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문제 정의
- 본 연구에서는 천연물로부터 tyrosinase 저해제 후보물질을 찾고자 천연물의 tyrosinase 저해 활성을 검색하였으며 검색 결과 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물이 유의성있는 저해 활성을 나타냄을 확인하였다. 이에 청미래덩굴의 잎으로부터 활성물질을 분리하고자 연구를 수행하였다.
- 본 연구에서는 천연물로부터 tyrosinase 저해제 후보물질을 찾고자 천연물의 tyrosinase 저해 활성을 검색하였으며 검색 결과 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물이 유의성있는 저해 활성을 나타냄을 확인하였다. 이에 청미래덩굴의 잎으로부터 활성물질을 분리하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- EtOAc분획(21.3 g)을 CH2Cl2-MeOH 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 12개의 소분획(SC-E1−SC-E12) 을 얻었다.
- Tyrosinase의 활성은 Eliza reader 측정기를 이용하여 495 nm에서 tyrosine이 dopachrome으로 변환되는 것을 측정함으로써 판단하였다. Kojic acid를 대조군으로 사용하였으며 tyrosinase 저해 활성은 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 상대적인 활성으로 나타내었다.
- Results are expressed as the mean ± S.D. of three independent experiments, each performed using triplicate wells.
- Results are expressed as the mean±S.D. of three independent experiments, each performed using triplicate wells.
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase 저해 활성은 tyrosine을 기질로 하여 mushroom tyrosinase를 이용하여 측정하였다.
- 다음 기질인 tyrosine을 가한 후 37℃에서 15분간 반응을 유도하였다. Tyrosinase의 활성은 Eliza reader 측정기를 이용하여 495 nm에서 tyrosine이 dopachrome으로 변환되는 것을 측정함으로써 판단하였다. Kojic acid를 대조군으로 사용하였으며 tyrosinase 저해 활성은 시료를 넣지 않은 대조군과 비교하여 상대적인 활성으로 나타내었다.
- 그 중, 소분획 SC-E7에 대하여 n-hexane-EtOAc 혼합용매를 이동상으로 하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 소분획(SC-E7-A−SC-E7-D)을 얻었다.
- 본 연구에서는 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 청미래덩굴 잎의 EtOAc 분획으로부터 성분분리를 수행하여 12종의 화합물을 분리 정제하였으며, 분리한 화합물의 구조는 다양한 분광학적 방법을 이용하여 4-hydroxybenzoic acid(1), 3,4- dihydroxybenzaldehyde(2), 3,4-dihydroxybenzoic acid(3), 3,4-dihydroxyacetophenone(4), 3-hydroxy-4-methoxy benzoic acid(5), trans-p-hydroxycinnamic acid(6), cis-p-hydroxycinnamic acid(7), trans-resveratrol(8), cis-resveratrol(9), dihydroresveratrol(10), moracin M(11) 및 kaempferol(12)로 동정하였다. 분리한 화합물 중 화합물 1-11는 이 식물에서 처음으로 분리보고되는 화합물이며 화합물 2, 4, 8, 9 및 12가 유의성있는 tyrosinase 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
- 이에 EtOAc 분획에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 성분분리를 시도하였으며 총 12종의 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 1D- 2D NMR 및 MS 등의 기기분석을 통하여 그 구조를 규명하였다.
- 소분획 SC-E7-B에 대하여 MeOH을 용매로 Sephadex LH20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 9개의 분획(SC-E7-B-1−SC-E7-B-9)으로 나누었다. 소분획 SC-E7-B-2에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 1, 2, 3, 4및 5를 얻었다. 또한 SC-E7-B-4 및 SC-E7-B-5 분획으로부터 각각 화합물 10 및 12를 얻었다.
- 소분획 SC-E7-B에 대하여 MeOH을 용매로 Sephadex LH20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 9개의 분획(SC-E7-B-1−SC-E7-B-9)으로 나누었다.
- 소분획 SC-E7-C에 대하여 MeOH을 용매로 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 시행하여 7개의 분획 (SC-E7-C-1−SC-E7-C-7)으로 나누었으며 SC-E7-C-4에 대하여 semi-preparative HPLC를 반복 수행하여 화합물 6, 7, 8, 9 및 11을 분리 정제 하였다.
- 3 g)을 얻었다. 이를 증류수 현탁한 후 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 로 용매 분획을 반복 실시하였으며, 각각 n-hexane 분획, CH2Cl2 분획, EtOAc 분획 및 n-BuOH 분획을 얻었다. 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성 검색한 결과 EtOAc 분획 및 BuOH 분획이 가장 뛰어난 저해활성을 나타내었다.
- 1). 이에 EtOAc 분획에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 성분분리를 시도하였으며 총 12종의 화합물을 분리, 정제하였다. 분리한 화합물은 1D- 2D NMR 및 MS 등의 기기분석을 통하여 그 구조를 규명하였다.
- 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성 검색한 결과 EtOAc 분획 및 BuOH 분획이 가장 뛰어난 저해활성을 나타내었다. 이에 EtOAc 분획으로부터 성분분리를 시도하였다. EtOAc분획(21.
- 천연물의 tyrosinase 저해 활성을 검색한 결과 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물이 유의성있는 저해 활성을 나타내 었으며 이에 활성성분의 분리를 시도하였다. 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하여 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 및 물 분획을 얻었으며 각각의 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성을 검색한 결과 EtOAc 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타내었다(Fig.
- 화합물 1-10 및 12는 문헌13-16)과 비교하여 4-hydroxybenzoic acid(1), 3,4-dihydroxybenzaldehyde(2), 3,4-dihydroxybenzoic acid(3), 3,4-dihydroxyacetophenone(4), 3-hydroxy4-methoxy benzoic acid(5), trans-p-hydroxycinnamic acid (6), cis-p-hydroxycinnamic acid(7), trans-resveratrol(8), cisresveratrol(9), dihydroresveratrol(10) 및 kaempferol(12)로 동정하였다(Fig. 2). 분리한 화합물 중 kaempferol(12)은 이 식물에서 보고되었으나12) 화합물 1-11은 이 식물에서 처음으로 분리 보고되는 화합물이다.
대상 데이터
- 실험재료 − 실험에 사용한 청미래덩굴 잎은 2011년 11월 충북 제천의 약초상에서 구입하여 충북대학교 약초원에서 감정을 받은 후 사용하였으며 표본(CBNU-201211-SC)은 충북대학교 약초원에 보관하고 있다.
데이터처리
- 통계분석 − 실험결과의 통계적인 유의성은 Student's t-test로 분석하였으며 p value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성있는 것으로 판단하였다.
성능/효과
- 13C-NMR에서 총 14개의 피크로부터 탄소수가 14개임을 추정하였다. 1H-NMR에서 예상한 2개의 aromatic ring에 해당하는 12개의 탄소 외에 추가 적으로 155.5 (C-2), 100.8 (C-3)의 존재를 확인하였으며 이를 바탕으로 화합물 11은 stilbenoid 계열의 유도체임을 추정하였다. 1H-NMR와 13C-NMR의 결과를 바탕으로 화합물 11은 stilbene 화합물이 환을 형성하고 있음을 예상할 수 있었으며 이상의 spectrum data의 결과를 종합하여 문헌17)과 비교 검토하여 moracin M으로 동정하였다.
- 8 (C-3)의 존재를 확인하였으며 이를 바탕으로 화합물 11은 stilbenoid 계열의 유도체임을 추정하였다. 1H-NMR와 13C-NMR의 결과를 바탕으로 화합물 11은 stilbene 화합물이 환을 형성하고 있음을 예상할 수 있었으며 이상의 spectrum data의 결과를 종합하여 문헌17)과 비교 검토하여 moracin M으로 동정하였다. 이 화합물은 이 식물에서 처음 분리, 보고되는 물질이다.
- 또한 화합물 11의 경우 화합물 9의 구조에 환을 형성한 구조인데 활성이 현저히 감소하여 stilbenoid계열 화합물의 경우 이중결합의 존재가 저해활성에 필요함을 유추할 수 있다. Flavonoid 계열의 화합물인 화합물 12는 청미래 덩굴 잎으로부터 분리된 12개의 화합물 중 가장 뛰어난 활성을 나타내었다. 화합물 12인 kaempferol는 tyrosinase의 저해제로 잘 알려진 물질이며17) 본 연구에서도 뛰어난 활성을 나타냄을 다시 확인하였다.
- 청미래덩굴 잎으로부터 분리한 화합물 12종은 모두 페놀성 계열의 화합물로 좀 더 구조적으로 구분하면 화합물 1-5는 simple phenol성 화합물, 화합물 6-7은 phenylpropanoid 계열 화합물, 화합물 8-11은 stilbenoid 계열 화합물 그리고 화합물 12는 flavonoid 계열의 화합물이다. 분리한 물질에 대하여 tyrosinase 저해 활성을 측정한 결과 계열별로 활성의 차이를 나타내기 보다는 동일한 계열 중에서도 특정 구조만이 활성을 나타내었다(Fig. 3). Simple phenol성 계열의 물질인 화합물 1-5의 경우 화합물 2가 가장 강한 활성을 나타내었고 화합물 4도 유의성있는 활성을 나타낸 반면 화합물 1, 3, 5는 활성이 미약하였다.
- 본 연구에서는 tyrosinase 저해 활성을 나타낸 청미래덩굴 잎의 EtOAc 분획으로부터 성분분리를 수행하여 12종의 화합물을 분리 정제하였으며, 분리한 화합물의 구조는 다양한 분광학적 방법을 이용하여 4-hydroxybenzoic acid(1), 3,4- dihydroxybenzaldehyde(2), 3,4-dihydroxybenzoic acid(3), 3,4-dihydroxyacetophenone(4), 3-hydroxy-4-methoxy benzoic acid(5), trans-p-hydroxycinnamic acid(6), cis-p-hydroxycinnamic acid(7), trans-resveratrol(8), cis-resveratrol(9), dihydroresveratrol(10), moracin M(11) 및 kaempferol(12)로 동정하였다. 분리한 화합물 중 화합물 1-11는 이 식물에서 처음으로 분리보고되는 화합물이며 화합물 2, 4, 8, 9 및 12가 유의성있는 tyrosinase 저해활성을 나타냄을 확인하였다.
- 이를 증류수 현탁한 후 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 로 용매 분획을 반복 실시하였으며, 각각 n-hexane 분획, CH2Cl2 분획, EtOAc 분획 및 n-BuOH 분획을 얻었다. 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성 검색한 결과 EtOAc 분획 및 BuOH 분획이 가장 뛰어난 저해활성을 나타내었다. 이에 EtOAc 분획으로부터 성분분리를 시도하였다.
- 이상의 결과로 청미래덩굴 잎으로부터 총 12개의 화합물을 분리하여 그 구조를 동정하였고 tyrosinase의 저해활성을 나타내었다. 청미래덩굴 잎은 민간에서 항균작용으로 망개떡 등에 사용되어 왔으며 tyrosinase 저해 활성은 곤충의 증식 억제에 기여하는 것으로 추정된다.
- 천연물의 tyrosinase 저해 활성을 검색한 결과 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물이 유의성있는 저해 활성을 나타내 었으며 이에 활성성분의 분리를 시도하였다. 청미래덩굴 잎의 총 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 분획하여 n-hexane, CHCl3, EtOAc, n-BuOH 및 물 분획을 얻었으며 각각의 분획에 대하여 tyrosinase 저해활성을 검색한 결과 EtOAc 분획이 가장 뛰어난 활성을 나타내었다(Fig. 1). 이에 EtOAc 분획에 대하여 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 성분분리를 시도하였으며 총 12종의 화합물을 분리, 정제하였다.
- 화합물 6, 7은 phenylpropanoid 계열의 화합물이며 두 화합물 모두 미약한 활성을 나타내었다. 화합물 6, 7은 carboxyl기를 가지고 있으며 활성이 미약 하여 simple phenol성 화합물의 구조-활성 상관관계에서 유추한 결과와 일치함을 다시 확인할 수 있었다. 화합물 8-11은 stilbenoid 계열의 화합물로 화합물 8은 trans의 이중결합을, 화합물 9는 cis의 이중결합을, 화합물 10은 이중결합이 단일결합으로 치환된 동일한 구조의 화합물이다.
- Tyrosinase의 활성에 adehyde기의 존재는 활성의 증가를, methylation은 활성의 감소를 나타낸다는 연구결과가 보고되어 있으며8) 본 연구결과 simple phenol성 화합물의 결과에서도 동일한 구조-활성 상관관계를 나타냄을 확인하였다. 화합물 6, 7은 phenylpropanoid 계열의 화합물이며 두 화합물 모두 미약한 활성을 나타내었다. 화합물 6, 7은 carboxyl기를 가지고 있으며 활성이 미약 하여 simple phenol성 화합물의 구조-활성 상관관계에서 유추한 결과와 일치함을 다시 확인할 수 있었다.
후속연구
- 청미래덩굴의 경우 뿌리줄기가 토복령으로 사용되고 있으며 잎의 경우 그 효능 및 응용이 많이 개발되어 있지 않은 실정이다. 본 연구를 통하여 청미래덩굴 잎은 tyrosinase 저해활성을 나타냄을 확인하였으며 따라서 청미래덩굴 잎은 농업, 의약품, 화장품 등 다양한 분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
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