선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 추출된 열수 수목추출액을 임상적으로 사용하려면 독성이 없어야 하므로, 독성검사와 간세포계 효소에 미치는 영향을 검토하였다. 무처리군의 정상 랫트(1군 5마리)에 대한 열수추출 다당류의 복강 내 투여시의 치사량을 구하고자 하였으나, 5일 동안 950 µg/kg 이하 투여시에 사망을 일으키지 않았다.
- 그러나 아직 그 추출물의 안전성에 대해서는 약리성분이 인정된 동의보감에 실린 약재이거나 오랜 기간 민간에서 사용되어온 재료에 대해서는 식품으로서 인정을 받고 있을 뿐, 대부분의 수목추출물의 이용에 대해 갈 길이 멀다고 하겠다. 본 연구에서는 신갈나무 폭쇄재 추출물의 안전성 탐색과 항산화효능에 대하여 조사함으로써 건강증진을 위한 식품소재 및 약용성분의 개발을 위한 기초자료로 제공하고자 한다.
- 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells(VSMC))의 이주능과 matrix metalloproteinases(MMPs) 생성능은 동맥경화의 중요한 요인이다. 본연구에서는 수목추출액의 혈관계질환 치료예방에 효과가 있음을 확인하고 TNF-로 유발된 사람동맥 평활근세포(Human Aortic Smooth Muscle Cells(HASMC))의 이주능, MMP-9활성에 대한 억제활성을 검토하였다. Zymography는 HASMC cells에 TNF-α와 수목추출액(0, 10, 20, 50 µℓ/mℓ)을 첨가하여 활성의 densitometric intensity를 측정하여 수목추출액의 MMP-9 억제활성을 검토한 결과, Fig.
- 폭쇄처리된 신갈나무로부터 유래된 열수추출물에 대한 안전성과 항산화활성에 대해 조사하였다. 그 결과, 수목추출액은 사람 동맥평활근 세포에 대해 (IC50 > 500 µℓ/mℓ)농도로 독성을 나타내었으나 독성이 미약하여 인체에 해가 없을 것으로 판단되었다.
제안 방법
- 5 × 104 cells를 24시간 동안 96-well microplates (volume 100 ℓ/well)배지에서 여러 가지 농도의 수목추출액(0, 50, 100, 200, 500 µg/mℓ)으로 처리 후 보온하였다.
- HASMC 세포에 대한 시료의 세포증식 효과는 XTT kit (XTT II, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) (Ha et al., 2004c)로 측정하였다. 세포를 96-well culture plate에서 2시간 동안 1 × 104 cells/wellDMEM로 배양하고 수목추출액을 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1000 µg/mℓ의 농도로 희석하여 3실험군으로 나누어 처리하였다.
- MMP-9 활성은 Ha 등(Demeule et al., 2000; Chung et al., 2004b; Ha et al., 2004a)의 방법으로 실시하고 수목추출액은 농도별로(0, 1, 10, 50, 100, 500, 1000 µg/mℓ) 실시하였다.
- , 2004c)에 의한 방법으로 실험하였으며, Matrigel-코팅된 filter inserts를 Bcton-Dickinson (NJ, USA)사의 24-well invasion chambers에 고정 후, HASMC (5 × 104 cells/well) 세포를 일정량으로 배양시킨 후, TNF-처리 HASMC를 24시간 배양 후 여러 농도(0, 50, 100, 250, 500 µg/mℓ)로 처리 후, 500mℓ의 배양액을 invasion chamber에 첨가하였다. TNF-처리배지를 처리하지 않은 세포는 대조군으로 사용하였고 Matrigel invasion chamber를 37℃, 24시간, 5% CO2에서 보온하였다.
- 목재는 가로 세로가 약 2 cm × 5 cm, 두께 약 5 mm 정도의 칩 상태로 세절한 후, 연화를 위하여 물속에 하루 동안 침지시킨 후에 폭쇄 처리 재료로 이용하였다. 목재 칩이 들어 있는 밀폐된 용기 속 보일러의 온도가 220℃의 고압수증기 조건으로 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시켜 10분간 처리한 후, 연화된 목재 칩을 대기 중에 순간적으로 방출하여 분해된 목재 칩을 얻었다. 이 폭쇄 처리된 목재 칩을 121℃의 열수추출기에서 폭쇄재 중량 대비 20배 부피의 물에 넣어 30분 동안 오토클래이브 속에서 열수 추출하여 수목추출물로서 실험에 제공하였다.
- 본 실험에서는 gelatin zymogaphy를 약간 변형하여 MMP 저해제 탐색에 이용하였다. 먼저 acrylamide 젤 제조시 기질인 gelatin을 1.
- 세포를 96-well culture plate에서 2시간 동안 1 × 104 cells/wellDMEM로 배양하고 수목추출액을 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1000 µg/mℓ의 농도로 희석하여 3실험군으로 나누어 처리하였다.
- 수목추출액의 사람 동맥평활근 세포(HASMC)에 대한 독성은 HASMC cells (5 × 104 cells/well)를 24시간 동안 96-well microplates로 수목추출액농도(0, 50, 100, 200, 500 µℓ/mℓ)에서 XTT cell proliferation assay kit를 사용하여 측정하였다.
- 72시간 후 50 ℓ의 XTT 환원용액(sodium 3’-[1-(phenyl-aminocarbonyl)-3, 4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzenesulfonic acid hydrate N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate; 50 : 1로 혼합)을 첨가하고, 4시간 후 490 nm에서 ELISA plate reader로 측정하였다. 실험은 3회씩 독립적으로 실시하였다.
- 목재 칩이 들어 있는 밀폐된 용기 속 보일러의 온도가 220℃의 고압수증기 조건으로 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시켜 10분간 처리한 후, 연화된 목재 칩을 대기 중에 순간적으로 방출하여 분해된 목재 칩을 얻었다. 이 폭쇄 처리된 목재 칩을 121℃의 열수추출기에서 폭쇄재 중량 대비 20배 부피의 물에 넣어 30분 동안 오토클래이브 속에서 열수 추출하여 수목추출물로서 실험에 제공하였다. 독성 실험에 사용된 세포는 인체유래 동맥평활근 세포인 HASMC (Human aortic smooth muscle cells)를 사용하였으며, 수목추출액의 모든 분획에 대한 항산화성 유무를 확인하기 위해서 실험동물은 일본 Air Logistics사의 4주령 B6C3F1 숫컷 생쥐로 한국 바이오 제노믹스사를 통하여 구입하여 다섯 군(1군 10마리)으로 나누어서 실험을 하였다.
- 이주능 시험은 Matrigel migration assay 방법으로 Chung 등과 Ha 등(Chung et al., 2004a and 2004b; Ha et al., 2004c)에 의한 방법으로 실험하였으며, Matrigel-코팅된 filter inserts를 Bcton-Dickinson (NJ, USA)사의 24-well invasion chambers에 고정 후, HASMC (5 × 104 cells/well) 세포를 일정량으로 배양시킨 후, TNF-처리 HASMC를 24시간 배양 후 여러 농도(0, 50, 100, 250, 500 µg/mℓ)로 처리 후, 500mℓ의 배양액을 invasion chamber에 첨가하였다.
- 제1군(이하, 1군)은 정상군으로 물과 사료만으로 사육하였다. 제2군(이하, 2군)은 생쥐 당 17.5 mg/Kg의 비율로 DEN (N, N-diethylnitrosoamine)을 주 2회씩 8주간 복강 주사하였고 이후에 12주를 더 사육한 다음에 경추 탈구법으로 도살하여 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다. 제3군(이하, 3군)은 처음부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여(500 ppm) 사료와 함께 사육하였고, 제4군(이하, 4군)은 DEN을 8주간 복강 주사한 후에 9주부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여 사료와 함께 사육하였다.
- 5 mg/Kg의 비율로 DEN (N, N-diethylnitrosoamine)을 주 2회씩 8주간 복강 주사하였고 이후에 12주를 더 사육한 다음에 경추 탈구법으로 도살하여 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다. 제3군(이하, 3군)은 처음부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여(500 ppm) 사료와 함께 사육하였고, 제4군(이하, 4군)은 DEN을 8주간 복강 주사한 후에 9주부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여 사료와 함께 사육하였다. 제5군(이하, 5군)은 DEN을 복강 주사하면서 열수 수목추출액과 사료로 사육하는 군으로 분류하여 실험하였다.
- 제3군(이하, 3군)은 처음부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여(500 ppm) 사료와 함께 사육하였고, 제4군(이하, 4군)은 DEN을 8주간 복강 주사한 후에 9주부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여 사료와 함께 사육하였다. 제5군(이하, 5군)은 DEN을 복강 주사하면서 열수 수목추출액과 사료로 사육하는 군으로 분류하여 실험하였다.
대상 데이터
- 국산 참나무재 6종 중에서 본 연구를 위한 공시재료는 신갈나무재(Quercus mongolica)를 이용하였다. 목재는 가로 세로가 약 2 cm × 5 cm, 두께 약 5 mm 정도의 칩 상태로 세절한 후, 연화를 위하여 물속에 하루 동안 침지시킨 후에 폭쇄 처리 재료로 이용하였다.
- 이 폭쇄 처리된 목재 칩을 121℃의 열수추출기에서 폭쇄재 중량 대비 20배 부피의 물에 넣어 30분 동안 오토클래이브 속에서 열수 추출하여 수목추출물로서 실험에 제공하였다. 독성 실험에 사용된 세포는 인체유래 동맥평활근 세포인 HASMC (Human aortic smooth muscle cells)를 사용하였으며, 수목추출액의 모든 분획에 대한 항산화성 유무를 확인하기 위해서 실험동물은 일본 Air Logistics사의 4주령 B6C3F1 숫컷 생쥐로 한국 바이오 제노믹스사를 통하여 구입하여 다섯 군(1군 10마리)으로 나누어서 실험을 하였다.
- 목재는 가로 세로가 약 2 cm × 5 cm, 두께 약 5 mm 정도의 칩 상태로 세절한 후, 연화를 위하여 물속에 하루 동안 침지시킨 후에 폭쇄 처리 재료로 이용하였다.
- 수목추출액의 모든 분획에 대한 항산화성 유무를 확인하기 위해서 실험동물은 일본 Air Logistics사의 4주령 숫컷 생쥐로 다섯 군(1군 10마리)으로 나누어서 실험을 하였다. 제1군(이하, 1군)은 정상군으로 물과 사료만으로 사육하였다.
- 실험에 사용된 세포는 인체유래 동맥평활근 세포인 HASMC를 사용하였으며(Moon et al., 2003), HASMC은 10% FBS (fetal bovine serum), 2 ng/mℓ human basic fibroblast growth factor, 0.5 ng/mℓ human epidermal growth factor, 50 µg/mℓ gentamicin, 50 µg/mℓ amphotericin-B, 5 µg/mℓ bovine insulin을 첨가한 배지에서 배양하였다.
성능/효과
- Fig. 3에 나타내었듯이, 필타 안으로 침윤한 세포 수가 수목추출액 농도 의존적으로 크게 감소한(IC50= 22 µg/mℓ) 결과를 나타냈으며, 수목추출액이 사람 동맥평활근 세포의 침윤-이주능을 효과적으로 억제함을 확인하였다.
- Zymography는 HASMC cells에 TNF-α와 수목추출액(0, 10, 20, 50 µℓ/mℓ)을 첨가하여 활성의 densitometric intensity를 측정하여 수목추출액의 MMP-9 억제활성을 검토한 결과, Fig. 2에 나타내었듯이, 수목추출물의 농도가 10 µℓ/mℓ가 50 µℓ/mℓ로증가함에 따라서 농도 의존적으로 MMP-9 활성을 억제함을 확인할 수 있었다(IC50 : 24 g/mℓ).
- 수목추출액의 사람 동맥평활근세포에 대한 독성을 XTT방법으로 검토한 결과, IC50 = 90 µg/mℓ에서 약한 세포독성을 나타내었다. gelatin zymography 법으로 이들 수목추출액 분획에 대한 matrix metalloproteinase (MMP)-9 활성에 대한 억제도를 검토한 결과, TNF-a처리 HASMC는 세포이주 활성이 관여하는 MMP-9을 분비하였으며 수목추출액은 이 효소를 강하게 억제하였다. 수목추출액은 농도의존적으로 MMP-9활성을 억제하였으며 Matrigel migration 방법에서 농도 의존적으로 수목추출물의 농도가 증가함에 따라서 TNF-유발 HASMC세포이주를 직선적으로 억제하였다(IC50 = 65 µg/mℓ).
- 그 결과, 수목추출액은 사람 동맥평활근 세포에 대해 (IC50 > 500 µℓ/mℓ)농도로 독성을 나타내었으나 독성이 미약하여 인체에 해가 없을 것으로 판단되었다.
- 그림에서 보는 바와 같이 세포생존력은 수목 추출액의 농도가 높아짐에 따라 대조구에 비해 감소하는 경향을 보였으며, 수목추출액의 농도가 200 µg/mℓ에서 대조구의 약 80%까지, 그리고 이보다 2.5배 더 높은 500 µg/mℓ에서 대조구의 약 60%까지 감소함을 알 수 있었다.
- 폭쇄처리된 신갈나무로부터 유래된 열수추출물은 노화방지(항산화성) 및 면역증강활성을 가지며, 독성이 없으므로 미용식품 등의 건강보조식품 및 고혈압 제재 등 의약품의 원료로도 접목되어 임산자원인 목재소재가 고부가화한 제품으로 널리 이용될 수 있을 것으로 판단되었다. 본 연구 결과, 신갈나무 폭쇄처리재의 열수추출물은 뛰어난 안전성과 항산화성이 있음을 확인하였다.
- 사람의 간암세포(Chang, 5 ×103)를 각각 96well microplate에 well당 198 µℓ씩 분주한 후 MTT assay를 실시하였던 바, 세포 독성이 없거나 낮은 것으로 나타났다(Fig. 4).
- 사람의 간암세포(Hep3B, 5 ×103)를 각각 96well microplate에 well당 198 µℓ씩 분주한 후 세포독성을 검사한 결과, 간암세포에는 강한 선택적인 독성을 나타내었다.
- 수목추출물의 농도가 100 µℓ/mℓ에서 control의 약 40% 수준으로 감소하여 농도 의존적으로 MMP-9 활성을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 수목추출액은 농도의존적으로 MMP-9활성을 억제하였으며 Matrigel migration 방법에서 농도 의존적으로 수목추출물의 농도가 증가함에 따라서 TNF-유발 HASMC세포이주를 직선적으로 억제하였다(IC50 = 65 µg/mℓ).
- 2에 나타내었듯이, 수목추출물의 농도가 10 µℓ/mℓ가 50 µℓ/mℓ로증가함에 따라서 농도 의존적으로 MMP-9 활성을 억제함을 확인할 수 있었다(IC50 : 24 g/mℓ). 수목추출액은 이 이상의 농도에서도 MMP-9활성을 강력하게 저해하여 세포독성은 미약하면서 MMP-9활성은 강하게 저해하였다.
- 그 결과, 수목추출액은 사람 동맥평활근 세포에 대해 (IC50 > 500 µℓ/mℓ)농도로 독성을 나타내었으나 독성이 미약하여 인체에 해가 없을 것으로 판단되었다. 수목추출액의 MMP-9 억제활성을 검토한 결과, 농도 의존적으로 MMP-9 활성을 강력하게 저해하여 세포 독성은 미약하면서 Matrigel migration방법에서 농도 의존적으로 TNF-유발 HASMC세포이주를 억제하였다. 또한 사람의 간세포에 대한 세포 독성이 없거나 낮은 것으로 나타났다.
- 수목추출액의 사람 동맥평활근 세포(HASMC)에 대한 독성을 kit를 사용하여 HASMC cells (5 × 104 cells/well)를 24시간 동안 96-well microplates로 수목추출액농도(0, 50, 100, 200, 500 µℓ/mℓ)에서 측정한 결과, 수목추출액의 사람 동맥평활근 세포(HASMC)에 대한 독성은 농도의존적으로 세포독성이 인정되었다(Fig. 1).
- 수목추출액의 사람 동맥평활근세포에 대한 독성을 XTT방법으로 검토한 결과, IC50 = 90 µg/mℓ에서 약한 세포독성을 나타내었다.
- 암 유발 물질을 투여하지 않은 군들(1군과 2군)간의 비교에서 열수 수목추출액의 투여군에서 과산화물분해효소의 활성이 29% 이상 증가함을 나타내었다, 또한 암 유발 물질의 투여군들간(2군, 4군 그리고 5군)의 비교에서도 열수 수목추출액의 투여군(4군과 5군)에서 과산화물분해효소의 활성이 유의적으로 증가하였다(Table 2).
- 01% NaN3)으로 20분간 다시 세척하였다. 용매 수목추출액과 zymography용 incubation 완충용액을 혼합하여 37℃에서 20시간 배양한 다음 gel을 2.5% Gel을 0.1% Coomasie brillient blue로 염색시킨 후 탈색하여 gelatin 분해능이 현저하게 저하된 것을 MMP 저해제 활성이 있는 것으로 판단하였다. MMP-9 활성은 Ha 등(Demeule et al.
- 수목추출액은 농도의존적으로 MMP-9활성을 억제하였으며 Matrigel migration 방법에서 농도 의존적으로 수목추출물의 농도가 증가함에 따라서 TNF-유발 HASMC세포이주를 직선적으로 억제하였다(IC50 = 65 µg/mℓ). 이러한 결과는 수목추출액이 TNF-유발 HASMC세포의 이주억제활성을 가진 항동맥경화 활성을 가짐을 알 수 있었다.
후속연구
- 상기 휘발성분류는 암세포 성장을 억제하고, 고혈압에 효과가 있고, 간기능을 활성화하는 효과가 있다. 따라서 리그노 셀룰로오스계 바이오매스 물질의 저분자화에 의한 수목 추출물의 안전성이 검증된 참나무와 같은 재료에 대해서는 식품의 원료 및 첨가물, 나아가 약리성분을 이용한 제약 원료로의 이용이 크게 기대된다고 하겠다. 따라서 이런 일련의 결과들은 목질계 바이오매스 자원이 폭쇄처리를 적용하여 추출된 약용성분이 건강식품이나 약리성분의 원료로 사용하는데 중요한 기초 자료를 제공할 것이다.
- 따라서 리그노 셀룰로오스계 바이오매스 물질의 저분자화에 의한 수목 추출물의 안전성이 검증된 참나무와 같은 재료에 대해서는 식품의 원료 및 첨가물, 나아가 약리성분을 이용한 제약 원료로의 이용이 크게 기대된다고 하겠다. 따라서 이런 일련의 결과들은 목질계 바이오매스 자원이 폭쇄처리를 적용하여 추출된 약용성분이 건강식품이나 약리성분의 원료로 사용하는데 중요한 기초 자료를 제공할 것이다.
- 우리나라의 산림자원 중에서 목재소재인 리그노 셀룰로오스 바이오매스 자원을 이용한 약리성분이나 그 성분의 의학적인 임상효과에 대한 연구는 거의 전무하다고 하겠다. 목재 세포벽의 분해에 의한 약리 성분의 추출은 물리화학적인 고압의 수증기 폭쇄법이 가장 적합하다고 판단되며, 이 방법에 의해 무독성의 약리성분을 스크리닝할 수만 있다면 식품분야와 제약분야에 일대 혁신을 가져올 수 있을 것으로 판단된다. 에너지 분야에서 이용되어온 이러한 방법이 고분자 목질계 소재의 저분자화로 식품소재로의 이용이 될 수 있는 가능성은 충분하다.
- 본 연구의 수목추출액은 임상 투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 연구의 수목추출액은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제재화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
- 또한 사람의 간세포에 대한 세포 독성이 없거나 낮은 것으로 나타났다. 폭쇄처리된 신갈나무로부터 유래된 열수추출물은 노화방지(항산화성) 및 면역증강활성을 가지며, 독성이 없으므로 미용식품 등의 건강보조식품 및 고혈압 제재 등 의약품의 원료로도 접목되어 임산자원인 목재소재가 고부가화한 제품으로 널리 이용될 수 있을 것으로 판단되었다. 본 연구 결과, 신갈나무 폭쇄처리재의 열수추출물은 뛰어난 안전성과 항산화성이 있음을 확인하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.