[논문]택란 메탄올 추출물에 의한 인체 폐암 세포주 A549의 G1 arrest 유발

박현진; 진수정; 오유나; 윤승근; 이지영; 권현주; 김병우

doi:10.5352/jls.2013.23.9.1109

택란 메탄올 추출물에 의한 인체 폐암 세포주 A549의 G1 arrest 유발
Induction of G1 Arrest by Methanol Extract of Lycopus lucidus in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.23 no.9 = no.161, 2013년, pp.1109 - 1117

박현진 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터) , 진수정 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터) , 오유나 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터) , 윤승근 (동의대학교 자연과학대학 생명응용학과) , 이지영 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터) , 권현주 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터) , 김병우 (동의대학교 블루바이오 소재개발 센터)

초록
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본 연구에서는 인체 폐암 세포인 A549를 사용하여 택란 메탄올 추출물의 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다. 먼저 택란 추출물이 A549의 세포증식에 미치는 영향을 알아본 결과 처리 농도 및 시간 의존적으로 A549의 성장이 저해되었으며, 세포 주기 변화를 분석한 결과 강력한 G1 arrest가 유도되는 것을 확인하였다. 이러한 택란 추출물에 의한 G1 arrest는 세포주기 조절 단백질인 Cyclin D1, Cyclin E 및 Cyclin-dependent kinase인 CDK2, CDK4, CDK6의 발현 감소와 연관되어 있었다. 또한 택란 추출물에 의한 CDK/Cyclin complex의 발현 저해는 DNA 손상에 의해 활성화되는 CHK2의 활성화 형태인 p-CHK2의 발현 증가에 따른 CDK 활성화 효소인 Cdc25A phosphatase의 발현 억제에 의해 나타나는 결과로 사료된다. 반면 종양억제유전자인 p53 및 CDK 억제제인 p21과 p27의 발현량은 증가되지 않았다. 이러한 결과들로부터 택란 추출물은 DNA damage에 의한 ATM/CHK2/Cdc25A/CDK2 pathway를 통해 A549의 G1 arrest를 유도하여 세포의 증식을 억제할 것으로 판단되며, 이때 택란 추출물에 의해 유도되는 G1 arrest는 p53 비의존적인 경로일 것으로 사료된다. 본 연구결과는 택란이 Cdc25A를 target으로 하는 새로운 항암활성 소재로서 사용될 수 있는 가능성을 시사한다. 또한 본 연구결과는 택란 추출물의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 이해하고 향후 지속적 연구를 하는 데 있어서 귀중한 기초자료로 사용될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Induction of G1 Arrest by Methanol Extract of Lycopus lucidus in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells Lycopus lucidus, a herbaceous perennial, is used as a traditional remedy in East Asia, including China and Korea. It has been reported that L. lucidus has anti-allergic effects, inhibitory effects on cholesterol acyltransferase in high glucose-induced vascular inflammation, and anti-proliferative effects in human breast cancer cells. However, the molecular mechanisms of the anti-cancer effects of L. lucidus have not yet been fully determined. In this study, we evaluated the anti-cancer effect and the mechanism of action of L. lucidus in human lung adenocarcinoma A549 cells using methanol extracts of L. lucidus (MELL). MELL treatment showed cytotoxic activity in a dose-dependent manner and induced G1 arrest in A549 cells. The induction of G1 arrest by MELL was associated with the up-regulation of phospho-CHK2 and the down-regulation of Cdc25A phosphatase. In addition, MELL treatment induced decreased expression of G1/S transition-related proteins, including CDK2, CDK4, CDK6, cyclin D1 and cyclin E. MELL also regulated the mRNA expression of CDK2 and cyclin E. On the other hand, the expression of p53 and the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 was not induced by MELL. Collectively, these results suggest that MELL may exert an anti-cancer effect by cell cycle arrest at G1 phase through the ATM/CHK2/Cdc25A/CDK2 pathway in A549 cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 MELL에 의한 A549의 G1 arrest 유도의 분자생물학적 기전을 분석하기 위해 cyclin, CDK 등 checkpoint 단백질들과 CHK2, Cdc25A, p53, p21 등의 발현을 확인하였다. 예상대로 MELL 처리에 따라 농도의존적으로 cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4 등 G1/S 전환에 관련하는 단백질들의 발현이 감소하였다(Fig.
최근 연구결과에 따르면 택란 추출물이 유방암 세포 MCF-7의 apoptosis를 유도하여 성장을 저해한다는 보고가 있으나, 다른 종류의 암세포에서의 항암활성 및 세포주기 조절에 의한 항암활성에 관한 명확한 분자적 기전 연구는 아직 미비하다[20]. 따라서 본 연구에서는 인간 폐암세포 A549를 사용하여 택란 메탄올 추출물의 A549 세포의 성장에 미치는 영향 및 세포주기조절에 의한 항암활성과 그 분자적 기전에 관하여 연구하였다.
특히 암세포에서 특이적으로 과발현되어 있는 세포주기조절 관련 분자 등에 관한 연구결과들이 보고되면서 세포주기조절 인자를 target으로 하는 항암제에 관한 연구가 주목받고 있다. 이에 본 연구에서는 인체 폐암 세포인 A549를 사용하여 한약재인 택란 메탄올 추출물(MELL)의 항암효과 및 그 분자생물학적 기전연구로서 세포주기 조절에 관하여 분석하였다.

제안 방법

A549 세포에 농도별(0-400 μg/ml)로 MELL을 처리하고 24시간 배양하였으며 PBS로 세척 후 lysis buffer (Cell Signaling Technology MA, USA/1 mM PMSF)를 첨가하여 세포를 회수하였다.
A549세포에 농도별(0-400 μg/ml)로 MELL을 처리하고 24시간 배양 후 TRIzol reagent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다.
MELL 처리에 의한 A549 세포의 세포주기에 관련된 mRNA의 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. A549세포에 농도별(0-400 μg/ml)로 MELL을 처리하고 24시간 배양 후 TRIzol reagent (Invitrogen Co.
MELL에 의한 A549 세포의 형태학적 분석을 위하여 6-well plate에 3×105 cells/well의 A549 세포를 분주하고 24시간 뒤 MELL을 농도별(0-400μg/ml)로 처리 후 48시간 동안 배양하였다.
MELL에 의해 DNA damage가 일어나는지 확인하기 위하여 agarose gel 전기영동에 의한 정성적 분석을 수행하였다. 먼저 A549 세포에 2 mM hydrogen peroxide (H₂O₂)와 MELL 을 농도별(100-400 μg/ml)로 처리하고 24시간 배양 후 세포를 회수하여 AccuPrep^® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리한 다음, 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하였다.
MELL의 A549 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여 적정농도의 MELL을 세포에 처리하고 24시간 배양 후 Flow cytometry를 사용하여 세포주기 변화를 측정하였다. Fig.
MELL이 A549 세포주기에 미치는 영향에 대한 분석을 위하여 MELL을 다양한 농도로 A549 세포에 처리하여 CycleTEST™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 세포주기를 분석하였다.
다음으로 MELL 처리에 의한 A549 세포의 G1 arrest의 상위기전 분석을 위하여 종양억제유전자인 p53, CDK inhibitor인 p21과 p27, CDK activator인 Cdc25A 그리고 CHK2의 단백질 발현을 Western blot analysis를 통하여 확인하였다. 그 결과 Fig.
다음으로 MELL 처리에 의해 유도된 CHK2의 인산화가 DNA damage에 의한 것인지 확인하였다. 먼저 A549 세포에 MELL을 농도별로 24시간 처리하고, 이때 양성 대조군으로 A549 세포에 2 mM의 H₂O₂를 처리하여 genomic DNA를 추출하였다.
cells/well의 A549 세포를 분주하고 24시간 뒤 MELL을 농도별(0-400μg/ml)로 처리 후 48시간 동안 배양하였다. 도립현미경을 사용하여 100-200배의 배율로 관찰했으며, Axio Vision program을 사용하여 촬영을 하였다.
1A에 나타난 바와 같이 농도의존적으로 세포의 생존율이 감소하였으며, 특히 48시간 처리한 경우 200 μg/ml에서는 약 50% 정도의 생존율 억제가 일어났고, 최고농도인 600 μg/ml에서는 60% 이상의 성장 억제 효과를 보였다. 또한, MELL 처리에 따른 A549 세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여, MELL을 농도별로 48시간 처리한 다음 도립현미경을 이용하여 A549 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과, MELL 처리 농도가 증가할수록 A549의 세포 형태가 변화되며 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
먼저 A549 세포에 2 mM hydrogen peroxide (H2O2)와 MELL 을 농도별(100-400 μg/ml)로 처리하고 24시간 배양 후 세포를 회수하여 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 분리한 다음, 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하였다.
다음으로 MELL 처리에 의해 유도된 CHK2의 인산화가 DNA damage에 의한 것인지 확인하였다. 먼저 A549 세포에 MELL을 농도별로 24시간 처리하고, 이때 양성 대조군으로 A549 세포에 2 mM의 H₂O₂를 처리하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 1% agaroge gel 전기영동으로 확인한 결과, Fig.
반응이 끝난 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 membrane에 도포하고 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다.
분리된 RNA를 1 μg으로 정량한 후 oligo dT primer와 SuperScript First-Strand Synthesis System kit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)를 사용하여 cDNA 를 합성하였으며, 이 cDNA를 template로 사용하여 CDK2, CDK4, Cyclin E, Cyclin D1 유전자를 TaKaRa Taq kit (TaKaRa biotechnology, DALIAN, Co., LTD.)로 증폭하였다.
인체 폐암 세포주인 A549를 24-well plate에 1-3×10⁴ cells/well로 분주한 후 24시간 뒤 MELL을 농도별(0-800μg/ml)로 처리하고 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 세포의 배지를 제거하고 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지를 분주 후 30분간 37℃ 배양기에서 반응시키고 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.
앞서 Fig. 2에서 MELL에 의한 A549 세포의 G1 arrest 유도를 확인하였으므로, 다음으로 분자적 레벨에서 더욱 명확하게 분석하기 위하여 MELL을 24시간 동안 처리한 후 세포주기관련 단백질인 cyclin과 CDK의 발현량을 Western blot analysis를 통해 확인하였다. 그 결과, Fig.
이 때 housekeeping 유전자인 β-actin을 internal control로 사용하였으며, 각 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 1% agarose gel을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)로 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
세포의 배지를 제거하고 WST 시약(Daeillab, Korea)이 포함된 배지를 분주 후 30분간 37℃ 배양기에서 반응시키고 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험을 하여 평균값으로 나타내었으며, 본 실험결과를 바탕으로 이후 적정 처리 농도를 결정하였다.
)은 국내산(경상북도 영천시)이며 ㈜ 대한생약제품(부산광역시 소재)에서 구입하였다. 택란 10g을 파쇄하여 분말로 만든 후 시료의 5-10배의 메탄올 용매를 가하여 75℃에서 3회 반복 추출했다(수율: 12.8%). 획득한 메탄올 추출물(Methanol extracts of Lycopus lucidus Turcz.
3A에서와 같이 G1기에서 S기로의 전환을 촉진하는 단백질인 cyclin D1과 cyclin E의 발현이 감소하였으며, cyclin과 반응하여 G1기에서 S기로의 전환을 유도하는 cyclin-dependent kinase인 CDK2, CDK4, CDK6의 발현 또한 MELL 농도의존적으로 감소하였다. 특히 CDK2와 cyclin E의 경우, MELL처리에 의해 mRNA 레벨에서 억제되어 단백질 발현이 감소되는 것을 RT-PCR을 통하여 확인하였다(Fig. 3B). 반면 CDK4 및 cyclin D1의 발현은 mRNA 레벨에서는 변화가 없었다.
폐암 세포주인 A549의 성장에 미치는 MELL의 영향을 알아보기 위하여 적정농도의 MELL을 처리하고 24시간 및 48시간 배양 후 WST assay를 실시하였다. 그 결과, Fig.
8%). 획득한 메탄올 추출물(Methanol extracts of Lycopus lucidus Turcz., MELL)을 Whatman No.2(Whatman international Ltd., England)에 여과 후 감압 농축기로 농축하여 1.28g을 얻었으며, 동결건조(FDU-2100, EYELA, Japan) 하여 200 mg/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해시켜 상온에 보관하고 세포에 처리 전 배지에 희석하여 사용하였다.

대상 데이터

반응이 끝난 후 Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 membrane에 도포하고 chemiluminescence detection system (FluoChem^® FC2, AlphaInnotech, USA)을 사용하여 분석하였다. 본 실험에 사용한 p53, p27, CDK2, CDK4, CDK6, Cyclin E, Cyclin D1, actin에 대한 일차항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하였으며, p21, CHK2, p-CHK2, CDC25A에 대한 일차항체는 Cell Signaling Technology (MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에서 사용한 택란(Lycopus lucidus Turcz.)은 국내산(경상북도 영천시)이며 ㈜ 대한생약제품(부산광역시 소재)에서 구입하였다. 택란 10g을 파쇄하여 분말로 만든 후 시료의 5-10배의 메탄올 용매를 가하여 75℃에서 3회 반복 추출했다(수율: 12.
실험에 사용된 인체 폐암 세포주 A549는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 구입하였으며, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin/streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 37℃ 배양기에서 5%의 CO2를 유지하면서 배양하였다.
인체 폐암 세포주인 A549를 24-well plate에 1-3×104 cells/well로 분주한 후 24시간 뒤 MELL을 농도별(0-800μg/ml)로 처리하고 24시간 및 48시간 동안 배양하였다.

데이터처리

세포는 6-well plate에 3×10⁵ cells/well의 농도로 분주하였고 MELL의 농도는 0-400μg/ml 로 처리 후 24시간 동안 배양하여 PBS로 세척하고 ribonuclease A를 실온에서 10분간 처리한 다음 propidium iodide (PI) 용액을 첨가하여 4℃에서 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 Flow cytometry (Cell Lab Quanta SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)로 측정하였으며, WinMDI2.8 program을 사용하여 분석하였다.

이론/모형

MELL을 처리한 A549 세포의 세포주기에 관련된 단백질의 발현 양상을 확인하기 위하여 Western blot을 수행하였다. A549 세포에 농도별(0-400 μg/ml)로 MELL을 처리하고 24시간 배양하였으며 PBS로 세척 후 lysis buffer (Cell Signaling Technology MA, USA/1 mM PMSF)를 첨가하여 세포를 회수하였다.
MELL이 폐암세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여 WST(water soluble tetrazolium salt) assay를 수행하였다. 인체 폐암 세포주인 A549를 24-well plate에 1-3×10⁴ cells/well로 분주한 후 24시간 뒤 MELL을 농도별(0-800μg/ml)로 처리하고 24시간 및 48시간 동안 배양하였다.

성능/효과

MELL의 A549 세포주기에 미치는 영향을 알아보기 위하여 적정농도의 MELL을 세포에 처리하고 24시간 배양 후 Flow cytometry를 사용하여 세포주기 변화를 측정하였다. Fig. 2A의 histogram 결과와 같이 MELL 처리 농도가 높아질수록 G1기(region M2)의 세포분포가 점차 증가하는 것을 알 수 있었다. 반면, S기(region M3) 및 G2/M기(region M4)의 세포는 MELL 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
MELL의 A549 생존율 및 증식억제를 확인한 결과, MELL이 포함된 배지에서 48시간 동안 배양하였을 때 MELL 처리 농도 및 시간 의존적으로 생존율이 감소하였으며, 세포 형태의 변화와 세포 수 감소를 현미경으로 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이러한 생존율 감소의 기전을 확인하기 위하여 세포주기 변화를 관찰하였으며 그 결과 MELL 농도의존적으로 G1 arrest가 일어나는 것을 알 수 있었다(Fig.
다음으로 MELL 처리에 의한 A549 세포의 G1 arrest의 상위기전 분석을 위하여 종양억제유전자인 p53, CDK inhibitor인 p21과 p27, CDK activator인 Cdc25A 그리고 CHK2의 단백질 발현을 Western blot analysis를 통하여 확인하였다. 그 결과 Fig. 4A에서와 같이 MELL 농도의존적으로 CHK2의 발현이 감소되었으며, DNA damage에 의해 활성화되는 p-CHK2의 발현은 증가되었다. 또한 CDK를 탈인산화시켜 활성화시키고 G1/S 전환을 유도하는 Cdc25A phosphatase의 발현이 MELL 농도의존적으로 감소되었다.
그 결과, Fig. 1A에 나타난 바와 같이 농도의존적으로 세포의 생존율이 감소하였으며, 특히 48시간 처리한 경우 200 μg/ml에서는 약 50% 정도의 생존율 억제가 일어났고, 최고농도인 600 μg/ml에서는 60% 이상의 성장 억제 효과를 보였다.
2에서 MELL에 의한 A549 세포의 G1 arrest 유도를 확인하였으므로, 다음으로 분자적 레벨에서 더욱 명확하게 분석하기 위하여 MELL을 24시간 동안 처리한 후 세포주기관련 단백질인 cyclin과 CDK의 발현량을 Western blot analysis를 통해 확인하였다. 그 결과, Fig. 3A에서와 같이 G1기에서 S기로의 전환을 촉진하는 단백질인 cyclin D1과 cyclin E의 발현이 감소하였으며, cyclin과 반응하여 G1기에서 S기로의 전환을 유도하는 cyclin-dependent kinase인 CDK2, CDK4, CDK6의 발현 또한 MELL 농도의존적으로 감소하였다. 특히 CDK2와 cyclin E의 경우, MELL처리에 의해 mRNA 레벨에서 억제되어 단백질 발현이 감소되는 것을 RT-PCR을 통하여 확인하였다(Fig.
또한, MELL 처리에 따른 A549 세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여, MELL을 농도별로 48시간 처리한 다음 도립현미경을 이용하여 A549 세포의 형태를 관찰하였다. 그 결과, MELL 처리 농도가 증가할수록 A549의 세포 형태가 변화되며 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B). 이들 결과로부터 MELL은 A549의 세포 성장을 억제함을 알 수 있었다.
75%로 감소하였다. 따라서 본 결과는 MELL의 처리에 의해 A549 세포의 강력한 G1 arrest가 유도됨을 시사한다.
4A에서와 같이 MELL 농도의존적으로 CHK2의 발현이 감소되었으며, DNA damage에 의해 활성화되는 p-CHK2의 발현은 증가되었다. 또한 CDK를 탈인산화시켜 활성화시키고 G1/S 전환을 유도하는 Cdc25A phosphatase의 발현이 MELL 농도의존적으로 감소되었다. 반면 p53, p21 및 p27의 발현증가는 관찰되지 않았다(Fig.
또한 Fig. 2B에서 나타낸 바와 같이 각 주기별 실제 세포분포수를 확인한 결과, DMSO 대조군에서는 58.14%였던 G1기 세포분포는 MELL의 농도의존적으로 증가하여 최고 농도인 400 μg/ml에서는 84.57%의 A549 세포가 G1기에 정체되어 있음을 알 수 있었다.
5에서와 같이 DMSO을 처리한 대조군에 비해 MELL을 처리한 경우, A549 세포의 DNA에 damage가 일어나 genomic DNA band의 intensity가 control에 비해 60-70% 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 MELL에 의한 A549 세포의 DNA damage는 MELL의 농도가 증가할수록 더 많이 유발되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 MELL에 의해 A549세포의 DNA damage가 일어나고 그로 인해 CHK2의 인산화가 유도되어 G1 arrest가 유발되는 것이라 사료된다.
특히 CDK2, cyclin E의경우 mRNA 발현 또한 감소하여 전사단계에서의 발현 저해가 일어남을 뜻하며, CDK4, cyclin D1의 경우 mRNA 발현은 감소되지 않아 생성된 단백질의 안정성 조절 또는 ubiquitination 등 번역 후 조절에 의한 발현 저해일 것이라 사료된다. 또한 활성화된 CHK2인 p-CHK2의 발현은 증가되고 Cdc25A 의 발현은 감소하였으며(Fig. 4A), MELL 처리에 의해 A549세포의 DNA damage가 일어나는 것을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 결과들은 MELL 처리에 의해 DNA damage가 일어나 CHK2가 활성화되고, 활성화된 CHK2 kinase는 Cdc25A의 인산화를 유도하여 ubiquitin에 의한 Cdc25A의 분해를 유도하였음을 시사한다.
따라서 본 연구에서는 MELL에 의한 A549의 G1 arrest 유도의 분자생물학적 기전을 분석하기 위해 cyclin, CDK 등 checkpoint 단백질들과 CHK2, Cdc25A, p53, p21 등의 발현을 확인하였다. 예상대로 MELL 처리에 따라 농도의존적으로 cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4 등 G1/S 전환에 관련하는 단백질들의 발현이 감소하였다(Fig. 3). 특히 CDK2, cyclin E의경우 mRNA 발현 또한 감소하여 전사단계에서의 발현 저해가 일어남을 뜻하며, CDK4, cyclin D1의 경우 mRNA 발현은 감소되지 않아 생성된 단백질의 안정성 조절 또는 ubiquitination 등 번역 후 조절에 의한 발현 저해일 것이라 사료된다.
1B). 이들 결과로부터 MELL은 A549의 세포 성장을 억제함을 알 수 있었다.
5). 이러한 결과들은 MELL 처리에 의해 DNA damage가 일어나 CHK2가 활성화되고, 활성화된 CHK2 kinase는 Cdc25A의 인산화를 유도하여 ubiquitin에 의한 Cdc25A의 분해를 유도하였음을 시사한다. 반면 일반적인 항암활성의 기전 중 하나인 p53 pathway 관련 단백질들의 발현 변화를 알아본 결과, MELL 처리에 의해 p53, p21, p27 등의 발현이 증가되지 않았다(Fig.
1). 이러한 생존율 감소의 기전을 확인하기 위하여 세포주기 변화를 관찰하였으며 그 결과 MELL 농도의존적으로 G1 arrest가 일어나는 것을 알 수 있었다(Fig. 2).
또한 MELL에 의한 A549 세포의 DNA damage는 MELL의 농도가 증가할수록 더 많이 유발되는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 MELL에 의해 A549세포의 DNA damage가 일어나고 그로 인해 CHK2의 인산화가 유도되어 G1 arrest가 유발되는 것이라 사료된다.
4B). 이와 같은 결과로부터 MELL은 CHK2의 인산화를 유도하여 그 down signal인 Cdc25A phosphatase 발현을 저해하는 것을 알 수 있었으며, 그 결과 inactive form CDK의 탈인산화가 억제되어 CDK/cyclin complex가 저해되고 A549 세포의 G1 arrest가 유도되었을 것으로 사료된다. 또한 이러한 MELL 처리에 의한 G1 arrest는 일반적으로 관찰되는 p53 경로 관련 단백질들의 발현 증가가 관찰되지 않았으므로 p53 비의존적인 것이라 생각된다.
반면 CDK4 및 cyclin D1의 발현은 mRNA 레벨에서는 변화가 없었다. 이와 같은 결과로부터 MELL은 cyclin과 CDK의 발현 감소를 통하여 A549의 G1 arrest를 유도한다는 것을 알 수 있었다.
4B). 지금까지의 결과들을 종합하여 볼 때, MELL 처리에 의한 A549 세포의 G1 arrest는 p53 비의존적으로 유도되며, DNA damage에 의한 ATM/CHK2 pathway의 활성화에 따라 Cdc25A의 발현량이 줄어들고 그 결과 CDK/Cyclin complex의 불활성화가 일어나게 되어 최종적으로 G1 arrest가 유도된다고 사료된다. 이러한 p53 비의존적인 세포주기조절에 관하여서는 human melanoma cell에서 Interleukin-1 (IL-1)에 의해 p53-, p21- 비의존적인 G1 arrest가 일어난다는 연구 보고가 있으며 또한 p14^ARF가 genotoxic stress에 대해 p53 비의존 적으로 ATM/ATR/CHK pathway를 활성화시켜 G2 arrest를 일으킨다는 보고가 있으나, 그 정확한 기전에 관하여는 더욱 연구되어야 할 것이다[9, 24].
먼저 A549 세포에 MELL을 농도별로 24시간 처리하고, 이때 양성 대조군으로 A549 세포에 2 mM의 H₂O₂를 처리하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 1% agaroge gel 전기영동으로 확인한 결과, Fig. 5에서와 같이 DMSO을 처리한 대조군에 비해 MELL을 처리한 경우, A549 세포의 DNA에 damage가 일어나 genomic DNA band의 intensity가 control에 비해 60-70% 감소하는 것을 알 수 있었다. 또한 MELL에 의한 A549 세포의 DNA damage는 MELL의 농도가 증가할수록 더 많이 유발되는 것을 알 수 있었다.

후속연구

그러나 암세포에서는 이러한 세포주기 조절 기능이 제어되어 G1/S 또는 G2/M기의 비정상적인 진행에 따른 무한증식이 일어나는 것이 관찰된다[14]. 따라서 최근 암세포의 세포주기를 조절하는 약물에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이러한 연구는 새로운 항암제 개발에 도움이 될 것이다. 최근 연구결과에 따르면 imidazoacridinone 유도체에 의해 폐암세포의 p53, p21의 발현이 증가되고 G1 arrest가 유도된다는 보고가 있으며, 또한 창출(Rhizoma Atractylodis) 추출물이 폐암세포의 cyclin D의 발현을 감소시키고 G1 arrest를 유도한다는 보고가 있으나 그 정확한 분자 기전에 관하여서는 아직 연구가 미비하다[13, 29].
특히 폐암세포의 세포주기조절을 유발하는 약물에 관한 연구는 p53 및 p21의 발현유도에 의한 G1 arrest에 관한 연구결과가 대다수이므로, 본 연구 결과가 택란 추출물의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 해석하고 폐암세포의 세포주기 조절의 새로운 기전연구를 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다. 또한 본 연구결과를 바탕으로 하여 나아가 동물실험을 통한 실질적인 택란 추출물의 항암활성에 관한 연구도 지속되어야 할 것이다.
지금까지의 결과들을 종합하여 볼 때, MELL 처리에 의한 A549 세포의 G1 arrest는 p53 비의존적으로 유도되며, DNA damage에 의한 ATM/CHK2 pathway의 활성화에 따라 Cdc25A의 발현량이 줄어들고 그 결과 CDK/Cyclin complex의 불활성화가 일어나게 되어 최종적으로 G1 arrest가 유도된다고 사료된다. 이러한 p53 비의존적인 세포주기조절에 관하여서는 human melanoma cell에서 Interleukin-1 (IL-1)에 의해 p53-, p21- 비의존적인 G1 arrest가 일어난다는 연구 보고가 있으며 또한 p14^ARF가 genotoxic stress에 대해 p53 비의존 적으로 ATM/ATR/CHK pathway를 활성화시켜 G2 arrest를 일으킨다는 보고가 있으나, 그 정확한 기전에 관하여는 더욱 연구되어야 할 것이다[9, 24]. 특히 폐암세포의 세포주기조절을 유발하는 약물에 관한 연구는 p53 및 p21의 발현유도에 의한 G1 arrest에 관한 연구결과가 대다수이므로, 본 연구 결과가 택란 추출물의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 해석하고 폐암세포의 세포주기 조절의 새로운 기전연구를 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다.
이러한 p53 비의존적인 세포주기조절에 관하여서는 human melanoma cell에서 Interleukin-1 (IL-1)에 의해 p53-, p21- 비의존적인 G1 arrest가 일어난다는 연구 보고가 있으며 또한 p14^ARF가 genotoxic stress에 대해 p53 비의존 적으로 ATM/ATR/CHK pathway를 활성화시켜 G2 arrest를 일으킨다는 보고가 있으나, 그 정확한 기전에 관하여는 더욱 연구되어야 할 것이다[9, 24]. 특히 폐암세포의 세포주기조절을 유발하는 약물에 관한 연구는 p53 및 p21의 발현유도에 의한 G1 arrest에 관한 연구결과가 대다수이므로, 본 연구 결과가 택란 추출물의 세포주기 조절에 의한 항암기전을 해석하고 폐암세포의 세포주기 조절의 새로운 기전연구를 위한 중요한 기초자료가 될 것이라 사료된다. 또한 본 연구결과를 바탕으로 하여 나아가 동물실험을 통한 실질적인 택란 추출물의 항암활성에 관한 연구도 지속되어야 할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	고등 진핵세포의 세포주기는 어떻게 나뉘는가?	고등 진핵세포의 세포주기는 G1, S, G2, M기로 나뉘며 각 주기마다 다음 단계로의 진행에 관여하는 checkpoint가 있어서 이들 관련인자들의 상호작용을 통하여 세포주기가 조절된다. 정상세포는 DNA에 손상을 입었을 때 세포주기를 조절하여 손상된 DNA의 회복 경로를 거친다[16, 27, 39].
	고등 진핵세포의 세포주기는 어떻게 조절되는가?	고등 진핵세포의 세포주기는 G1, S, G2, M기로 나뉘며 각 주기마다 다음 단계로의 진행에 관여하는 checkpoint가 있어서 이들 관련인자들의 상호작용을 통하여 세포주기가 조절된다. 정상세포는 DNA에 손상을 입었을 때 세포주기를 조절하여 손상된 DNA의 회복 경로를 거친다[16, 27, 39].
	암세포의 세포주기는 어떻게 관찰되는가?	정상세포는 DNA에 손상을 입었을 때 세포주기를 조절하여 손상된 DNA의 회복 경로를 거친다[16, 27, 39]. 그러나 암세포에서는 이러한 세포주기 조절 기능이 제어되어 G1/S 또는 G2/M기의 비정상적인 진행에 따른 무한증식이 일어나는 것이 관찰된다[14]. 따라서 최근 암세포의 세포주기를 조절하는 약물에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며 이러한 연구는 새로운 항암제 개발에 도움이 될 것이다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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