Objectives : Hibisci Flos has long been used for inflammatory diseases in traditional Korean medicine. However, little scientific investigation has been carried out. The aim of the present study is to investigate the effect of Hibisci Flos water extract (HF) on inflammatory cytokines production in R...
Objectives : Hibisci Flos has long been used for inflammatory diseases in traditional Korean medicine. However, little scientific investigation has been carried out. The aim of the present study is to investigate the effect of Hibisci Flos water extract (HF) on inflammatory cytokines production in Raw 264.7 cells stimulated by lipopolysaccaride (LPS). Method : HF was prepared by extracting with boiling water for 2 hours. We observed the cell viability of mouse macrophage Raw 264.7, the production of nitric oxide (NO) and the inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-4, IL-5, IL-10, IL-15, tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interferon-gamma (IFN-${\gamma}$), vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) in Raw 264.7 cells stimulated by LPS. Result : The MTT assay was carried out to check the cellular toxicity of HF. No significant toxicity was observed in the experiment. HF significantly inhibited the increase of NO in the macrophages induced by LPS after 24 hour treatment. HF significantly inhibited the production of IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, VEGF, GM-CSF and M-CSF in the Raw 264.7 cells induced by LPS in the concentration of $25{\mu}g/mL$ or higher. Conclusion : These results suggest that HF might have regulatory effects on LPS-induced inflammatory cytokine production, which might explain its beneficial effect in the treatment of inflammatory disease.
Objectives : Hibisci Flos has long been used for inflammatory diseases in traditional Korean medicine. However, little scientific investigation has been carried out. The aim of the present study is to investigate the effect of Hibisci Flos water extract (HF) on inflammatory cytokines production in Raw 264.7 cells stimulated by lipopolysaccaride (LPS). Method : HF was prepared by extracting with boiling water for 2 hours. We observed the cell viability of mouse macrophage Raw 264.7, the production of nitric oxide (NO) and the inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-4, IL-5, IL-10, IL-15, tumor necrosis factor-${\alpha}$ (TNF-${\alpha}$), interferon-gamma (IFN-${\gamma}$), vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) in Raw 264.7 cells stimulated by LPS. Result : The MTT assay was carried out to check the cellular toxicity of HF. No significant toxicity was observed in the experiment. HF significantly inhibited the increase of NO in the macrophages induced by LPS after 24 hour treatment. HF significantly inhibited the production of IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-${\alpha}$, IFN-${\gamma}$, VEGF, GM-CSF and M-CSF in the Raw 264.7 cells induced by LPS in the concentration of $25{\mu}g/mL$ or higher. Conclusion : These results suggest that HF might have regulatory effects on LPS-induced inflammatory cytokine production, which might explain its beneficial effect in the treatment of inflammatory disease.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 木槿花를 열수 추출하여 제조한 시료(HF)를 대상으로 마우스 대식세포 Raw 264.7 cells의 cell viability와 LPS로 유발된 마우스 대식세포 Raw 264.7 cells의 NO 생성증가, 그리고 IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, IFN-γ, VEGF, GM-CSF, M-CSF의 생성을 측정하여 木槿花의 항염증 효과를 살펴보고자 하였다.
이에 저자는 木槿花가 한의학에서 肺熱咳嗽 등에 사용된 것으로 보아 염증과 면역기능과 관련이 있을 것으로 사료되어 木槿花를 열수 추출하여 제조한 시료(HF=Hibisci Flos water extract)를 대상으로 LPS로 유발된 마우스 대식세포 Raw 264.7 cells의 NO 생성증가, 그리고 IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, IFN-γ, VEGF, GM-CSF, M-CSF의 cytokine 생성증가에 미치는 영향을 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
96 well plate에 1×105 cells/mL의 세포를 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 LPS를 단독처리(1 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(25, 50, 100 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 처리하고 24 시간 동안 배양하였다.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 GM-CSF 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 GM-CSF 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IFN-γ 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-10 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-10 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-15 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-15 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-4 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-4 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-5 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-5 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 GM-CSF 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 GM-CSF 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 NO 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 TNF-α 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 VEGF 생성증가에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 VEGF 생성증가를 유의하게(P<0.
HF가 대식세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 비교하였다. HF를 24 시간 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 유의한 감소는 없었다(Fig.
의 실험방법을 참조하여 다음과 같이 시행하였다. LPS를 단독처리(1 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료(0, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL)와 함께 배지에 담아 각 well에 처리하고 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 세포배양 상등액 100 ㎕을 채취하여 여기에 그리스 시약 100 ㎕을 혼합하여 15분 동안 반응시킨 후 microplate reader(Bio-Rad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 nitric oxide 생성은 다음 공식으로 계산하였다.
木槿花(Hibisci Flos)의 항염효능을 연구하고자 HF를 대상으로 마우스 대식세포 Raw 264.7 cells의 cell viability와 LPS로 유발된 Raw 264.7 cells의 NO 생성증가, 그리고 IL-4 등의 cytokines 생성증가에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론를 얻었다.
96 well plate에 1×104 cells/well의 세포를 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다. 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 (0, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL)를 각 well에 처리하고 24 시간 동안 배양 하였다. 배양이 끝난 후 PBS에 녹인 1 ㎎/mL MTT (Sigma, USA)를 100 ㎕씩 각 well에 처리하여 알루미늄호일로 차광시킨 후 2 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다.
배양이 끝나면 wash buffer로 3회 세척한 뒤 각 well에 120 ㎕의 reading buffer를 분주하고 상온에서 300~500 rpm의 조건으로 5 분간 진동배양(shaking)한 후 bio-plex array reader (Bio-Plex 200)을 이용, 측정 코자 하는 cytokine의 양을 조사·비교하였다.
준비된 시료가 Raw 264.7 cells에 유발시키는 세포독성을 측정하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 세포를 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다.
대상 데이터
본 실험을 위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1×PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), bio-plex cytokine assay kit (Bio-Rad, USA), procarta cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이 사용 되었다. 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Nuaire, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), air compressor (Tamiya, Japan), homogenizer (Omni, USA), research microscope (Becton dickinson, USA), refrigerated centrifuge (Hanil, Korea), fume hood (Hanil, Korea), clean bench (Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader 680 (Bio-Rad, USA), vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea), water bath (Intron Biotech, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea), bio-plex 200 (Bio-Rad, USA) 등이다.
본 실험을 위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1×PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), bio-plex cytokine assay kit (Bio-Rad, USA), procarta cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이 사용 되었다.
실험에 사용된 대식세포는 mouse macrophage (Raw 264.7 cells)이며 한국 세포주 은행 (KCLB, Korea)에서 구입하였다.
실험에 사용된 木槿花(Hibisci Flos)는 경기도 성남시 남한산성 일대에 식재된 무궁화 Hibiscus syriacus L.의 꽃을 2009년 4월에 채취하였으며, 모든 약재는 실험 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 분석하여 p-value가 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
1. 木槿花 물추출물의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 를 수행한 결과 木槿花 물추출물을 농도별로 처리했을 때 대식세포에 유의한 독성을 유발하지 않았다.
2. 木槿花 물추출물은 24시간의 배양에서 LPS로 유발된 대식세포의 NO 생성증가를 25 ㎍/mL 이상의 농도에서 유의하게 억제하였다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식 세포의 IL-10 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-10 생성증가에 대해 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 GM-CSF 생성증가에 미치는 영향을 비교 하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 GM-CSF 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IFN-γ 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IFN-γ 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-15 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-15 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-4 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-4 생성증가에 대해 유의하게 억제시켰다.
그리고 IL-5의 이러한 기능은 호산구에게만 특이적으로 작용한다고 알려져 있다 22). HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 IL-5 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-5 생성증가에 대해 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 M-CSF 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서서 LPS에 의한 M-CSF 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 NO 생성증가에 미치는 영향을 비교하기 위해 LPS와 함께 24시간동안 배양한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의하게 억제시켰다. 이와 같이 HF가 LPS에 의해 유발된 대식세포의 NO 생성증가를 억제함은 HF가 NO 과잉에 의한 염증악화를 억제할 수 있는 효능이 있음을 의미한다.
HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 TNF-α 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍ /mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 TNF-α 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
. HF가 LPS로 유발된 마우스 대식세포의 VEGF 생성증가에 미치는 영향을 비교하기위해 HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서서 LPS에 의한 VEGF 생성증가를 유의하게 억제시켰다.
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 GM-CSF 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 10).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IFN-γ 생 성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 8).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-10 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 5).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-15 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 6).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-4 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 3).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 IL-5 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 4).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 M-CSF 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 11).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 NO 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 2).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 TNF-α 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 7).
HF를 24 시간동안 처리한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 LPS에 의한 VEGF 생성증가를 유의하게(P<0.05) 억제하였다(Fig. 9).
본 연구에서는 한국 세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 분양받은 마우스 대식세포 Raw 264.7 cells에 HF를 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리한 뒤에 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 세포의 증식을 MTT assay를 이용하여 확인한 결과 25 ㎍/mL 이상의 농도에서 normal군에 비하여 HF가 Raw 264.7 cells에 유의한 세포증식률 감소를 일으키지 않았으며 이는 HF가 대식세포에 유의한 세포독성을 유발하지 않는다는 것으로 볼 수 있다.
이상의 결과, 木槿花 물 추출물은 LPS로 유발된 대식세포의 NO 증가 및 IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, IFN-γ, VEGF, GM-CSF, M-CSF의 생성증가를 억제하는 것으로 보아 유의한 항염효능을 가지고 있는 것으로 생각된다.
이상의 결과, 木槿花 물 추출물은 LPS로 유발된 대식세포의 NO 증가 및 IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, IFN-γ, VEGF, GM-CSF, M-CSF의 생성증가를 억제하는 것으로 보아 항염효능을 가지고 있는 것으로 생각된다.
후속연구
이상의 결과, 木槿花 물 추출물은 LPS로 유발된 대식세포의 NO 증가 및 IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-α, IFN-γ, VEGF, GM-CSF, M-CSF의 생성증가를 억제하는 것으로 보아 유의한 항염효능을 가지고 있는 것으로 생각된다. 앞으로 木槿花 추출물을 이용한 대식세포 연관 면역질환 치료제로의 개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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