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문제 정의
- 또한 위의 결과를 통하여 구성약재의 유효한 조성 비율을 선정하여 ovalbumin으로 유도한 알레르기성 기관지 천식 마우스 모델에서의 기도과민반응과 폐 조직의 조직학적인 변화를 관찰하고, TNF-α와 IL-5의 발현 정도를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는, OMC-2010 구성약재들 중 면역세포 조절능력에 유효한 효과를 보인 숙지황, 반하, 오미자를 사용해 배합비율을 다르게 조성하여 기존에 효과를 보였던 TNF-α와 IL-5의 발현을 조사하였다.
제안 방법
- 2 ml에 혼합하여 복강내로 주사하였다. 1차 전신 감작 후, 15일째에 동일한 방법으로 2차 감작을 통해 면역 boosting을 유도 한 후, A를 생리식염수로 농도별로 희석하여 18일부터 24일까지 일주일간 경구 투여하였다. 또한 5% OVA in PBS를 22, 23, 24일에 3일 연속 30분간 분무하여 알레르기성 기관지 천식을 유도하였다.
- 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 동일한 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 A, B, C, D를 처리하였다. A, B, C, D를 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다. MTT-formazan 생성물은 DMSO를 첨가함으로써 용해했다.
- OMC-2010의 구성약재 중 숙지황, 반하, 오미자를 배합비율을 다르게 한 에탄올로 추출물의 in vitro와 in vivo에서 면역조절 능력 및 기관지 천식 마우스 모델에서의 효과를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- Spleen cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)용액을 이용하여 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 동일한 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 A, B, C, D를 처리하였다.
- 각 primer는 Applied Bio systems (CA, USA)에서 구입하였다. TNF-alpha는 Mm00443258_m1 #4331182를 사용하였으며, IL-5는 Mm00439646_m1 #4331182를 사용하여 StepOne Software v2.2.2 Applied Bio systems (CA, USA)로 분석하였다.
- 4 ㎛ nylon cell strainer로 여과하였다. spleen 여과물을 1200rpm에서 10분간 원심분리 한 후 증류수를 이용하여 적혈구를 파괴한 뒤, splenocyte를 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다.
- Spleen cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)용액을 이용하여 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 동일한 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 A, B, C, D를 처리하였다. A, B, C, D를 처리하여 48시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
- 이는 추출물 A가 기도의 평활근 증식을 억제하여 기도 두께를 감소했을 가능성이 있고, 또한 호산구나 염증성세포의 기관지로 유입, 침윤을 막음으로서 기도과민성을 줄일 수 있었을 것으로 추측 할 수 있었다. 그리하여 추출물 A가 이에 미치는 효과를 확인하기 위하여 폐조직의 조직학적 검사를 통하여 기도벽의 두께와 염증세포의 침윤정도, 기관지의 수축 정도를 확인하였다. 그 결과, 추출물 A는 0.
- 기관지 천식 유발 마우스의 폐조직에 A가 미치는 효과를 확인하기 위하여 OVA 마지막 분무 24시간 후에 폐조직을 H&E 염색해 관찰하였다 (Fig. 6).
- 1차 전신 감작 후, 15일째에 동일한 방법으로 2차 감작을 통해 면역 boosting을 유도 한 후, A를 생리식염수로 농도별로 희석하여 18일부터 24일까지 일주일간 경구 투여하였다. 또한 5% OVA in PBS를 22, 23, 24일에 3일 연속 30분간 분무하여 알레르기성 기관지 천식을 유도하였다. 마지막 OVA을 분무한 뒤, 24시간 후에 마우스를 분석하였다 (Fig.
- 그리고 침전물에 DEPC treated water를 15 ul씩 넣어 RNA를 용해시키고 fluorometer를 이용하여 정량한 뒤 동량의 mRNA를 cDNA로 합성하여 실험에 사용하였다. 또한 기관지 천식을 유도한 후 적출한 폐조직은 TRI-zol 시약을 200 ul 넣고 homogenizer를 이용하여 조직이 용해될 때까지 분쇄한 다음 TRI-zol 시약의 total volume이 1 ml이 될 수 있도록 800 ul의 시약을 더 첨가한 후 splenocyte RNA 추출방법과 동일한 방법으로 mRNA를 추출하였다.
- 마우스 비장세포에서 TNF-α와 IL-5의 발현에 유의성있는 효과를 보인 A (1:1:1)를 기관지 천식 모델 적용하여 알레르기성 과민반응에 의해 나타나는 기도과민성의 변화를 확인하기 위하여 정상군 (Normal)과 천식유발군 (ovalbumin, OVA) 및 실험군 (A 0.05, 0.1, 0.5 g/kg 처리군)에 methacholine을 농도별로 노출시켜 그에 대한 기도저항값(Penh)을 조사하였다 (Fig. 5).
- 마우스에서 폐조직을 떼어내어 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀으로 embedding 한 후 4 ㎛ 두께로 조직을 잘라 슬라이드에 붙인 뒤 Hematoxylin/eosin (H&E) 염색하여 ×200 배율로 관찰하였다.
- 또한 5% OVA in PBS를 22, 23, 24일에 3일 연속 30분간 분무하여 알레르기성 기관지 천식을 유도하였다. 마지막 OVA을 분무한 뒤, 24시간 후에 마우스를 분석하였다 (Fig. 1).
- 실험방법은 Peebles RS Jr12) 의 방법을 약간 변형하였다. 마지막 분무 24시간 후, methacholine (Sigma, USA)을 PBS로 희석하여 2.5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 및 50 mg/ml의 농도로 각각 5분간 분무하여 노출시킨 후 동물용 체적 변동 측정기를 사용하여 Penh (enhanced pause) 값을 5초 간격으로 3분간 측정하여 평균을 대표값으로 취하였다.
- Total RNA는 TRI-zol (invitrogen, USA) 시약을 이용하여 추출하였다. 먼저 배양한 세포에 A, B, C, D를 전 처리하고 LPS로 자극한 후 48시간 배양한 세포를 PBS로 2회 씻은 다음 PBS 1 ml씩 가해 세포를 포집하였다. 포집된 세포를 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물에 TRI-zol 용액을 1 ml 가하여 세포를 용해시킨 후 100 ul의 chloroform 용액을 넣어 고르게 잘 섞어준 뒤 15,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심 분리하여 맨 위의 상층액을 취하였다.
- 본 연구에서는 OMC-2010의 구성약재 중 숙지황, 반하, 오미자를 배합비율을 다르게 하여 에탄올로 추출하고, in vitro 상에서 TNF-α와 IL-5의 발현을 분석해 유의한 비율조성을 선택하여, 그 효과를 in vivo 상에서 기관지 천식 마우스 모델에 적용하여 조사하였다.
- 비장세포 및 폐조직의 mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA를 가지고 Taqman 방식으로 염증성 활성 물질을 측정 하였다.
- 비장세포에서 TNF-alpha와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제할 수 있었던 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 배합비율 A의 기관지 천식모델에서의 효과를 확인하기 위하여, 100 µg의 OVA과 1 mg Alum을 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 0.2 ml에 혼합하여 복강내로 주사하였다.
- 비장세포의 활성화로 인하여 발현된 사이토카인을 유의하게 억제할 수 있었던 숙지황, 반하, 오미자 배합비율 A의 기관지 천식에서의 사이토카인 억제효과를 확인하기 위하여 기관지 천식 유발 마우스의 폐조직에서 면역작용에 관여하는 염증성 세포들로 인하여 발현된 전염증성 사이토카인 TNF-alpha와 Th2 타입의 사이토카인인 IL-5의 농도를 조사하였다. 항원을 인지한 면역세포 및 T 림프구는 림프절에서 활성화하여 염증조직으로 이동하게 된다.
- 숙지황, 반하, 오미자 배합비율별 조성인 A (1:1:1), B (2:1:1), C (1:2:1), D (1:1:2)가 마우스 비장 세포의 대사 및 독성에 영향을 미쳐서 사이토카인 조절에 관여할 수 있음을 배제하기 위하여, 비장 세포에서 A, B, C, D를 48시간동안 처리하여 세포 생존율을 관찰하였다. 그 결과, 아래 Fig.
- 숙지황, 반하, 오미자 배합비율별 조성인 A, B, C, D가 마우스 비장세포에서 LPS로 유도한 IL-5 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 A, B, C, D를 마우스 비장세포에 1시간 동안 전처리한 후, LPS (1 µg/ml)를 48시간 동안 처리하여 비장 세포의 사이토카인 분비를 촉진시켰다.
- 숙지황, 반하, 오미자 배합비율별 조성인 A, B, C, D가 마우스 비장세포에서 LPS로 유도한 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해, A, B, C, D를 마우스 비장세포에 1시간 동안 전처리한 후, LPS (1 µg/ml)를 48시간 동안 처리하여 비장 세포의 활성화 및 사이토카인 분비를 촉진시켜 TNF-alpha의 발현정도를 확인하였다.
- 숙지황, 반하, 오미자를 (A) 1:1:1; (B) 2:1:1; (C) 1:2:1; (D) 1:1:2 비율로 섞은 처방을 각각 A, B, C, D로 분류하였으며, 각 처방에 50배의 70% 에탄올 용액을 가하여 37℃ 항온수조에서 24시간 동안 추출하였다. 추출 후 에탄올층(상등액)을 회전감압농축기(EYELA, RikakikiCo.
- 항원을 인지한 면역세포 및 T 림프구는 림프절에서 활성화하여 염증조직으로 이동하게 된다. 알레르기성 항원인 OVA에 특이적으로 작용한 면역세포들은 다수가 염증부위인 폐조직으로 이동하여 염증작용 및 Th-2 반응을 통하여 사이토카인을 생산하기 때문에 폐조직 내에서 발현되는 사이토카인양을 조사하였다13-14). 폐조직의 mRNA 레벨에서 사이토카인 변화정도를 확인한 결과, TNF-alpha와 IL-5 수준 모두 천식유발군에서 정상군에 비하여 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험군인 A 0.
- 이를 통하여 OMC-2010 추출물이 면역 질환 및 천식 등에 유효할 것으로 추정할 수 있었으며, 다음 연구에서 실제로 사이토카인 억제 역할을 하는 약재가 무엇인지 증명하기 위하여, OMC-2010 구성물인 숙지황(Rehmannia glutinosa, RG), 반하(Pinellia ternata, PT), 진피(Citrus unshiu Markovich, CUM), 감초(Glycyrrhiza uralensis, GU), 길경(Platycodon grandiflorum, PG) 및 오미자(Schisandra chinensis, SC)를 물과 에탄올을 통해 추출한 다음 비장세포를 분리하여 기존에 효과를 보였던 TNF-α와 IL-5의 발현을 조사하였다.
- 숙지황, 반하, 오미자를 (A) 1:1:1; (B) 2:1:1; (C) 1:2:1; (D) 1:1:2 비율로 섞은 처방을 각각 A, B, C, D로 분류하였으며, 각 처방에 50배의 70% 에탄올 용액을 가하여 37℃ 항온수조에서 24시간 동안 추출하였다. 추출 후 에탄올층(상등액)을 회전감압농축기(EYELA, RikakikiCo., Tokyo, Japan)로 농축한 후, 생리식염수 녹여 stock solution을 제조하였다. 제조된 stock solution은 －20℃에 보관하면서 분석방법에 적합하도록 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
- 그 후 -20℃에 보관된 2-propanol과 1:1로 희석하여 잘 섞어준 뒤 15,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 남은 침전물에 80% ethanol 500 ul를 넣어 15,000 rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하여 침전물을 건조시켰다. 그리고 침전물에 DEPC treated water를 15 ul씩 넣어 RNA를 용해시키고 fluorometer를 이용하여 정량한 뒤 동량의 mRNA를 cDNA로 합성하여 실험에 사용하였다. 또한 기관지 천식을 유도한 후 적출한 폐조직은 TRI-zol 시약을 200 ul 넣고 homogenizer를 이용하여 조직이 용해될 때까지 분쇄한 다음 TRI-zol 시약의 total volume이 1 ml이 될 수 있도록 800 ul의 시약을 더 첨가한 후 splenocyte RNA 추출방법과 동일한 방법으로 mRNA를 추출하였다.
- 본 실험에 사용된 시약으로 LPS (lipopolysaccharides), 난알부민 (OVA, chicken egg ovalbumin, Grade Ⅴ), Alum (aluminum hydroxide)은 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 모든 실험은 원광대학교에서 정해놓은 동물 관리 규정에 따라 수행되었다. 본 실험에 사용된 실험동물은 C57BL/6 Mouse (15-20 g, 6주령, female)는 ㈜오리엔트바이오(성남, 경기도, 대한민국)에서 공급받아 사용하였다. 실험동물은 원광대학교 한의과대학 동물 사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도: 50~60%, 명암: 12시간 주기)하에서 일반 고형사료(㈜오리엔트바이오, 성남)와 물을 충분히 공급하면서 환경 적응을 위해 일주일 동안 적응 시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 원광대학교 한의과대학 동물 사육실에서 일정한 조건(온도 : 21±2℃, 습도: 50~60%, 명암: 12시간 주기)하에서 일반 고형사료(㈜오리엔트바이오, 성남)와 물을 충분히 공급하면서 환경 적응을 위해 일주일 동안 적응 시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 숙지황, 반하, 오미자는 Omniherb (영천, 경북, 대한민국)에서 구입, 정선한 후, 충북테크노파크 전통의 약산업센터에서 확인한 후 약재를 실험약재로 사용하였으며, 일부는 –80℃에 보관하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 Mean ± SE로 표시하였고, 대조군과 실험군의 차이를 검정할 때에는 one way ANOVA로 검정하여 P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 비장세포 및 폐조직의 mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA를 가지고 Taqman 방식으로 염증성 활성 물질을 측정 하였다. 각 primer는 Applied Bio systems (CA, USA)에서 구입하였다.
성능/효과
- 2. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A는 비장세포의 전염증성 사이토카인 TNF-alpha의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
- 3. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A는 비장세포의 Th2 타입 사이토카인 IL-5의 발현을 유의성 있게 억제하였다.
- 4. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A 0.1 g/kg는 기관지 천식 마우스의 기도과반응성을 유의성 있게 억제하였다.
- 5. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A 0.1 g/kg는 기관지 천식 마우스의 폐조직의 조직학적 손상을 유의성 있게 억제하였다.
- 6. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A 0.1 g/kg는 기관지 천식 마우스의 전염증성 사이토카인 TNF-alpha 및 Th2 타입 사이토카인 IL-5를 유의성 있게 억제하였다.
- 숙지황, 반하, 오미자 배합비율별 조성인 A, B, C, D가 마우스 비장세포에서 LPS로 유도한 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해, A, B, C, D를 마우스 비장세포에 1시간 동안 전처리한 후, LPS (1 µg/ml)를 48시간 동안 처리하여 비장 세포의 활성화 및 사이토카인 분비를 촉진시켜 TNF-alpha의 발현정도를 확인하였다. 그 결과, A는 TNF-alpha의 발현을 유의성있게 억제하였으나 B, C, D는 TNF-alpha의 발현을 억제하지 못하였다 (Fig. 3).
- 6). 그 결과, 정상군에서는 기도벽이 얇고 선명하며, 염증세포의 침윤이 보이지 않으나, 천식유발군에서는 기도의 협착과 기도벽의 두께가 증가되어 있고 염증세포의 침착이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 실험군 A 0.
- 그리하여 추출물 A가 이에 미치는 효과를 확인하기 위하여 폐조직의 조직학적 검사를 통하여 기도벽의 두께와 염증세포의 침윤정도, 기관지의 수축 정도를 확인하였다. 그 결과, 추출물 A는 0.1 g/kg 농도에서 천식유발군 비해 기도의 협착과 기도벽의 두께, 염증세포의 침착정도도 유의성 있게 감소할 수 있었다. 하지만 추출물 A 0.
- 본 연구에서 기관지의 수축과 함께 염증세포의 침착을 수반하게 됨으로서 나타나는 기관지 천식의 특징적인 증상인 기도과민성을 측정한 결과 추출물 A의 0.1 g/kg 농도에서 유의한 효과를 보였다. 이는 추출물 A가 기도의 평활근 증식을 억제하여 기도 두께를 감소했을 가능성이 있고, 또한 호산구나 염증성세포의 기관지로 유입, 침윤을 막음으로서 기도과민성을 줄일 수 있었을 것으로 추측 할 수 있었다.
- . 본 연구에서는 숙지황, 반하, 오미자 배합비율 조성에 따라서 in vitro와 in vivo에서 나타나는 면역 조절 및 기관지 천식에 대한 효과를 조사하였고, 그 결과 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성에서 TNF-alpha와 IL-5의 발현 및 기관지 천식에 유의성 있는 억제효과를 보여주었다.
- 그렇기 때문에 TNF-alpha의 억제는 큰 의미를 가질 수 있다. 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율조성의 에탄올 추출물 A는 LPS로 활성화된 비장세포에서의 TNF-alpha의 발현 및 기관지 천식 마우스의 폐조직에서 또한 크게 억제하였다. 이는 추출물 A가 면역세포 조절에 직접적으로 관여함으로서, TNF-alpha의 발현을 조절해 기관지 천식에 유의한 효과를 가져온 것으로 추측할 수 있다.
- 본 연구에서는 OMC-2010의 구성약재 중 숙지황, 반하, 오미자를 배합비율을 다르게 하여 에탄올로 추출하고, in vitro 상에서 TNF-α와 IL-5의 발현을 분석해 유의한 비율조성을 선택하여, 그 효과를 in vivo 상에서 기관지 천식 마우스 모델에 적용하여 조사하였다. 숙지황, 반하, 오미자를 1:1:1 비율로 배합한 처방 A가 비장세포의 활성화에 미치는 사이토카인 억제에 유의한 억제효과를 가졌으며, 또한 기관지 천식 마우스의 기도과반응성, 조직학적 변화 및 사이토카인 억제에 유의한 효과를 보여주었다. 이는 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물에서 유효성분이 다수 포함된 것으로 추측할 수 있다.
- 특히 알레르기성 기관지 천식의 경우 Th2 형의 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13 등이 알레르기 반응에 관여하는 여러 백혈구들의 이동에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있으며22), 그 중 특히 IL-5는 염증이 유발된 조직으로 호산구의 침윤에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고, IL-5 결핍 마우스를 이용한 많은 보고에 의하면 염증조직에 모이는 호산구의 수가 감소한 것을 볼 수 있다23). 실제로 본 연구에서 또한 in vivo와 in vitro실험상에서 추출물 A가 TNF-alpha와 IL-5의 발현 수준을 유의하게 억제할 수 있었다.
- 그 결과, 정상군에서는 기도벽이 얇고 선명하며, 염증세포의 침윤이 보이지 않으나, 천식유발군에서는 기도의 협착과 기도벽의 두께가 증가되어 있고 염증세포의 침착이 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 실험군 A 0.05 g/kg군에서는 기도의 협착과 기도벽의 두께가 천식유발군에 비해 감소하였는데, A 0.1 g/kg군에서는 천식유발군에 비해 기도벽이 얇아지고, 손상된 폐포의 형태도 정상수준으로 돌아왔으며 염증성세포의 침윤 또한 정상군의 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 실험군 A 0.
- 5). 실험군의 Penh 값은 0.05 g/kg, 0.1 g/kg 농도에서 농도 의존적으로 감소하여 유의한 효과를 확인 할 수 있었으나, 0.5 g/kg 농도에서 Penh 값이 다시 증가하였다.
- 1 g/kg 농도에서 유의한 효과를 보였다. 이는 추출물 A가 기도의 평활근 증식을 억제하여 기도 두께를 감소했을 가능성이 있고, 또한 호산구나 염증성세포의 기관지로 유입, 침윤을 막음으로서 기도과민성을 줄일 수 있었을 것으로 추측 할 수 있었다. 그리하여 추출물 A가 이에 미치는 효과를 확인하기 위하여 폐조직의 조직학적 검사를 통하여 기도벽의 두께와 염증세포의 침윤정도, 기관지의 수축 정도를 확인하였다.
- 그 결과 숙지황 물 추출물과 숙지황, 반하, 오미자 에탄올 추출물은 비장세포에서 TNF-α와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제하였다11). 이를 통하여 OMC-2010 물 추출에서는 숙지황이, OMC-2010 에탄올 추출에서는 숙지황, 반하, 오미자가 주로 작용할 것으로 추측할 수 있었다.
- 이상의 결과, 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A는 비장세포에서 TNF-alpha와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제하였으며, 기관지 천식 마우스 모델에서의 기도과민성과 폐 조직학적 손상 및 사이토카인 TNF-alpha와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제하였다. 하지만 추출물의 농도적용에 따른 효과 변화가 있음을 인지할 수 있었으므로, 추출물의 농도에 따른 추가연구 및 단일 추출과 혼합 추출에 따른 효과 성분 분석이 필요할 것으로 사료된다.
- 알레르기성 항원인 OVA에 특이적으로 작용한 면역세포들은 다수가 염증부위인 폐조직으로 이동하여 염증작용 및 Th-2 반응을 통하여 사이토카인을 생산하기 때문에 폐조직 내에서 발현되는 사이토카인양을 조사하였다13-14). 폐조직의 mRNA 레벨에서 사이토카인 변화정도를 확인한 결과, TNF-alpha와 IL-5 수준 모두 천식유발군에서 정상군에 비하여 확연하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 실험군인 A 0.1 g/kg에서 유의하게 억제되었다. 하지만 실험군 A 0.
- 1 g/kg군에서는 천식유발군에 비해 기도벽이 얇아지고, 손상된 폐포의 형태도 정상수준으로 돌아왔으며 염증성세포의 침윤 또한 정상군의 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 실험군 A 0.5 g/kg군의 결과 기도벽의 두께 증가와 폐조직 내의 염증 수준이 A 0.1 g/ kg 농도에 비해 증가 하는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 1 g/kg 농도에서 월등한 효과를 보여주었기 때문에 농도를 조정하여 추가실험이 이루어져야 할 것으로 생각되어진다. 또한 배합 비율에 따른 효과변화에 따라서, 단일 추출과 혼합추출물에 따른 유효 성분 변화가 있을 것으로 사료되어 성분 분석에 대한 추가실험이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이는 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물에서 유효성분이 다수 포함된 것으로 추측할 수 있다. 추출물 A 0.5 g/kg 농도에서는 유의한 억제효과를 보이지 못하였지만, A 0.1 g/kg 농도에서 월등한 효과를 보여주었기 때문에 농도를 조정하여 추가실험이 이루어져야 할 것으로 생각되어진다. 또한 배합 비율에 따른 효과변화에 따라서, 단일 추출과 혼합추출물에 따른 유효 성분 변화가 있을 것으로 사료되어 성분 분석에 대한 추가실험이 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과, 숙지황, 반하, 오미자 1:1:1 비율 조성의 에탄올 추출물 A는 비장세포에서 TNF-alpha와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제하였으며, 기관지 천식 마우스 모델에서의 기도과민성과 폐 조직학적 손상 및 사이토카인 TNF-alpha와 IL-5의 생성을 유의성 있게 억제하였다. 하지만 추출물의 농도적용에 따른 효과 변화가 있음을 인지할 수 있었으므로, 추출물의 농도에 따른 추가연구 및 단일 추출과 혼합 추출에 따른 효과 성분 분석이 필요할 것으로 사료된다.
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