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문제 정의
- 따라서 본 연구는 겨우살이 추출물의 안전성을 검토할 목적으로 시료의 유전 독성 및 발암 원성의 유무를 예측할 수 있는 유전 독성 시험으로 미생물 복귀돌연변이 시험 및 염색체이상 시험을 실시하였고, 실험동물을 이용하여 경구 투여법으로 단회 및 13주 반복투여 독성실험을 실시함으로써 한국산 겨우살이 추출물을 기능성 식품에 적용하기 위한 기초 자료를 제공하고자 수행하였다.
- 최근, 한국산 겨우살이 추출물 혹은 렉틴 성분의 경구 투여는 장관 면역계를 활성화시킴으로써 항종양 활성 및 항원에 대한 면역증강 활성을 포함하는 생체방어 효과가 유도된다는 것을 보고하였다(Yoon 등 1998; Jung 등 2011; Kim 등 2011). 이러한 결과는 이전의 주사에 의한 전신투여법에 의한 면역 활성의 증진 효과와 비교되는 기능으로서 한국산 겨우살이 추출물이 생체방어기구를 활성화시키는 기능성 식품으로의 개발 가능성이 있음을 시시하였다.
제안 방법
- 시험물질인 미슬로 C의 유전독성을 평가하기 위하여 수컷 ICR 마우스의 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 7주령 수컷 ICR 마우스를 7일간 순화시킨 후 시험물질을 멸균 증류수에 용해하여 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏을 매일 1회 총 3일간 경구 투여하였다. 최종 시험물질 투여 후 24시간 후 부검하여 골수세포를 수거하였고, 군 당 2,000개의 다염성 적혈구(Pormochromatic erythrocyte; PCE)를 관찰하고, 이중 소핵다염성 적혈구(PCE with one or more micronuclei; MNPCE)의 출현빈도를 측정하였다.
- 투여 완료 후 랫드를 희생시키고, 일반 혈액학적 검사로 백혈구(white blood cell, WBC), 호중구(neutrophil, NE), 림파구(lymphocyte, LY), 단핵구(monocyte, MO), 호산구(eosinophil, EO) 및 호염구(basophil, BA)를 측정하였다. 동시에 혈액생화학검사로 아스팔테이트 아미노 전이 효소(aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노 전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 혈액요소성 질소(blood urea nitrogen, BUN), 크레아티닌(creatinine, CRE), 혈당(glucose, GLU), 총 콜레스테롤(total cholesterol, CHOL), 총 단백질(Total protein, TP) 등의 검사를 실시하였다. 또한 실험 랫드의 장기를 이용하여 병리조직학적 검사를 실시하였다.
- 미슬로 C의 투여량 및 투여기간 결정을 위하여 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏을 1일 1회, 3일간 경구 투여하고 관찰한 결과, 특별한 육안적 이상소견이 관찰되지 않았다(결과 미제시). 따라서 본 실험에서 1일 1회 3일간 경구 투여하고, 24시간 후에 마우스로부터 골수세포를 수집하고, 소핵과 세포 독성을 관찰하였다. 실험 결과, 용매대조군과 비교하여 500, 1,000, 2,000 ㎎/㎏의 미슬로 C 투여군에서 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으며, 개체 당 약 2,000개의 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵 유발빈도는 모든 시험물질투여군 용매대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 결과를 보이지 않았다(Table 2).
- 식품의약안전청의 의약품 등의 독성시험기준에 따라 암․수 SD 계열의 랫드에 시험물질을 0, 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏/day의 용량으로 1회 경구 투여한 후, 14일간의 체중 변화 및 사망률을 조사한 결과, 대조군과 비교하여 유의한 체중 변화는 없었으며, LD50은 2,000 ㎎/㎏ 이상인 것으로 사료된다. 또한 0, 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏/day의 용량으로 13주간 반복 투여하면서 실험동물의 일반증상, 체중변화, 혈액 및 혈액생화학적 변화, 부검소견, 조직학적인 변화를 관찰하였다. 시험기간 중 암․수 모든 군에서 시험물질 투여에 기인한 일반적인 증상 변화는 관찰되지 않았고, 시험물질의 반복 투여로 인한 사망 마우스 역시 관찰되지 않았다.
- 미슬로 C의 13주 반복 경구 투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 SD 계통 암․수 랫드를 이용하여 시험물질 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏ 용량으로 투여군을 설정하고 부형제로 물을 섭취시킨 대조군과 비교하였다. 각 군별 동물 수는 암수 각 10마리를 사용하였고, 13주 반복 투여에 의한 사망률, 임상증상, 체중 변화, 사료 및 음수 섭취량, 안검사, 뇨검사, 혈액학 및 혈액생화학 검사, 부검소견 및 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 겨우살이 열수 추출물인 미슬로 C의 안전성을 검토하고자 유전 독성 및 실험동물을 이용한 안전성 검사를 실시하였다. 미슬로 C의 미생물 돌연변이 실험을 S.
- 시험 7주령 SD 랫드를 6일간의 검역 및 순화과정을 거친 뒤, 체중 감소가 없는 건강한 동물을 선별하여 무작위법으로 군을 분리하였다. 시험동물은 각 군에 암수 각 5마리를 사용하여, 밤새 절식시킨 후 시료 처리하지 않은 대조군과 시험군(500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏)을 1회 경구 투여하고, 4시간 후 사료를 재급여하였다.
- 시험물질 미슬로 C의 단회 투여 독성 및 개략적인 치사량을 조사하기 위하여, SD 계통 암․수 랫드를 이용하여 시험물질을 단회 경구 투여하였다. 대조군과 3개의 시험군(500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏)으로 시험을 수행하였으며, 시험기간 동안 일반증상, 체중 변화, 시험 중 동물의 사망 유무와 사망동물 및 실험종료 시 생존동물의 부검소견을 관찰하였다.
- 시험물질을 시험동물에 90일간 반복 투여하여 시험물질의 무해용량(no observed adverse effect level, NOAEL) 및 표적장기에 미치는 효과를 한국건설생활환경시험연구원에 의뢰하여 확인하였다. 실험동물은 각 군에 암수 각 10마리씩 F344계통의 특정병원균 부재 랫드를 사용하였으며, 13주 동안 매일 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏의 미슬로 C를 투여하였다.
- 시험물질인 미슬로 C의 유전독성을 평가하기 위하여 수컷 ICR 마우스의 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 7주령 수컷 ICR 마우스를 7일간 순화시킨 후 시험물질을 멸균 증류수에 용해하여 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏을 매일 1회 총 3일간 경구 투여하였다.
- 시험물질을 시험동물에 90일간 반복 투여하여 시험물질의 무해용량(no observed adverse effect level, NOAEL) 및 표적장기에 미치는 효과를 한국건설생활환경시험연구원에 의뢰하여 확인하였다. 실험동물은 각 군에 암수 각 10마리씩 F344계통의 특정병원균 부재 랫드를 사용하였으며, 13주 동안 매일 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏의 미슬로 C를 투여하였다. 투여기간동안 매일 일반증상을 관찰하였으며, 체중은 입수 시, 군분리 시, 투여 개시 시, 투여 후 주 1회, 절식 후 부검일에 각각 측정하였다.
- 7주령 수컷 ICR 마우스를 7일간 순화시킨 후 시험물질을 멸균 증류수에 용해하여 500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏을 매일 1회 총 3일간 경구 투여하였다. 최종 시험물질 투여 후 24시간 후 부검하여 골수세포를 수거하였고, 군 당 2,000개의 다염성 적혈구(Pormochromatic erythrocyte; PCE)를 관찰하고, 이중 소핵다염성 적혈구(PCE with one or more micronuclei; MNPCE)의 출현빈도를 측정하였다. 동시에 정상체 적혈구(Normochromatic erythrocyte; NCE)와 다염성 적혈구를 더한 전 적혈구(PCE+NCE)에 대한 다염성 적혈구의 출현빈도를 구하였다(Hong 등 2008).
- 사료섭취량과 음수섭취량은 투여 개시일 및 투여 후 주 1회 측정하였다. 투여 완료 후 랫드를 희생시키고, 일반 혈액학적 검사로 백혈구(white blood cell, WBC), 호중구(neutrophil, NE), 림파구(lymphocyte, LY), 단핵구(monocyte, MO), 호산구(eosinophil, EO) 및 호염구(basophil, BA)를 측정하였다. 동시에 혈액생화학검사로 아스팔테이트 아미노 전이 효소(aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노 전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP), 혈액요소성 질소(blood urea nitrogen, BUN), 크레아티닌(creatinine, CRE), 혈당(glucose, GLU), 총 콜레스테롤(total cholesterol, CHOL), 총 단백질(Total protein, TP) 등의 검사를 실시하였다.
- 실험동물은 각 군에 암수 각 10마리씩 F344계통의 특정병원균 부재 랫드를 사용하였으며, 13주 동안 매일 250, 500 및 1,000 ㎎/㎏의 미슬로 C를 투여하였다. 투여기간동안 매일 일반증상을 관찰하였으며, 체중은 입수 시, 군분리 시, 투여 개시 시, 투여 후 주 1회, 절식 후 부검일에 각각 측정하였다. 사료섭취량과 음수섭취량은 투여 개시일 및 투여 후 주 1회 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 한국산 겨우살이(Viscum album coloratum)는 한국에서 서식하는 참나무를 숙주로 하여 생장하는 겨우살이로서 1월에 채취하였다. 겨우살이의 추출은 기존의 방법으로 추출 후 동결 건조하였다(Yoon 등 1994).
- 본 실험에서는 히스티딘을 이용하는 박테리아가 히스티딘이 필요 없는 종으로 변화하는 유전자의 변화를 이용하여 변이 여부를 측정하는 방법인 Ames 시험법(Maron & Ames 1983)으로 한국건설생활환경시험연구원에 의뢰하여 실시하였다. 시험용 균주로는 염기쌍 치환형(base-pair substitution type) 돌연변이 검색을 위하여는 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2uvrA를 이용하였다. TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA의 균주는 Molecular Toxicology, Inc.
- 실험을 위한 ICR 계통의 마우스 및 Sprague-Dawley(SD) 계통의 특정병원균 부재(specific pathogen free, SPF) 랫드는 (주) 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 구입하여 한국건설생활환경시험연구원(Korea Conformity Laboratories, Incheon, Korea) SPF 사육구역에서 사육하였다. 사육 환경은 항온 항습된 시설에서 12시간 간격으로 명암 주기를 조절하였다.
데이터처리
- 대조군에 대한 실험군 간의 통계적 유의성은 Student’s twotailed t-test로 분석하였다.
이론/모형
- 본 연구에 사용된 한국산 겨우살이(Viscum album coloratum)는 한국에서 서식하는 참나무를 숙주로 하여 생장하는 겨우살이로서 1월에 채취하였다. 겨우살이의 추출은 기존의 방법으로 추출 후 동결 건조하였다(Yoon 등 1994). 약술하면, 100 g의 겨우살이 잎 및 줄기를 세절 후, 10배 부피(w/v)의 증류수를 넣고 믹서기로 분쇄 후 4℃에서 16시간 교반하였다.
- 본 실험에서는 히스티딘을 이용하는 박테리아가 히스티딘이 필요 없는 종으로 변화하는 유전자의 변화를 이용하여 변이 여부를 측정하는 방법인 Ames 시험법(Maron & Ames 1983)으로 한국건설생활환경시험연구원에 의뢰하여 실시하였다. 시험용 균주로는 염기쌍 치환형(base-pair substitution type) 돌연변이 검색을 위하여는 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2uvrA를 이용하였다.
성능/효과
- 시험기간 중 암․수 모든 군에서 시험물질 투여에 기인한 일반적인 증상 변화는 관찰되지 않았고, 시험물질의 반복 투여로 인한 사망 마우스 역시 관찰되지 않았다. 따라서 미슬로 C를 13주간의 랫드에 대한 13주 반복 경구 투여 결과, 무독성량은 최소한 1,000 ㎎/㎏ 이하인 결과를 나타냈으며, 이 농도에서 독성을 유발하는 표적장기는 관찰되지 않았다.
- 대조군과 3개의 시험군(500, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏)으로 시험을 수행하였으며, 시험기간 동안 일반증상, 체중 변화, 시험 중 동물의 사망 유무와 사망동물 및 실험종료 시 생존동물의 부검소견을 관찰하였다. 실험 결과, 모든 시험군의 실험동물에서 특이한 일반증상 및 사망동물은 관찰되지 않았다. 동시에 단회 투여 후 14일까지의 체중 변화를 관찰한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 체중 변화는 관찰되지 않았다(Table 3).
- 따라서 본 실험에서 1일 1회 3일간 경구 투여하고, 24시간 후에 마우스로부터 골수세포를 수집하고, 소핵과 세포 독성을 관찰하였다. 실험 결과, 용매대조군과 비교하여 500, 1,000, 2,000 ㎎/㎏의 미슬로 C 투여군에서 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으며, 개체 당 약 2,000개의 다염성 적혈구에서 관찰한 소핵 유발빈도는 모든 시험물질투여군 용매대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 결과를 보이지 않았다(Table 2). 한편, mitomycin C를 처리한 양성대조군은 소핵 유발빈도에서 용매대조군에 비해 통계적으로 유의하며 현저한 증가를 보였다(P<0.
- 안검사와 뇨검사 결과 역시 모든 시험동물에서 시험물질 투여와 관련된 독성학적 이상소견은 관찰되지 않았다(결과 미제시). 이상의 결과로 보아 본 시험 조건 하에서 미슬로 C의 랫드에 대한 13주 반복 경구 투여 결과, 무독성량은 ≤1,000 ㎎/㎏이며, 표적장기(target organ)는 관찰되지 않았다.
- 동시에 단회 투여 후 14일까지의 체중 변화를 관찰한 결과, 모든 시험군에서 시험물질에 의한 체중 변화는 관찰되지 않았다(Table 3). 이상의 결과로 보아 시험물질 미슬로 C의 LD50은 2,000 ㎎/㎏ 이상인 것으로 사료되었다.
- 한편, 양성 대조군에서는 각각의 균주에서 양성으로 판단할 수 있는 범위의 복귀돌연변이 콜로니가 유발됨으로써 본 시험은 적절히 수행되었다고 할 수 있었다(Kim 등 2006; Rim 등 2009). 이상의 결과를 볼 때 시험물질 미슬로 C는 본 시험조건 하에서 해당 균주에 대한 복귀돌연변이를 유발하지 않음으로 음성인 결과를 보였다.
- 그러나 mitomycin C를 처리한 양성대조군에서는 유의한 감소 효과가 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 시험물질 미슬로 C는 식품의약청 안정청 고시 제 2005-60의 의약품 등의 독성시험기준에 명시된 마우스 최대 투여용량인 2,000 ㎎/㎏/day의 범위에서 미생물복귀 돌연변이 및 마우스 골수세포에 소핵을 유발하는 유전 독성 효과는 없는 결과를 보였다(Kim 등 2006; Hong 등 2008).
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