 고르게 도포한 다음 항생제 디스크를 dispenser (Oxoid, UK)로 접종하였다.
35±2℃에서 16∼18시간 배양 후 균 억제대의 크기를 측정하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012)에 근거하여 내성 여부를 판정하였다.
균 분리 및 동정은 채취한 시료를 Blood agar plate (아산제약, Korea)와 MacConkey agar (Oxoid, UK)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 의심되는 집락에 대해서는 순수 분리 후 VITECK 2 compac (BioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다.
PCR 반응은 2X TOPsimple DyeMix (aliquot)-HOT (Enzynomics, Korea)에 각각의 10 pmol primer 1 μL와 template DNA 1 μL를 넣은 후, 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 반응량이 20 μL 되게 하여 Tprofessional Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하여 수행하였다.
PCR 반응은 2X TOPsimple DyeMix (aliquot)-HOT (Enzynomics, Korea)에 각각의 10 pmol primer 1 μL와 template DNA 1 μL를 넣은 후, 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 반응량이 20 μL 되게 하여 Tprofessional Thermal Cycler (Biometra, Germany)를 이용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 이전 연구자들(Table 2)의 방법에 따랐으며, 초기 denaturation 후, denaturation, annealing, extension 과정을 반복하고 최종 extension을 실시하였다. 증폭된 산물은 1.
PCR 반응 조건은 이전 연구자들(Table 2)의 방법에 따랐으며, 초기 denaturation 후, denaturation, annealing, extension 과정을 반복하고 최종 extension을 실시하였다. 증폭된 산물은 1.2% agarose gel에서 100 V로 30분간 전기영동을 실시한 후 UV transilluminator (Biometra, Germany)를 이용하여 확인하였다.
대상 데이터
2009년 8월부터 2011년 12월까지 대구지역 동물병원 23개소를 대상으로 입원ㆍ치료중인 개(n=349)와 고양이(n=14)의 귀(n=263), 피부(n=57), 뇨(n=20), 생식기(n=11), 눈(n=6), 비강(n=2), 혈액(n=2) 및 유두(n=2)에서 그람음성균을 분리ㆍ동정하여, 본 실험실에 보관중인 E. coli 30주, P. aeruginosa 21주, Klebsiella (K) pneumoniae 5주, Enterobacter (E) cloacae, Citrobacter (C) koseri 및 Proteus (P) mirabilis 각각 2주, Morganella (M) morganii, Acinetobacter (A) baumannii 및 Serratia (S) marcescenns 각각 1주 등 총 65주를 실험에 사용하였다(Table 1).
35±2℃에서 16∼18시간 배양 후 균 억제대의 크기를 측정하여 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012)에 근거하여 내성 여부를 판정하였다. 항생제 감수성 시험을 위한 표준균주로 E. coli ATCC 25922를 사용하였다.
이론/모형
항생제 감수성 시험은 Bauer 등(1996)의 디스크 확산법을 이용하여 실시하였다. 사용한 항생제 디스크 (Oxoid, UK)는 ampicillin (AM), ticarcillin (TIC), ticarcillin/clavulanic acid (TIM), cephalothin (CF), cefepime (FEP), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), imipenem (IPM), aztreonam (ATM), gentamicin (GM), amikacin (AN), tetracycline (TC), ciprofloxacin (CIP), norfloxacin (NOR), streptomycin (SM), sulfamethoxazole/trimethoprim (SXT) 및 chloramphenicol (CM) 등 17종이었다.
공시균에 대한 genomic DNA 추출은 Mazel 등(2000)의 방법에 따라 boiling법으로 실시하였다. 즉 tryptic soy broth (Oxoid, UK)에 접종하여 37℃에서 18∼24시간 진탕 배양하여 얻은 균 부유액 1.
성능/효과
E. coli를 제외한 나머지 Enterobacteriaceae 14주의 경우 AM에 대하여는 64.3%의 높은 내성률을 나타내었나, SM, CF, STX, TIM, IPM, TC, CM, ATM 및 CTX에는 7.1∼38.5%의 낮은 내성률을 나타내었다.
그리고 AN, IPM, CM, TIM, CAZ 및 FEP에는 6.7∼20.0%의 비교적 낮은 내성률을 보였다.
Enterobacteriaceae 중 E. coli (30주)는 AM과 TC에 각각 56.7%와 53.3%로 높은 내성률을 나타내었고, CF, SXT, SM, GM, NOR, CIP, CIP 및 CTX에는 30.0∼43.3%의 내성률을 나타내었다.
Enterobacteriaceae 44주 중 AM에 내성인 26주를 대상으로 β-lactamase 유전자의 검출을 시도한 결과 TEM 유전자는 11주(42.3%)에서 검출되었으나, OXA, SHV 및 CTX 유전자는 한 주에서도 검출되지 않았다.
aeruginosa 21주 모두를 대상으로 약제 내성 관련 유전자의 검출을 실시한 결과는 Table 4와 같다. int I 1유전자는 공시균 57주 중 22주(38.6%)에서 검출되었으며, 이 중 E. coli에서는 18주에서 분리되어 검출률이 가장 높았고, 다음 P. aeruginosa는 2주에서, E. cloacae와 K. pneumoniae는 각각 1주에서 검출되었다. int I 2 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았다.
3%)에서 검출되었으나, OXA, SHV 및 CTX 유전자는 한 주에서도 검출되지 않았다. 특히 TEM 유전자는 E. coli에서는 9주에서 분리되어 검출률이 가장 높았고, E. cloacae와 M. morganii는 각각 1주에서 검출되었다. SM에 내성인 17주 중 aadA 유전자는 E.
morganii는 각각 1주에서 검출되었다. SM에 내성인 17주 중 aadA 유전자는 E. coli에서만 3주에서 검출되었으며, strA-strB 유전자는 E. coli에서는 10주에서, E. cloacae와 K. pneumoniae는 각각 1주에서 검출되었다. TC에 내성을 보인 19주 중 tetA 유전자는 3주(15.
pneumoniae는 각각 1주에서 검출되었다. TC에 내성을 보인 19주 중 tetA 유전자는 3주(15.8%), tetB 유전자는 13주(68.4%)에서 검출되었으며, 이들 유전자 모두는 E. coli에서 검출되었다. 한편 tetA 유전자를 가진 3주 중 2주는 tetB 유전자를 동시에 가지고 있었다.
coli에서만 1주에서 검출되었다. SXT에 내성인 17주 중 sul I 유전자는 5주(29.4%)에서 검출되었으며, 이중 E. coli에서는 3주에서, E. cloacae와 M. morganii는 각각 1주에서 검출되었고, sul II 유전자는 M. morganii에서만 1주에서 검출되었다.
coli는 CIP, CM, enrofloxacin, cefazolin (CZ), erythromycin, oxacillin, penicillin 및 lincomycine 등과 같은 항생제에 대하여도 높은 내성률이 보고되고 있어(Choi 등, 2010; Kim 등, 2004), 국내 개와 고양이에서 항생제 내성 문제는 심각한 수준에 도달하였음을 알 수 있었다. 이번 연구에서 TIM, AN, IPM, ATM, FEP 및 CAZ과 CTX 같은 항생제의 경우 30% 이하의 내성률을 나타내었다. 이러한 결과는 이전 연구자들의 성적과 유사하였으며(Choi 등, 2010; Yoo 등, 2002), 아직까지 이들 항생제는 세균 감염증의 치료제로서 효과가 있는 것으로 생각된다.
이번 연구에서도 이들 두 균주에서 TEM형 β-lactamase는 검출되지 않았다.
이번 연구에서 cmlA 유전자는 E. coli와 P. aeruginosa에서 각각 한 주에서 검출되었으며, 이들 두 균주는 strA/strB 유전자를 동시에 보유하고 있어 CM 내성 유전자는 다른 유전자와 공존함을 알 수 있었다(Sáenz 등, 2004).
이번 연구에서도 이들 유전자는 E. coli, E. cloacae 및 K. pneumoniae에서 검출되어 이들 유전자는 그람 음성균 사이에서 SM 내성 전달에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다(Sunde와 Norström,2005).
이번 연구에서 class 2 integron은 모든 균주에서 검출되지 않았지만, 개와 고양이 유래 대장균에서 class 2 integron의 존재는 이전 연구자들에 의해 보고가 되고 있다(Goldstein 등, 2001; Yu 등, 2003; Shaheen 등, 2010). 이번 연구에서 class 1 intgron이 검출된 공시균의 대부분이 4종류 이상의 약제에 다제내성을 보여 class 1 integron의 존재는 다제내성의 출현과 관련이 있음을 확인하였다(Goldstein 등, 2001; Shaheen 등, 2010).
coli는 개에서는 tetA, 고양이에서는 tetB 유전자가 많이 검출되었다고 보고하였다. 특히 이번 연구에서 tetA 유전자를 보유한 E. coli 2주는 tetB 유전자를 동시에 가지고 있어 tetA 유전자는 다른 유전자와 복합적으로 나타남을 알 수 있었다. 이번 연구에서 TC 내성 유전자는 E.
coli 2주는 tetB 유전자를 동시에 가지고 있어 tetA 유전자는 다른 유전자와 복합적으로 나타남을 알 수 있었다. 이번 연구에서 TC 내성 유전자는 E. coli와 K. pneumoniae에서만 검출이 되어 이들 두 균종이 TC에 대한 내성 유전자를 쉽게 획득함을 알 수 있었다.
Sulfonamides에 내성을 전달하는 sul I 유전자는 E. coli, E. cloacae, P. aeruginosa 및 M. morganii에서 검출되어 sul I 유전자 또한 그람 음성균 사이에서 널리 분포하고 있음을 알 수 있었다. 특히 M.
coli에서 sul I와 sul II 유전자는 동시에 존재함을 보고하였다. 이번 연구에서 그람 음성균에서 sul I 유전자는 sul II 유전자보다 많이 검출되었고, 이는 이전 연구자들의 결과와 일치하였다(Lanz 등, 2003; Maynard 등, 2003). 최근까지 Enterobacteriaceae에서 대부분의 약제 내성 관련 연구는 E.
한편 이번 연구에서 모든 항생제 내성 균주가 내성 유전자를 보유하는 것은 아닌 것으로 나타났다. 이는 이번 연구에서 사용된 내성 유전자 외 다른 종류의 내성 유전자가 균주에 존재 할 수 있으며, 또한 다른 항생제 내성 기전에 의한 내성 발현 가능성이 있어(Bryan, 1984), 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이번 연구 결과 개와 고양이에서 분리된 Enterobacteriaceae 중 E. coli에서 다제 내성균의 높은 출현과 다양한 항생제 내성 유전자의 출현은 동물병원에서 항생제의 광범위한 사용과 관련이 있다. 이는 임상에서 치료 효율의 저하 및 사람으로 내성균의 전파가 이루어질 수 있으므로 개와 고양이에서 항생제의 신중한 사용이 요구된다.
aeruginosa 21주에 대한 항생제 내성 유형 및 내성 유전자의 보유현황을 조사한 결과는 다음과 같았다. 항생제 감수성 시험 결과 Enterobacteriaceae는 공시균의 79.5%, P. aeruginosa는 공시균의 47.6%가 사용된 한 가지 이상의 약제에 내성을 나타내었다. Enterobacteriaceae 중 E.
6%가 사용된 한 가지 이상의 약제에 내성을 나타내었다. Enterobacteriaceae 중 E. coli (30주)는 AM (56.7%), TC (53.3%), CF, SM 및 SXT (각각 43.3%), GM 및 NOR (각각 40.0%)에 높은 내성을 보였고, 나머지 Enterobacteriaceae (14주)에서는 AM (64.3%)과 SM (42.9%)에 높은 내성을 나타내었다. 한편 P.
aeruginosa의 경우는 사용된 모든 약제에 15%미만의 낮은 내성률을 나타내었다. 한 종류 이상의 약제에 내성을 나타낸 Enterobacteriaceae 36주와 P. aeruginosa 21주 등 총 57주를 대상으로 약제 내성 관련 유전자의 검출을 실시한 결과 공시균의 38.6% (22주)가 int I 1 유전자를 가지고 있었다. TEM, strA-strB, sul I, sul II, aadA, tetA, tetB 및 cmlA 등 8종의 약제 내성 관련 유전자가 단독 또는 다른 유전자와 동시에 검출되었으나, int I2, SHV, CTX 및 OXA 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았다.
6% (22주)가 int I 1 유전자를 가지고 있었다. TEM, strA-strB, sul I, sul II, aadA, tetA, tetB 및 cmlA 등 8종의 약제 내성 관련 유전자가 단독 또는 다른 유전자와 동시에 검출되었으나, int I2, SHV, CTX 및 OXA 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았다. 금후 개와 고양이에서 항생제의 신중한 사용과 지속적인 모니터링이 요구된다.
반면 P. aeruginosa에서는 IPM, NOR, GM, TIC, TIM, FEP, AN, CIP에 4.8∼14.3%의 내성률을 나타내었고, CAZ과 ATM에는 전 균주가 감수성이었다.
aeruginosa의 경우 AM, CM, SM, SXT 및 TC에 대하여 CLSI (2012) 내성 기준이 명시되어 있지 않아 항생제 감수성 시험을 실시하지 아니하였다. 따라서 공시균 21주 모두를 대상으로 TEM, OXA, SHV, strA-strB, aadA, tetA 및 tetB 유전자의 검출을 실시한 결과 strA-strB 유전자는 4주(19.0%), sul I 유전자는 2주(9.5%), cmlA와 aadA 유전자는 각각 1주(4.8%)에서 검출되었으나, TEM, OXA, SHV, CTX 및 sul II 유전자는 모든 균주에서 검출되지 않았다.
후속연구
mirabilis의 경우 이번 연구뿐만 아니라 다른 연구에서도 이들 세균의 분리균주 수가 적고, 사용된 항생제의 종류가 이번 연구에서 사용된 것과 일치하지 않아 단순한 내성률의 비교는 어려웠으며. 향후 보다 많은 수의 균주를 이용한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
coli에 한정되어 있어 타 균종에서 이들 결과를 비교하기는 어려웠다. 향후 이에 관한 많은 조사가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
한편 이번 연구에서 모든 항생제 내성 균주가 내성 유전자를 보유하는 것은 아닌 것으로 나타났다. 이는 이번 연구에서 사용된 내성 유전자 외 다른 종류의 내성 유전자가 균주에 존재 할 수 있으며, 또한 다른 항생제 내성 기전에 의한 내성 발현 가능성이 있어(Bryan, 1984), 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이는 임상에서 치료 효율의 저하 및 사람으로 내성균의 전파가 이루어질 수 있으므로 개와 고양이에서 항생제의 신중한 사용이 요구된다. 아울러 개와 고양이 등 반려 동물 및 이들과 함께 생활하는 사람을 대상으로 항생제 내성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료 된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
항생제가 널리 사용되는 분야는?
항생제는 동물의 세균 감염증 치료에 널리 사용되고 있고 이로 인한 항생제 내성균의 출현이라는 필연적인 결과를 가져왔다. 특히 여러 가지 항생제에 내성을 갖는 다제내성균의 출현 및 증가로 인한 항생제 내성 문제는 전 세계적으로 중대한 공중보건학적 위협이 되고 있다(Normand 등, 2000).
항생제의 사용이 가져오는 필연적인 결과는?
항생제는 동물의 세균 감염증 치료에 널리 사용되고 있고 이로 인한 항생제 내성균의 출현이라는 필연적인 결과를 가져왔다. 특히 여러 가지 항생제에 내성을 갖는 다제내성균의 출현 및 증가로 인한 항생제 내성 문제는 전 세계적으로 중대한 공중보건학적 위협이 되고 있다(Normand 등, 2000).
항생제 내성균 중 다제내성균의 출현 및 증가로 인한 항생제 내성 문제는 어떤 위협을 야기시키는가?
항생제는 동물의 세균 감염증 치료에 널리 사용되고 있고 이로 인한 항생제 내성균의 출현이라는 필연적인 결과를 가져왔다. 특히 여러 가지 항생제에 내성을 갖는 다제내성균의 출현 및 증가로 인한 항생제 내성 문제는 전 세계적으로 중대한 공중보건학적 위협이 되고 있다(Normand 등, 2000).
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