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문제 정의
- , 2013). 본 연구에서는 동해안의 동해시, 서해안의 대천시, 그리고 남해안의 완도군에서 야생화들을 수집하여, 이들에 서식하고 있는 효모들을 분리하고, 이들을 분자생물학적 방법으로 동정하여, 그 결과를 보고하는 바이다.
- 식물체에 있는 효모의 다양성을 연구하기 위해 꽃, 과일 및 나무 껍질 혹은 수분에 관여하는 곤충들을 수집하여 이들로부터 효모를 분리 동정하는 연구들이 국내외에서 간헐적으로 수행되어 왔다. 한반도에 자생하고 있는 효모들을 포괄적으로 탐색 조사하여 발굴된 효모들을 생물자원화하기 위한 목적으로, 국내 여러 지역에서 수집한 야생화를 대상으로 이들에 서식하고 있는 다양한 효모들의 분포를 탐색하고 있다. 이러한 연구의 일환으로서, 대전 일부 지역의 하천과 야산 등지에서 수집한 야생화들로부터 다양한 효모들을 분리하고 이들을 동정하여 보고한 바 있으며(Min et al.
제안 방법
- 1, Table 1, Table 2, Table 3). 3 곳의 채집 장소로부터 적어도 2곳 이상에서 분리된 9종의 효모들에 대해 PCR로 증폭하여 결정한 D1/D2 염기서열로 MEGA 5.1 프로그램을 이용하여 계통수를 작성하였다(Fig. 1). 이들 중 H.
- , 2013). PCR 반응이 종료된 후, 1.5% (w/v) 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 증폭된 DNA들을 확인하고, PCR 산물을 QIAquick gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 다시 회수하였다. 회수한 D1/D2 DNA의 염기서열은 코스모젠텍사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 Sanger의 방법에 의해 LN1과 LN4를 각각 프라이머로 사용하여 반응시킨 후, ABI 3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- , 2013). YPD 한천배지에서 균락을 형성한 효모들을 접종 루프를 사용하여 각각 YPD 한천배지에 획선배양하여 순수배양체를 얻었다. 이들 효모를 동정하기 위해 26S rDNA의 D1/D2 영역을 PCR (polymerase chain reaction) 반응으로 증폭하였다.
- 국내 자연환경으로부터 다양한 효모들을 분리, 동정하고 나아가 이들로부터 유용물질을 생산하는 효모자원을 확보하기 위한 연구의 일환으로 우리나라 동해안, 서해안, 남해안에 서식하는 야생화들을 채집하여 이들로부터 효모들을 분리한 후 분자생물학적 방법으로 동정하였다. 동해시에서 수집한 야생화로부터는 Candida silvae 등을 포함한 15종에 속하는 27균주의 효모들을 분리하였다.
대상 데이터
- DNA를 증폭시키기 위한 프라이머는 LN1 (5' GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG 3')과 NL4 (5' GGT CCG TGT TTC AAG ACG G 3')를 사용하였다 (Min et al., 2013).
- 동해안의 동해시, 서해안의 대천시, 남해안의 완도에서 2013년 봄에 개화한 꽃들을 50 ml 크기의 멸균튜브에 각각 채취하였다. 여기에 멸균수 5 ml을 넣고 1시간 동안 진탕하여 현탁액을 제조하였다.
- 본 연구에서 동해안, 서해안, 그리고 남해안의 3개 지역의 야생화로부터 총 45종의 효모들을 분리하였다. 이들 중 4종의 효모들은 3개 지역에서 모두, 그리고 5종의 효모들은 적어도 2개 지역에서 함께 발견되었다.
데이터처리
- 회수한 D1/D2 DNA의 염기서열은 코스모젠텍사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 Sanger의 방법에 의해 LN1과 LN4를 각각 프라이머로 사용하여 반응시킨 후, ABI 3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석된 D1/D2 염기서열은 Clustal X2 프로그램을 사용하여 정렬한 후 (Thompson et al., 1997), NCBI의 BLAST를 이용하여 데이터베이스에 축적되어 있는 효모들과의 서열간의 상동성을 비교분석함으로써 동정하였다(Altschul et al., 1997). 그 결과는 Table 1, Table 2, 그리고 Table 3에 정리하였다.
이론/모형
- Only the yeasts which were isolated from at least more than 2 different collection sites are shown in this phylogenetic tree among the total 45 yeast species isolated. The tree was constructed using MEGA5.1 software with the neighbor-joining method. The GenBank accession numbers for different yeast isolates are shown in brackets.
- YPD 한천배지에서 균락을 형성한 효모들을 접종 루프를 사용하여 각각 YPD 한천배지에 획선배양하여 순수배양체를 얻었다. 이들 효모를 동정하기 위해 26S rDNA의 D1/D2 영역을 PCR (polymerase chain reaction) 반응으로 증폭하였다. 이 때 PCR을 수행하기 위한 주형 DNA는 효모의 염색체 DNA를 분리하는 대신, 효모 균락을 이쑤시개로 소량 취하여 반응에 사용하였다.
- 5% (w/v) 아가로스 젤 전기영동을 수행하여 증폭된 DNA들을 확인하고, PCR 산물을 QIAquick gel extraction kit (Qiagen)를 사용하여 다시 회수하였다. 회수한 D1/D2 DNA의 염기서열은 코스모젠텍사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 Sanger의 방법에 의해 LN1과 LN4를 각각 프라이머로 사용하여 반응시킨 후, ABI 3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 분석된 D1/D2 염기서열은 Clustal X2 프로그램을 사용하여 정렬한 후 (Thompson et al.
성능/효과
- koreensis 3종이 Astomycota (phylum)에 속하였으며, 나머지 6종은 Basidomycota (phylum)에 속하였다. Basidomycota문에 속하는 이들 6종 중 C. aureus, C. laurentii, C. flavus는 Tremellales목에, R. fluviale와 R. mucilaginosa는 Sporidiobolales목에 그리고 P. rugulosa는 Ustilaginales목에 속하고 있음을 보여 준다(Fig. 1).
- 이들 중 4종의 효모들은 3개 지역에서 모두, 그리고 5종의 효모들은 적어도 2개 지역에서 함께 발견되었다. 기타 23종의 효모들은 특정한 시료 수집 장소에서만 발견되는 것으로 보아, 각 지역은 독특한 효모 다양성을 갖고 있을 것으로 추측할 수 있다.
- 동해안의 동해시에서 수집한 27점의 야생화들로부터 얻은 현탁액을 도말하여 얻은 효모 균락들을 분리하여 26S rDNA의 D1/D2 지역 염기서열의 비교를 통해 이들의 동정을 수행한 결과, 전체적으로 15종에 속하는 효모들 27균주를 얻었다(Table 1). 유사한 방법으로 서해안의 대천시 해수욕장 주위에서 수집한 15종의 야생화들로부터는, 총 17종에 속하는 효모들 34 균주가 분리 동정되었다(Table 2).
- 또한 완도군 대문리에서 수집한 야생화 12점을 분석한 결과, 13종에 속하는 효모 22 균주들이 분리 동정되었다(Table 3). 따라서 동해안의 동해시, 서해안의 대천시, 남해안의 완도군에서 모두 45종 83균주의 효모들을 분리 동정하였다. 이들 45종의 효모들 중 Cryptococcus laurentii, Metschnikowia koreensis, Pseudozyma rugulosa, 그리고 Rhodotorula mucilaginosa 등 4종의 효모는 야생화를 수집한 3곳에서 모두 분리되었다.
- 이들 45종의 효모들 중 Cryptococcus laurentii, Metschnikowia koreensis, Pseudozyma rugulosa, 그리고 Rhodotorula mucilaginosa 등 4종의 효모는 야생화를 수집한 3곳에서 모두 분리되었다. 또한 Cryptococcus aureus, Cryptococcus flavus, Hanseniaspora uvarum, Pichia guilliermondii, 그리고 Rhodosporidium fluviale 등 5종의 효모는 야생화를 수집한 2곳의 시료 수집 장소에서 분리되었다. 이들의 염기서열들을 BLAST를 이용하여 분석하였을 때, 동해안과 서해안 2곳의 야생화 채취지역에서 7개의 효모 분리균주로서 발견된 C.
- 서해안의 대천시 해수욕장 주위 야생화에서는 Bulleromyces albus를 비롯한 17종 34균주가 분리, 동정되었다. 또한 남해안의 완도군 대문리 주위의 야생화들로부터는 Cryptococcus flavus를 포함하여 13종에 속하는 효모 22 균주들이 분리 동정되었다. 전체적으로 우리나라 동해안, 서해안, 남해안의 야생화로부터 모두 45종에 속하는 효모들 83균주를 분리, 동정하였다.
- 유사한 방법으로 서해안의 대천시 해수욕장 주위에서 수집한 15종의 야생화들로부터는, 총 17종에 속하는 효모들 34 균주가 분리 동정되었다(Table 2). 또한 완도군 대문리에서 수집한 야생화 12점을 분석한 결과, 13종에 속하는 효모 22 균주들이 분리 동정되었다(Table 3). 따라서 동해안의 동해시, 서해안의 대천시, 남해안의 완도군에서 모두 45종 83균주의 효모들을 분리 동정하였다.
- 동해안의 동해시에서 수집한 27점의 야생화들로부터 얻은 현탁액을 도말하여 얻은 효모 균락들을 분리하여 26S rDNA의 D1/D2 지역 염기서열의 비교를 통해 이들의 동정을 수행한 결과, 전체적으로 15종에 속하는 효모들 27균주를 얻었다(Table 1). 유사한 방법으로 서해안의 대천시 해수욕장 주위에서 수집한 15종의 야생화들로부터는, 총 17종에 속하는 효모들 34 균주가 분리 동정되었다(Table 2). 또한 완도군 대문리에서 수집한 야생화 12점을 분석한 결과, 13종에 속하는 효모 22 균주들이 분리 동정되었다(Table 3).
- 따라서 동해안의 동해시, 서해안의 대천시, 남해안의 완도군에서 모두 45종 83균주의 효모들을 분리 동정하였다. 이들 45종의 효모들 중 Cryptococcus laurentii, Metschnikowia koreensis, Pseudozyma rugulosa, 그리고 Rhodotorula mucilaginosa 등 4종의 효모는 야생화를 수집한 3곳에서 모두 분리되었다. 또한 Cryptococcus aureus, Cryptococcus flavus, Hanseniaspora uvarum, Pichia guilliermondii, 그리고 Rhodosporidium fluviale 등 5종의 효모는 야생화를 수집한 2곳의 시료 수집 장소에서 분리되었다.
- 본 연구에서 동해안, 서해안, 그리고 남해안의 3개 지역의 야생화로부터 총 45종의 효모들을 분리하였다. 이들 중 4종의 효모들은 3개 지역에서 모두, 그리고 5종의 효모들은 적어도 2개 지역에서 함께 발견되었다. 기타 23종의 효모들은 특정한 시료 수집 장소에서만 발견되는 것으로 보아, 각 지역은 독특한 효모 다양성을 갖고 있을 것으로 추측할 수 있다.
- 또한 Cryptococcus aureus, Cryptococcus flavus, Hanseniaspora uvarum, Pichia guilliermondii, 그리고 Rhodosporidium fluviale 등 5종의 효모는 야생화를 수집한 2곳의 시료 수집 장소에서 분리되었다. 이들의 염기서열들을 BLAST를 이용하여 분석하였을 때, 동해안과 서해안 2곳의 야생화 채취지역에서 7개의 효모 분리균주로서 발견된 C. aureus와 동해안, 서해안, 남해안 3곳에서 14개의 효모 분리균주로서 발견된 P. rugulosa는 채집 장소에 상관없이 동일한 GenBank의 accession number를 갖고 있었다. 하지만 P.
- aureus가 3곳의 시료 수집 지역에서 모두 발견되었다고 보고된 바 있다. 이번 연구에서도 C. aureus가 동해안과 서해안 2곳에서 발견되는 것으로 보아(Table 1, Table 2), C. aureus를 Min 등(2013)이 야생화로부터 분리 동정하여 보고하기 이전에 꽃에서 분리되었다는 보고는 없지만, 우리나라 야생화에서 흔하게 발견되는 효모로 사료된다. 이외에도 Min 등(2013)이 백암산에서 분리하였다고 보고한 C.
- aureus를 Min 등(2013)이 야생화로부터 분리 동정하여 보고하기 이전에 꽃에서 분리되었다는 보고는 없지만, 우리나라 야생화에서 흔하게 발견되는 효모로 사료된다. 이외에도 Min 등(2013)이 백암산에서 분리하였다고 보고한 C. laurentii는 본 연구에서 3곳의 시료 수집 지역에서 모두 발견되었으며, 계족산과 백암산 2곳에서 분리되었었던 C. flavus는 이번 연구에서 동해안과 남해안 2곳에서 분리되었다(Table 1, Table 3). 전체적으로 Cryptococcus 속은 토양에서 흔히 발견되며 인체에 해가 없다고 알려져 있지만, 본 연구에서 분리된 C.
- 또한 남해안의 완도군 대문리 주위의 야생화들로부터는 Cryptococcus flavus를 포함하여 13종에 속하는 효모 22 균주들이 분리 동정되었다. 전체적으로 우리나라 동해안, 서해안, 남해안의 야생화로부터 모두 45종에 속하는 효모들 83균주를 분리, 동정하였다.
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